一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法
【技术领域】
[0001]本发明属蛋白质分析领域，涉及一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的新方法。本发明方法能显著地提高糖基化肽的分析质谱选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了蛋白质糖基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰，执行着重要的生物学功能。糖基化修饰在各种生命现象中都起着重要的作用，如参与细胞黏附及信号转导，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。据研究报道，生物体内约有1/2以上的蛋白质会发生糖基化，高灵敏地鉴定生物体内的糖基化后修饰位点是实现其进一步研究的首要前提，然而，它们的研究都面临着类似的困难，首先，糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度却通常较低，并且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有2-5%左右的肽段带有糖基化修饰；第二，带有糖基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率往往比非修饰肽段低，因而不易被质谱鉴定；第三，糖链本身的微观不均一性导致糖肽在质谱中的信号分散和减弱，更加难以被质谱高灵敏鉴定；第四，尽管目前已有基于肼腙反应糖基化肽固相富集方法，但所述的富集方法存在有如下缺陷:通常耗时较长，富集时间至少12小时以上，并且肼基团大多固定于树酯载体上，捕获糖肽后从溶液中的分离十分不易等等。因此，本申请的发明人拟提供一种反应更加特异和更加方便固液的分离的糖基化肽的固相富集方法，该方法将有利于实现高选择性和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质的研究。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效，实现糖基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的新方法。
[0004]本发明提供了一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的方法。本发明利用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe304@0NH2上的氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间的反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上，而非糖肽则被清洗除去，最后再利用去糖链酶将糖肽从材料上解离下来，从而实现磷酸化肽段的选择性富集并质谱分析。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0006]1.对肽段样品进行Na104氧化；
[0007]2.对其中的糖基化肽段进行富集；
[0008]3.将糖基化肽从磁性纳米材上洗脱下来送入质谱分析。
[0009]具体的，本发明的一种固相富集糖基化肽段并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe304@0NH2为吸附剂，实现糖基化肽的选择性富集；其包括步骤:
[0010](1)对多肽样品进行高碘酸钠氧化，使糖肽上糖链中的羟基氧化成为醛基；
[0011 ] (2)加入Fe304@0NH2材料与多肽溶液充分混合；
[0012](3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；
[0013](4)用缓冲液清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开,收集材料；
[0014](5)用碳酸氢铵缓冲液重新混匀材料，并在其中加入去糖链酶PNGaseF充分混合；
[0015](6)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。
[0016]更具体的，本发明的方法中，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe304@0NH2为吸附剂，利用材料上的氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间的反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上，经外加磁场作用使得磁性材料与溶液分离，最终实现糖基化肽的富集和质谱分析；
[0017]所述步骤⑴中，在多肽样品中，加入10mM的他104与多肽的溶液在25 — 37摄氏度下避光混合1小时，使样品中的糖基化肽充分被氧化；再加入20mM Na2S03混合lOmin终止氧化反应；最后冻干肽段备用；
[0018]所述步骤⑵中，在上述多肽样品中加入10mM乙酸铵作为缓冲液，使肽段浓度保持在10ng/ μ L-1000ng/ μ L ;再加入Fe304@0NH2磁性纳米粒子，使纳米粒子浓度保持为lmg/mL-10mg/mL ;二者在 45°C _60°C反应 1-4 小时；
[0019]所述步骤(3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；
[0020]所述步骤⑷中，对步骤⑶中得到的下层固体相，用纯水，80%乙腈的水溶液，甲醇和50mMNH4HC03清洗材料各1次，每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；[0021 ] 所述步骤(5)中，将⑷中收集的材料中用50mMNH4HC03重新混匀材料，加入去糖链酶PNGaseF将糖肽从材料上解离下来，保持去糖链酶的量为每毫克多肽中加入PNGaseF0.5-1 μ L，加入后在 37°C反应 12-16 小时；
[0022]所述步骤￠)中，外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质含有ct-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)混合，进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱MALD1-TOF-MS 分析；
[0023]本发明的一个实施例中，所述步骤(1)中的多肽样品浓度为lOng/μ L?lOOOng/μ L，溶于10mM乙酸铵CH3C00NH4缓冲液中；多肽样品被10mM的高碘酸钠Na104避光氧化1小时，然后加入终浓度为20mM的亚硫酸钠Na2S03混合10分钟以终止氧化反应；
[0024]本发明的一个实施例中，所述步骤(2)中的磁性纳米材料表面被氨氧基修饰；其中加入的Fe304@0NH2材料浓度为lmg/mL-lOmg/mL ;氨氧基修饰磁性纳米材料进行样品富集的温度是45-60摄氏度，样品富集的时间是1-4小时；
[0025]本发明的一个实施例中，所述的步骤⑷中用50yL — lmL纯水，80%乙腈水溶液，甲醇和50mM碳酸氢铵NH4HC03水溶液顺序清洗材料各1次；
[0026]本发明的一个实施例中，所述的步骤(5)中用50 μ L-lmL50mMNH4HC03水溶液重新混匀材料，按每毫克多肽中加入0.5-1 μ L去糖链酶PNGaseF并保持在37摄氏度混合12-16小时。
[0027]本发明方法中，由于氨氧基和醛基之间的反应特异性高、速度快，能显著地提高糖基化肽的分析质谱选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。
【附图说明】
[0028]图1为本富集方法的流程图。
[0029]图2为100ng/yL标准糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段的MALD1-TOF-MS谱图，MALD1-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度Intensity)，横坐标为质荷比(m/z) ；(a)是富集前，(b)从体积为100 μ L的样品溶液富集后得到的，上样量和富集前相同；*为非糖基化肽段的单电荷峰，#为糖基化肽，@为去糖链后的糖基化肽，'为去糖链后糖基化肽的碎片；对比图(a)和图(b)可以看出，经过富集后，糖基化肽可以被选择性的富集下来。
[0030]图3为摩尔比为1:100的糖基化蛋白质去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段和标准非糖蛋白质马心肌红蛋白Myo的酶解肽段的MALD1-TOF-MS谱图，MALD1-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100% Intensity),横坐标为质荷比(m/z) ； (a)是未富集得到的；(b)是经糖基化肽富集后得到的；*为非糖基化肽段的单电荷峰，#为糖基化肽，@为去糖链后