缓冲液，pH为2.2-8.0、e)磷酸氢 盐-柠檬酸盐缓冲液，pH为2.2-8.0、f)磷酸盐缓冲液，pH为4.9-8.2、g)柠檬酸-氢氧化钠-盐 酸缓冲液，pH为2.2-6.5、h) Tr i s-盐酸缓冲液，pH为7.1-8.9、i)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 为8.6-10.6和j)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为9.16-10.83。
[0026]上述的检测试剂盒中，所述酶活稳定剂可为MgS04、MgCl2、乙二胺四乙酸二钠、乙二 胺四乙酸二钾、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、甘油和二甲基亚砜中至少一种。 [0027]上述的检测试剂盒中，所述终止液可为高氯酸、盐酸、硫酸、硝酸和三氯乙酸中至 少一种的水溶液。
[0028] 上述的检测试剂盒中，所述中和液可为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾和 氢氧化钙中至少一种的水溶液。
[0029] 利用本发明提供的试剂盒检测生物素酶酶活性时，可按照下述方法进行：
[0030] 1)将样本加入至所述试剂1中进行反应；反应结束后加入所述试剂2进行终止反 应;将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入所述试剂3进行中和至pH值 为7~11;向所述中和后的体系中加入所述试剂4进行衍生反应;检测所述衍生反应后的体 系在激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的焚光值；
[0031] 2)将经灭活处理后的样本加入至所述试剂1中进行反应;反应结束后加入所述试 剂2进行终止反应;将所述反应后的体系进行离心分离，向得到的上清液中加入所述试剂3 进行中和至pH值为7~11;向所述中和后的体系中加入所述试剂4进行衍生反应;检测所述 衍生反应后的体系在激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的荧光值，作为空白对 照的荧光值；
[0032]所述反应与步骤1)中所述反应的条件相同；
[0033] 所述终止反应与步骤1)中所述终止反应的条件相同；
[0034] 所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；
[0035] 3)将至少8种不同浓度的赖氨酸标准品分别与所述试剂4进行所述衍生反应，并检 测所述衍生反应后的体系在激发波长300~500nm和发射波长400~600nm下的荧光值；以赖 氨酸的浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，制作标准曲线；
[0036] 所述衍生反应与步骤1)中所述衍生反应的条件相同；
[0037] 4)根据步骤1)中所检测的荧光值与步骤2)中作为空白对照的荧光值的差值和所 述标准曲线，即得到步骤1)中进行所述衍生反应的赖氨酸的浓度，进而得到所述样本中生 物素酶的酶活性；
[0038] 所述酶活性的单位定义为：以每L样本每小时水解所述生物胞素生成的赖氨酸的 微摩尔数，表示为ymol/L/h。
[0039] 上述的检测方法中，步骤1)和步骤2)中，所述反应的温度可为4~60°C，时间可为 0.5~48小时，如在37°C的条件下反应24小时。
[0040] 上述的检测方法中，步骤1)和步骤2)中，所述终止反应步骤中，所述试剂2与所述 试剂1体积比为1:20;
[0041 ] 所述中和步骤中，所述上清液与所述试剂3的体积比可为0.5~3:1，具体可为2:1;
[0042]所述衍生反应步骤中，所述上清液与所述试剂4的体积比可为0.5~2:1，具体可为 1:1;所述衍生反应的温度可为4~60°C，时间可为0.2~2小时，如在30°C的条件下反应0.5 小时。
[0043]上述的检测方法中，步骤2)中，所述灭活处理的方法为煮沸灭活或高温灭活;所述 高温灭活的温度不低于80°C。
[0044] 步骤3)中，所述赖氨酸标准品浓度可为0~150μπιο 1 /L，如0、7 · 5、15、30、60、90、120 和150ymol/L。
