Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用图
【专利摘要】本发明属细胞生物技术领域，涉及Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途；本发明通过实验显示所述Ntn4通过与其配体neogenin结合、激活Jak/Stat、PI3K/Akt和ERK/MAPK等多条促癌通路，进而发挥其促进胃癌细胞增殖及侵袭的效应；实验结果显示，所述Ntn4在胃癌患者血清样本及肿瘤组织样本中均显著高表达，且其高表达与患者生存期呈负相关，与TNM分期呈正相关，表明所述Ntn4可作为胃癌诊断及预后的潜在血清学指标，用于制备检测胃癌及预后标志物的制剂，包括用于检测胃癌及预后标志物的试剂或试剂盒。
【专利说明】
Netr i n-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途
技术领域
[0001] 本发明属细胞生物技术领域，设及化trin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制 剂中的用途；其中，所述化trin-4为一种与层粘连蛋白同源的分泌蛋白。
【背景技术】
[0002] 据报道，胃癌是常见恶性肿瘤之一，死亡率在世界上仅次于肺癌，高居癌症病死率 的第二位。目前，由于临床诊疗水平的限制，尤其是缺少血清学诊断指标，多数胃癌患者确 诊时疾病已达进展期，基本失去了根治性手术的机会。有研究显示，血清胃蛋白酶原、胃泌 素-17或可用于胃癌早期筛查，但其特异性及灵敏性仍有待大样本数据验证。
[0003] 现有技术公开了 Netrins是一个进化保守、与层粘连蛋白同源的分泌蛋白家族， 其最初被认为是轴突导向调控分子，发挥调节轴突生长的作用；但最近有研究表明，所述 netrins广泛表达于神经系统外组织，并参与多种生物过程，包括血管生成、淋己管生成、 肿瘤发生、细胞迁移、侵袭及粘附等。在哺乳动物体内，netrins系统至少包括5个配体 (netrins 1，3, 4, Gla 和 G化）及 7 个潜在受体值CC, neogenin, UNC5A-D 和 A2b);其中， Nertrin-4(Ntn4)作为基底膜组成蛋白，表达于血管内皮及肾脏、乳腺和卵巢上皮的基底 膜。研究还表明，所述化n4可调节肿瘤增殖和血管生成；在高侵袭性乳腺癌组织中，Ntn4 表达明显升高，表明其可能促进肿瘤迁移及侵袭；此外，所述化n4还可通过激活MAPK，Akt/ PI3K和mTOR信号通路促进淋己管内皮细胞的增殖和迁移。
[0004] 有研究显示，Netrin受体在netrin信号转导中发挥主要作用；其中，所述 NeogeninWeo)是化n4的受体之一，其广泛表达于代谢活跃的组织，如胃肠道、肺及膜腺 等。与化n4相似的是，Neo在高侵袭性肿瘤中存在高表达，且Neo被证明可促进胃癌细胞 增殖和迁移；虽然有多项研究表明，化n4参与肿瘤发生、发展，但迄今其在胃癌中的作用尚 未见文献报道，Ntn4是否可作为血清或血浆标志物用于胃癌的诊断和预后仍缺乏相应研究 支持；此外，Neo是否在化n4对胃癌的效应中发挥作用及相应的分子机制仍不明确。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，针对胃癌诊断和预后缺乏有效的血 清学指标的现状，提供一种用于胃癌诊断及预后的潜在血清学及组织学指标，具体设及 化trin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途；
[0006] 本发明的另一目的是，提供一种胃癌治疗的潜在祀标，有助于临床实践中用W抑 制胃癌细胞增殖及迁移。
[0007] 本发明通过实验结果显示，所述化n4通过与其配体neogenin结合、能激活化k/ Stat、PI3K/Akt和E服/MAPK等多条促癌通路，进而发挥其促进胃癌细胞增殖及侵袭的效 应；实验结果显示，所述化n4在胃癌患者血清样本及肿瘤组织样本中均显著高表达，且其 高表达与患者生存期呈负相关，与?M分期呈正相关，表明所述化n4可作为胃癌诊断及预 后的潜在血清学指标，进一步，所述的化trin-4可用于制备检测胃癌及预后标志物的制 剂，如，用于检测胃癌及预后标志物的试剂或试剂盒。
