在区域)组成完整的表面增强拉曼散射免疫试纸条。
[0065](5)样品前处理:取1.0g大便样品，加入5mL的pH7.4的磷酸缓冲液，15min后离心，取上清，并且用所制备的SERS免疫层析试纸条检测。
[0066](6)配制浓度分别为 10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0.15625ng/ml的血红蛋白标准品(用0.01M，PH7.2的PBS溶解得到)滴加到加样孔中后，用便携式拉曼光谱仪检测检测线上拉曼信号的强度，其中拉曼光谱仪的激发波长为785nm，功率为60mW，检测时间为20s。以血红蛋白的浓度为横坐标，拉曼信号强度为纵坐标，绘制标准曲线。本实验的灵敏度为15.6ng/ml。
[0067](7)结果观察:阳性结果为检测线上的拉曼信号强度高于500a.u，阴性结果为检测线上的拉曼信号强度低于500a.Uo
[0068]本发明检测血红蛋白的灵敏度为32ng/mL，Cd2+的灵敏度为0.5ng/mL ;目前尚无血红蛋白和Cd2+的拉曼试纸条报道，而用已建立的胶体金试纸条检测的灵敏度分别是1000ng/mL和25ng/mL，本发明建立的拉曼试纸条敏感度比传统金标试纸条敏感约31和50倍。
[0069]比较实施例
[0070](1)制备金核银壳纳米球:100mL超纯水加热到沸腾后，再加入2mL浓度为质量百分比1%的氯金酸和4mL浓度为质量百分比1%的柠檬酸三钠溶液，之后100°C加热搅拌15min，液体溶液变为红色，说明金纳米球制备成功。取10mL所制备的金纳米球，再加入30 μ L lOOmM 抗坏血酸，40 yL lOOmM AgN03 以及 30yL lOOmM NaOH，搅拌反应 30min 后，纳米溶胶变为橙黄色，说明金核银壳纳米球制备成功。
[0071](2)制备银纳米球:500mL三蒸水加热到沸腾后加入90mg AgNO# 10mL浓度为质量百分比1%的柠檬酸三钠，100°C加热搅拌lh后，溶胶变为黄色，说明银纳米球制备成功。
[0072](3)对实施例1制备的金核银壳纳米花以及本比较实施例制备的金核银壳纳米球、银纳米球检测拉曼信号强度
[0073]本发明制备的金核银壳纳米花增强的拉曼报告分子4MBA的拉曼信号强度在1077cm 1的拉曼信号为34500a.u,对比金核银壳纳米球增强4MBA的拉曼信号强度为4800a.u，直接以银纳米球增强4MBA的拉曼信号强度为2500a.u，本发明制备的金核银壳纳米花基底对拉曼探针的增强效果约是金核银壳纳米球和银纳米球的7倍和14倍。
[0074]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于:包含底衬、样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中，结合垫上附着金核银壳纳米花标记的抗体I;层析膜上设置检测线；检测线上附着有抗体II或者抗原A ; 所述的金核银壳纳米花标记的抗体I通过如下方法制备得到:将金核银壳纳米花与抗体I混合，搅拌均匀；再加入牛血清白蛋白封闭得到； 所述的金核银壳纳米花的制备过程如下: (1)金纳米花的制备:0.2mL浓度为25mM的氯金酸加入到10mL 20mM、pH 7.4的HEPES溶液中后，静止反应30min，得到金纳米花； (2)金核银壳纳米花的制备:40μ L浓度为0.1Μ的NaOH溶液和30 μ L浓度为0.1Μ的抗坏血酸加入到lmL步骤⑴制备的金纳米花中，搅拌后加入400 μ L浓度为10mM的AgN03溶液，反应半小时，得到金核银壳纳米花。2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于:所述的金核银壳纳米花标记的抗体I通过如下步骤制备得到: (1)金纳米花的制备:0.2mL浓度为25mM的氯金酸加入到10mL 20mM、pH 7.4的HEPES溶液中后，静止反应30min，得到金纳米花； (2)金核银壳纳米花的制备:40μ L浓度为0.1Μ的NaOH溶液和30 μ L浓度为0.1Μ的抗坏血酸加入到lmL步骤⑴制备的金纳米花中，搅拌后加入400 μ L浓度为10mM的AgN03溶液，反应半小时，得到金核银壳纳米花； (3)金核银壳纳米花标记的抗体I的制备:0.2 μ L浓度为20mM的4-巯基苯甲酸加入至IJlmL步骤⑵制备得到的金核银壳纳米花中，室温静置1小时后加入3yL浓度为lmg/mL的单克隆抗体I和15 μ L浓度为lmg/mL的聚乙烯吡咯烷酮(PVP);室温反应30min后，再加入100 μ L浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白；室温反应30min后，离心，去上清，再用lmL浓度为12mM的磷酸缓冲液重新分散，得到金核银壳纳米花标记的抗体I。3.根据权利要求2所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于: 步骤⑶中所述的室温为20?30°C ; 步骤(3)中所述的离心的条件为7000rpm离心10分钟。4.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于:还包含塑料外壳，塑料外壳包裹底衬和附着在底衬且依次紧密连接样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，塑料外壳上设置有加样孔和观察孔，加样孔位于样品吸收垫的位置，观察孔位于检测线。5.根据权利要求1?4任一项所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于: 所述的底衬的材质为聚氯乙烯； 所述的样品吸收垫的材质为玻璃纤维； 所述的结合垫的材质为聚酯膜或者玻璃纤维素膜； 所述的层析膜的材质为硝酸纤维素膜； 所述的吸水垫的材质为吸水纸。6.根据权利要求1?4任一项所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条，其特征在于: 所述的抗原A为完全抗原Cd2+-1EDTA-BSA或血红蛋白； 所述的抗体I为抗Cd2+-EDTA抗体； 所述的抗体II为抗血红蛋白抗体。7.权利要求1?6任一项所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包含以下步骤: (A)将金核银壳纳米花标记的抗体I分散在结合垫上； (B)将抗原A或者抗体II呈直线型附着在层析膜上，形成检测线； (C)在底衬上将样品吸收垫、步骤(1)得到的结合垫、步骤(2)得到的层析膜和吸水垫依次相互搭接；得到表面增强拉曼散射免疫层析试纸条。8.根据权利要求7所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于: 步骤㈧为:用喷金划膜仪将金核银壳纳米花标记的抗体I喷到结合垫上； 步骤(B)中所述的抗原A或者抗体II通过喷金划膜仪包裹到层析膜上。9.权利要求1?6任一项所述的表面增强拉曼散射免疫层析试纸条在检测领域中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种表面增强拉曼散射免疫层析试纸条及制备方法与应用。该试纸条包含底衬、样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中，结合垫上附着金核银壳纳米花标记的抗体I；层析膜上设置检测线；检测线上附着有抗体II或者抗原A。本发明通过将金核银壳纳米花标记的抗体I分散在结合垫上，将抗原A或者抗体II呈直线型附着在层析膜上，形成检测线；在底衬上将样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次相互搭接；得到表面增强拉曼散射免疫层析试纸条。本发明具有操作安全、简便、低成本、快速、灵敏度高等优点，应用范围广。
【IPC分类】G01N21/65, G01N33/53
【公开号】CN105259158
【申请号】CN201510783487
【发明人】唐勇, 付强强, 吴泽
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日...