[0045] 本发明提供的试剂盒可用于辅助诊断生物素酶缺乏症。
[0046] 本发明提供的试剂盒可直接用于检测干血片样本，可通过将血液滴在吸附材料 上，并经过干燥后获得。所用的吸附材料包括但不限于滤纸等吸水性材料(常用的如903#滤 纸）；干燥可在室温干燥4~16h，也可通过其它干燥设备干燥一段时间实现。
[0047] 利用本发明试剂盒进行检测时，所使用的干血片样本中生物素酶酶活性在室温条 件下可以稳定数月时间，在低温条件下(如_20°C)可以稳定数年时间，因此有利于样本的保 存、运输及生物素酶缺乏症的筛查。
[0048] 本发明提供的试剂盒还可以用于分析和检测源自人体或动物的各类标本(包括各 种体液、细胞或组织及其所制成的干片）中的生物素酶酶活力，如可用于血浆、血清、白细 胞、培养细胞及其制备的干片等，适用标本范围广。
[0049] 本发明提供的试剂盒中的底物为生物胞素(Bi〇cytin，N-d-生物素基-L-赖氨酸）， 其通用结构式如式I:
[0050]
[0051] 它是生物素酶的天然底物，与其它底物相比，该底物具有更小的Km值，以天然底物 生物胞素为反应底物时，酶活性较人工底物高30±5%，因此具有较高的检测灵敏度及更宽 的检测限。
[0052]利用本发明试剂盒进行生物素酶酶活性检测的检测原理如下述反应方程式所示： [0053]牛物跑累+ HO -生物素..丨..赖氨酸 [0054]赖氨酸+衍生试剂-赖氨酸衍生物
[0055] 样本中的生物素酶在适当的缓冲体系中能够水解生物胞素，生成赖氨酸，在合适 的温度(4~60°C)下反应一段时间（0.5~48h)后，反应体系中加入终止液使反应终止，离心 后取上清液，反应过程中生成的赖氨酸再与衍生化试剂反应生成荧光产物即赖氨酸衍生 物，在特定的激发和发射波长下可检测到赖氨酸衍生物特异的荧光。由于生成的赖氨酸量 与生成的荧光产物的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的赖氨酸衍 生物荧光值，扣除空白对照值后，通过以赖氨酸标准品与衍生试剂反应制备的标准曲线，就 可以计算出反应中赖氨酸的生成量。
[0056] 使用本发明提供的检测试剂盒进行检测时，无需对样本进行任何形式的前期处 理，例如可直接用打孔器在干血片上取下直径3mm的小片加入反应体系中即可检测生物素 酶活性，无需提取出生物素酶。而采用如血浆等其它标本时，也无需对标本进行透析、超滤、 层析等纯化处理，可直接用于酶活力检测，方便快捷。
[0057] 使用本发明提供的检测试剂盒进行检测时，可以获得干血片中生物素酶活性的定 量结果，因此可以用于分析、检测和诊断生物素酶的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由 生物素酶的酶活力异常或临床症状类似的各种遗传和代谢疾病，如生物素酶缺乏症，鉴别 生物素缺乏症、羧化全酶合成酶缺乏症等。
[0058]总之，使用本发明提供的检测试剂盒进行检测，与Ebrahim等建立的方法(Ebrahim 法)相比，具有如下优势：首先，利用本发明试剂盒进行检测时，可以干血片为检测样本，这 使得本方法可应用于新生儿筛查，满足生物素酶缺乏症需及时诊治的要求，易于推广使用。 其次，利用本发明试剂盒进行检测时对样本无需进行纯化提取等前处理，不仅扩大了检测 样本范围，还降低了操作复杂性，Ebrahim法只能用于血清标本检测，且检测前必须进行透 析处理;第三，酶活稳定性更好，本发明提供的反应体系中，生物素酶活性稳定时间超过24 小时，而Ebrahim法为3小时;第四，减少了标本及试剂用量，降低了检测成本。
【附图说明】
[0059] 图1为实施例1中制作的赖氨酸浓度与赖氨酸衍生物的荧光值之间的标准曲线。
[0060] 图2为实施例3中干血片中生物素酶催化底物生物胞素水解生成赖氨酸量与反应 时间的线性关系曲线。
【具体实施方式】
[0061 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0062] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063] 实施例1、生物素酶酶活性的检测试剂盒及应用
[0064] (1)检测生物素酶酶活性的试剂盒，包括如下组分：
[0065] 试剂 1:
[0066] 乙酸钠-乙酸缓冲液（pH5.5) 2U0mnK)i/L 乙二胺四乙酸二钠 lOmmol/UA:试剂1