[0008] 本发明进行了针对人胃癌细胞的试验，结果表明，下调化n4可显著抑制胃癌细胞 增殖，和抑制胃癌细胞迁移及侵袭，过表达化n4能促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，W及， 下调化n4的受体一neogenin可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，并且仅Neo存在的情况下 Ntn4才能发挥其促进增殖和侵袭的作用；结果还表明，Ntn4与其受体Neo结合后促进细胞 侵袭，Ntn4的促增殖和侵袭作用与JAK/Stat-PI3K/Akt-E服/MAPK信号通路的激活有关， 化n4在胃癌患者中高表达、且化n4表达升高则表明预后较差。
[0009] 本发明提供了一种用于胃癌诊断及预后的潜在血清学及组织学指标，进一步，所 述的化trin-4可用于制备检测胃癌及预后标志物的制剂，如，用于检测胃癌及预后标志物 的试剂或试剂盒。
[0010] 本发明提供一种胃癌治疗的潜在祀标，有助于临床实践中用W抑制胃癌细胞增殖 及迁移。
【附图说明】
[0011] 图1显示了下调化n4对胃癌细胞株AGS和MGC803生长的影响，其中，
[001引 A、B :实时定量PCR和ELISA法显示化n4的干扰效果良好，化n4的表达被SiRNA 显著下调；
[001引 C、D :下调化n4可明显抑制AGS和MGC803细胞增殖；
[0014] E :克隆形成实验显示下调化n4可显著抑制AGS和MGC803细胞克隆形成。
[0015] 图2显不了义用划痕实验检测下调化n4对胃癌细胞迁移的影响，其中，在划痕0、 15、24、48小时后拍照，测量划痕宽度，
[001引 A :下调化n4后细胞划痕愈合速度减慢，愈合时间延长；
[0017] B :用matrigel侵袭实验明确下调化n4是否影响细胞侵袭；
[0018] C :相较转染SiControl的AGS细胞，转染Si化n4-l和Si化n4-2减少了 61 %和 63%的细胞穿透111曰付1邑61。
[0019] 图3显示了 AGS和MGC803细胞转染PCDNA3和pcDNA3-Ntn4,实时定量PCR和化ISA 检测转染效率，其中，
[0020] A、B :转染pcDNA3-Ntn4后，Ntn4表达水平明显上升；
[002。 C、D :CCK8试验显示过表达化n4可显著促进胃癌细胞增殖；
[0022] E :划痕实验显示划痕24小时后，转染pcDNA3-Ntn4的AGS细胞较转染PCDNA3的 细胞，其划痕宽度减少20%，即其划痕愈合速度加快，愈合时间减少；
[0023] F-G :侵袭实验显示过表达化n4后，穿越matrigel的AGS和MGC803细胞数显著增 加。
[0024] 图4显示了通过实时定量PCR对现在已知的netrin家族受体在AGS和MGC803的 表达进行检测，包括化O，DCC，UNC5A-D，其中，
[0025] A :Neo在2种胃癌细胞系中均高表达；
[0026] B :利用RNA干扰技术下调Neo的表达，通过western blot验证干扰效果，结果显 示Neo表达被显著下调；
[0027] C:CCK试验显示下调Neo可抑制AGS和MGC803细胞生长，72小时抑制率分别为 32%和 54% ;
[0028] D:在侵袭实验中，转染SiNeo的AGS和MGC803细胞，其matrigel穿透率分别为对 照的73. 7%和69. 5%，即下调Neo后，细胞侵袭性下降。 图5A-B显示了 CCK8试验显示过表达化n4促进AGS和MGC803细胞增殖，但同时下调 Neo可逆转化n4的促增殖作用；C-E显示了下调Neo可逆转化n4的促细胞侵袭作用。 图6A-C显示了当通过下调化n4或Neo表达来阻断化n4-Neo复合体的功能后，MMP2 表达降低，TIMPl表达升高；相反，过表达化n4则导致MMP2表达升高，TIMPl表达降低；D-E 显示了下调化n4 48小时后，Sta口、E服、Akt和p38的憐酸化水平降低，而过表达化n4后， 所述蛋白的憐酸化水平升高；F显示下调Neo表达也导致Stat3、E服、Akt和p38的憐酸化 水平降低。
