中的浓度） 生物胞素水溶液 2mmol儿 试剂2: 尚氛酸水溶液 60 wt% 试剂3: Na2C03 水溶液 lmol/L 试剂4: 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液CpH9.0) 250mol/L 1,2-二乙酰苯 1 wt% (在试剂4屮的浓度）
[0067] (2)生物素酶酶活性的检测
[0068] 1)样本的制备
[0069]样本为健康成人的血浆，用量为10yL。
[0070] 2)样本的检测
[0071 ]向试剂1中加入血浆样本，血浆样本与试剂1的体积比1:19，加入样本和试剂后混 合使之发生反应，于37°C反应24小时，反应结束后加入试剂2终止反应，试剂2与试剂1体积 比为1:20。终止后样品管lOOOOg离心10min，取上清液，加入试剂3，其中上清液与试剂3的比 例为2:1，中和后(pH为9)再加入试剂4,其中上清液与试剂4的比例为1:1，衍生反应条件为 30°C 下反应 30min。
[0072]衍生反应结束后用荧光检测设备检测体系在激发波长360nm(Ex = 360nm)以及发 射波长460nm(Em = 460nm)下的焚光值。
[0073]上述测定设置3个重复，经计算健康成人干血滤纸片样品的荧光读值平均为2756。 [0074] 3)空白对照荧光值的测定
[0075] 对血浆样本进行灭活处理:将血浆样本放入沸水浴中煮沸5分钟。将试剂1中加入 至灭活后的血浆样本中，血浆样本与试剂1的体积比1:18，样本和试剂后混合后，于37°C反 应24小时，反应结束后加入向反应体系中加入试剂2终止反应，试剂2与反应体系的体积比 为1:20。终止后样品管10000g离心1 Omin，取上清液，加入试剂3，其中上清液与试剂3的比例 为2:1，中和后(pH为9)再加入试剂4,其中上清液与试剂4的比例为1:1;检测该体系在激发 波长360nm(Ex = 360nm)以及发射波长460nm(Em = 460nm)下的焚光值作为空白对照的焚光 值。
[0076]上述测定设置3个重复，经计算空白对照的荧光读值平均为466。
[0077] 4)标准曲线的绘制
[0078] 取不同浓度赖氨酸标准品，其浓度分别为0、7.5、15、30、60、90、120、150μπιο 1 /L，分 别与试剂4进行衍生反应，其中衍生反应的条件与步骤2)中相同；检测并记录衍生反应后的 体系在激发波长360nm和发射波长460nm下的焚光值；以赖氨酸的浓度为横坐标，以焚光值 为纵坐标，制作标准曲线，如图1所示。
[0079]根据所制作的标准曲线以及血浆样品的平均荧光值与空白对照的平均荧光值的 差值，计算得出健康成人血液中生物素酶酶活性，为136.21±5.02(n = 3)，其中，酶活性的 单位定义为：以每L样本每小时水解所述生物胞素生成的赖氨酸的微摩尔数，表示为Miol/ L/h〇
[0080]结果显示，样本的酶活力测定实验结果稳定(CV值小于5%，通过平行样间的差异 比较得知），说明本发明的检测生物素酶活力的方法可以有效检测出血浆样本中的生物素 酶酶活力，方法简便，结果稳定可靠。
[0081 ]实施例2、生物素酶酶活性的检测
[0082]以经临床诊断和基因分析已确诊的生物素酶缺乏症的志愿者为分析对象，以健康 志愿者为对照。
[0083] 样本为干血滤纸片，与实施例1中相同。
[0084] 检测方法与实施例1中相同，每个样本分别进行3次独立的酶活性测定实验，检测 结果见表1所示。
[0085] 表1健康成人与生物素酶缺乏症患者的酶活均值
[0086]
[0087]由表1中的数据可知，健康成人样本酶活性为：102.65 ± 9.17 (n= 10);生物素酶缺 乏症患者的酶活力只有健康成人对照组的0.89%，这一结果与基因分析的结论相吻合。验 证了本发明提供的试剂盒进行生物素酶酶活性的检测时，具有稳定性、特异性、可靠性，可 应用于临床检测与生物素酶酶活力异常相关的疾病。
[0088]实施例3、生物素酶酶活性的检测
[0089] 样本为干血滤纸片，与实施例1中相同。
[0090] 检测方法与实施例1中相同，共设置6组反应，每组含2个样本和2个空白对照，并分 别于4h、7h、16h、20h、24h和30h终止一组反应，然后进行衍生反应，并检测荧光值，考察反应 过程中干血片中生物素酶的稳定性（如图2所示，线性方程为 ：y = 73.97x+66.64，R2 = 0.998)。从图2中可以看出，在30h内，干血片中的生物素酶酶活性稳定，检测结果可靠。
