一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及电化学用电极的制备领域，具体指一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途。
【背景技术】
[0002]转基因作物(Genetically Modified Crops，简称GMC)是指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的目的基因插入植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物。自1994年转基因番茄在美国的首次商业化以来，生物技术已被广泛用于现代农业。目前全球批准商业化种植的转基因生物已有100多种，种植转基因作物的国家有29个，转基因作物的种植面积也由1996年的170万hm2增加至2011年的16000万hm2。很多国家根据将已批准的部分转基因作物作为食品或饲料的生产原料，与此同时转基因产品的安全性受到了广泛关注。
[0003]目前转基因检测方法主要是基于外源蛋白靶标的检测和基于核酸的检测。以外源蛋白为靶标的检测方法是基于抗体对抗原的特异性识别，主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，但是这些方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于核酸的检测方法最常用的是聚合酶链式反应(PCR)是最常用的转基因检测方法，但样品需要量大，操作繁琐，耗时，结果的准确性易受假阳性和假阴性的影响。
[0004]石墨烯具有更高的机械强度，更大的比表面积以及更低廉的制备成本，这些特点使得石墨烯成为了新的优良载体，而纳米金(Au NPs)和石墨烯形成的复合材料，不只拥有原本优异性能，如大的比表面积、出色的导电性、催化性，以及优良的化学稳定性等，而且两组分之间还存在着协同作用，因此极大地改善了复合材料的性能也使得石墨烯/金纳米粒子复合物在催化、生物传感器、光谱学、能量存储等领域展现出许多优异的性能和潜在的应用价值。
[0005]碲化镉量子点(CdTe QDs)是一种半导体纳米材料，通过调节粒径，可以得到从整个可见光波段到紫外光波段的禁带宽度，具有大的载流子移动率，高的光吸收特性和热稳定性等，在紫外光或电子激发下能产生高效的发光。在光电性质方面，不仅具有良好的发光性能，而且还是好的电子受体材料，因而在电致发光器件和光电电池器件方面都得到广泛的研究和应用。
[0006]二氧化硅纳米球具有小尺寸、水溶性良好、比表面积大、生物相容性好、无毒且能和多种生物分子偶联等优点，是量子点的理想载体。
[0007]光致电化学传感器是一种以光能作为激发能量，电信号作为检测信号的传感器。
[0008]本发明以碲化镉包覆的硅球(Si02@CdTe)为光电信号标志物。首先将ΙΤ0电极表面依次修饰上石墨烯/金(rGO/Au NPs)、DNA探针1 (Probe 1)、目标DNA (T-DNA)、DNA探针2(Probe2)_碲化镉包覆的硅球(Si02@CdTe)，构建的光电化学传感器大大提高了灵敏度。该检测体系以ΙΤ0为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，以光电流为检测信号，通过对不同浓度的目标DNA检测，建立标准曲线，以达到对作物及产品定量检测的目的。
【发明内容】
[0009]本发明旨在发明一种集免标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的光电化学传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测含有CaMV35S启动子转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。
[0010]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0011]步骤1、还原氧化石墨稀/金纳米复合材料RGO/Au的制备步骤；
[0012]步骤2、二氧化娃纳米微球@碲化镉纳米复合材料Si02@CdTe的制备步骤；
[0013]步骤3、在ΙΤ0电极上制备探针1 (Probel)的步骤:将RGO/Au分散于蒸馏水中得到RGO/Au分散液后滴涂于ΙΤ0电极表面的修饰区，进行干燥；取溶有探针1的tris-HCl缓冲液滴涂于所述干燥后的RGO/Au表面，进行干燥；冲洗电极表面后，进行干燥，得到ITO-rGO/Au-Probel ；
[0014]步骤4、向探针1修饰目标DNA CaMV35S启动子的步骤:取溶有目标DNA CaMV35S启动子的tris-HCl缓冲液滴涂于所述ITO-rGO/Au-Probel的表面，室温孵育，待干燥后冲洗电极，得到 IT0-rG0/Au-Probel-t-DNA ；
[0015]步骤5、向目标DNA CaMV35S启动子修饰探针2的步骤:将Si02@CdTe的蒸馏水分散液和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入到乙基-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中进行反应，反应结束后，离心并洗涤得到固体A，将所得固体A加入到溶有探针2的tris-HCl缓冲液中，得到混合液A，振荡反应一段时间后，得到固体产物Probe2/Si02iCdTe ;将Probe2/Si02iCdTe分散于蒸馏水中后，得到混合液B，将混合液B滴涂于所述IT0-rG0/Au-Probel-t-DNA表面，孵育，待干燥后冲洗电极表面，得到IT0_rG0/Au-Probel-t-DNA-Probe2/Si02iCdTeo
[0016]步骤3中，RGO/Au分散液的浓度为1?4mg/mL，滴涂于ΙΤ0表面的RGO/Au分散液的量为20 μ L ;溶有Probel的tris-HCl缓冲液用量为10 μ L，探针1的浓度为4 μ Μ。
[0017]步骤4中，溶有目标DNA CaMV35S启动子的tris-HCl缓冲液用量为20 μ L，目标DNA的浓度为0.05ρΜ?ΙΟΟρΜ。
[0018]步骤5中，所用的Si02@CdTe的蒸馏水分散液、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液、乙基-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液的体积比25:1:1 ;所用的Si02@CdTe的蒸馏水分散液的浓度为lmg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液的浓度为0.2M，乙基_(3_ 二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液的浓度为0.4M ;混合液A中，所用的溶有探针2的tris-HCl缓冲液中探针2的浓度为10 μ Μ，且混合液Α中，每100 μ L tris-HCl缓冲液中含有 lmg Si02iCdTe ;混合液 B 中，Probe2/Si02@CdTe 的浓度为 4 μΜ。
[0019]所有的电极冲洗方法均为用ΡΗ7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，所有的tris-HCl缓冲液pH均为7.4，浓度均为4.5mM。
[0020]在进行向目标DNA (t-DNA)修饰探针2 (Probe2)前，先取新鲜配置的0.0lmM 6-巯基己醇20 μ L，滴加在IT0-rG0/Au-Probel-t-DNA表面，用以封闭rGO/Au上多余的活性位点，2小时后用，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的6-巯基己醇。
[0021]Si02iCdTe的制备方法为:选取硅球加入到邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)中，搅拌反应，搅拌反应完毕进行离心、洗涤后，取沉淀加入到CdTe的蒸馏水分散液中，搅拌反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到产物，备用。
[0022]所用的探针1 (Probel)序列为 5’ HS-G GCC ATC GTT GAA 3’ ；CaMV35S (t-DNA)序列为 5’ GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C 3’；探针 2 (Probe2)序列为 5’ GAT GCC TCTGCC-NH23，。
[0023]以所制备的电极作为传感器，用于光电化学检测CaMV35S启动子，其检测步骤如下:
[0024](1)将所制备的含有不同浓度目标DNA的ΙΤ0电极置于PH7.0PBS缓冲液中，使用三电极体系，进行电化学检测。
[0025]所述三电极体系:饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，ΙΤ0为工作电极；
[0026](2)扫描电压范围从-0.5V?0V，电势跃阶为4mV，频率25Hz，振幅25mV ；
[0027](3)光电检测采用i_t测试手段，偏压设置为0V ;每隔20s进行开关灯，记录开关灯前后电流的变化值，根据不同浓度的t-DNA产生的不同大小的光电流值，绘制工作标准曲线；
[0028](4)将待测样品溶液代替t-DNA溶液，按照所述工作曲线绘制的方法进行检测。
[0029]CaMV35S检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的CaMV35S进行反应，并扫得其光电流信号图谱，根据不同浓度下光电流制得的标准曲线。
[0030]本发明的有益效果为:
[0031 ] (1)本发明通过CaMV35S作为目标DNA和双探针特异性互补配对原则，特异性识别CaMV35S转基因，可对转基因作物及其产品进行检测，大大降低了假阴性和假阳性出现的概率。
[0032](2)本发明通过二氧化娃纳米微球表面包覆CdTe，使单个Probe2上可连接N个CdTe，从而进行信号放大。
[0033](3)本发明通过rGO/Au NPs和Si02@CdTe两端双重信号放大，实现了对转基因CaMV35S启动子的灵敏检测，在0.1?ΙΟΟρΜ的浓度区间内，CaMV35S浓度与光电流呈现良好的线性关系，检出限可达0.017pMo
【附图说明】
[0034]图1为实施例4中检测不同浓度CaMV35S所得到的光电流响应图，其中a为0.05pM、b 为 0.0lpM、c 为 0.5pM、d 为 lpM、e 为 10pM、f 为 50pM、g 为 ΙΟΟρΜ ；
[0035]图2为实施例3和实施例7中的实验对比图，其中a为实施例3中的空白电极的光电流响应，