[0091] 由上述实施例可知，完全可以采用常规的荧光检测设备利用本发明的试剂盒进行 生物素酶酶活性的检测，并且灵敏度高，特异性好，操作简便，便于推广应用于临床检测与 生物素酶酶活力异常相关的疾病。
【主权项】
1. 一种检测生物素酶酶活性的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括独立包装的试剂 1、试剂2、试剂3和试剂4; 所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为 3 ~11; 所述试剂2为终止液； 所述试剂3为中和液； 所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1，2_二乙酰苯、茚三 酮、焚光胺和邻苯二醛中任一种。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂1中，所述缓冲液1的摩尔浓度 为50~500mmol/L，所述酶活稳定剂的摩尔浓度为1~50mmol/L，所述生物胞素的摩尔浓度 为0·05~2mmol/L; 所述试剂2中，所述终止液的质量百分含量为30 %~70 % ; 所述试剂3中，所述中和液的摩尔浓度为0.2~2mol/L; 所述试剂4中，所述缓冲液2的摩尔浓度为50~500mmol/L，所述衍生底物的质量百分含 量为0.05%~5%。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述缓冲液1和所述缓冲液2均选自 下述缓冲试剂中至少一种： a)乙酸钠-乙酸缓冲液，pH为2.6-5.8、b)甲酸钠-甲酸缓冲液，pH为2.0-5.0、c)梓檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为3.0-6.6、d)磷酸氢盐-柠檬酸缓冲液，pH为2.2-8.0、e)磷酸氢盐-柠 檬酸盐缓冲液，pH为2.2-8.0、f)磷酸盐缓冲液，pH为4.9-8.2、g)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓 冲液，pH为2.2-6.5、h)Tris-盐酸缓冲液，pH为7.1-8.9、i)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH为 8.6-10.6和j)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为9.16-10.83。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述酶活稳定剂为MgS04、 MgCl2、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、甘 油和二甲基亚砜中至少一种。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述终止液为高氯酸、盐酸、 硫酸、硝酸和三氯乙酸中至少一种的水溶液； 所述中和液为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中至少一种的水溶 液。6. 权利要求1-5中任一项所述试剂盒在辅助诊断生物素酶缺乏症中的应用。7. 生物胞素在制备辅助诊断生物素酶缺乏症的检测试剂盒或检测生物素酶酶活性中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测生物素酶酶活性的试剂盒。所述试剂盒包括独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4；所述试剂1为由缓冲液1、酶活稳定剂和生物胞素组成的缓冲体系，所述试剂1的pH值为3～11；所述试剂2为终止液；所述试剂3为中和液；所述试剂4为由缓冲液2和衍生底物组成的体系，所述衍生底物为1,2-二乙酰苯、茚三酮、荧光胺和邻苯二醛中任一种。利用本发明试剂盒进行检测时，可以干血片为检测样本，这使得本方法可应用于新生儿筛查，满足生物素酶缺乏症需及时诊治的要求，易于推广使用。
【IPC分类】G01N33/573
【公开号】CN105510583
【申请号】CN201510830513
【发明人】郝淑静, 刘晓敏, 刘卫德, 胡洁
【申请人】北京中科非凡生物技术有限公司, 北京中科医学检验所有限公司, 北京和信创新生物科技有限责任公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月25日