[0029] 图7A显示了相较癌旁组织，Ntn4在肿瘤组织中表达显著升高；B根据染色强度由 弱到强，将样品分为4个组，分别为弱染色组（+)、中度染色组（++)、强染色组（+++)和超强 染色组（++++) ;C:Ntn4在大多数胃癌组织样本中呈高表达，归于强染色组和超强染色组； 在癌旁组织中呈弱表达，归于弱染色组和中度染色组（P = 0. 001) ;D :在胃癌病人血清中 化n4水平显著高于正常对照（n = 52，P<0. 0001) ;E :Kaplan-Meie;r分析显不化n4高表达 组（+++、++++)的病人总生存率显著低于化n4低表达组（+、++) (P = 0. 038)。
【具体实施方式】
[0030] 本发明实验采用的细胞培养和实验试剂：
[0031] 人胃癌细胞AGS和MGC803购自中科院细胞库，细胞培养于DMEM+10% FBS ;重组 Ntn4蛋白购自R&D Systems公司，溶于IXPBS中；Dako EnVision kit和DAB显色液购自 化ko公司；Ntn4ELISA Kit购于化ZO生命科学公司，辣根过氧化物酶（HR巧和TMB底物液 均购于ebiosicence公司；抗化n4抗体购自R&D Systems公司。
[0032] 实施例1
[0033] 随机选取2005年1月一2005年12月在上海华山医院普外科行胃癌根治术，且病 史资料完整的82例患者的胃癌组织石蜡标本，同时采取其对应癌旁组织石蜡标本（手术标 本上切缘，距肿瘤边缘2cm处）。所有组织标本均由常规病理切片肥染色证实为胃腺癌。 病理诊断由两位病理专家共同认定，?M分期按2010年美国癌症联合会（AJCC)胃癌脚1分 期标准（第屯版）进行。患者随访至2011年7月，在随访期，共有34名患者失访，随访率 为58. 5% ;随机选取2014年6月一2014年11月新确诊为胃癌的52例患者的术前血清标 本，同时选取52例健康体检患者血清作为对照。
[0034] 所用组织及血清均经过上海华山医院伦理委员会批准。
[00对免疫组化：
[0036] (1)切除标本经10%甲醒固定，常规石蜡包埋，制作厚Sym组织切片。脱蜡前，将 切片于37°C恒溫箱中烘烤20分钟；
[0037] 似脱蜡至水：二甲苯I 10分钟一二甲苯II 10分钟一 100 %酒精I 5分钟 一 100%酒精II 5分钟一 95%酒精5分钟一 85%酒精5分钟一 70%酒精5分钟一蒸馈水 洗3次，每次3分钟；
[003引 做切片加入3%的过氧化氨，室溫下静置10分钟，W消除内源性过氧化物酶活 性；蒸馈水洗3次，每次3分钟；
[0039] (4)抗原微波修复：抗原微波修复前，先将CBS修复液于微波炉高火5分钟预热， 将切片放入盛有已预热的抗原修复液的容器中，置微波炉内加热高、中、低火各5分钟。取 出容器，冷却至室溫，W PBS缓冲液洗涂3次，每次3分钟；
[0040] (5)擦去组织周围PBS缓冲液，滴加一抗（Ntn工作浓度1 :200)，约50ul/片，置切 片于湿盒内，37°C，60分钟，再4°C过夜；
[0041] (6) -抗4°C过夜后弃去一抗，PBS缓冲液洗涂3次，每次5分钟；
[0042] (7)滴加二抗液，于37°C放置60分钟；
[004引 做PBS缓冲液洗涂3次，每次5分钟；
[0044] (9)擦干，滴加0. 04% DAB显色液，显色时间5-10分钟（在显微镜下控制显色程 度）；自来水冲洗3分钟中止；
[0045] (10)室溫下用苏木素复染1分钟，自来水冲洗干净，37°C 10分钟烘干片子；
[0046] (11)中性树胶封片；
[0047] (12)染色结果判断：所有病理切片由两位不了解研究内容的病理科医师共同评 判；采用半定量法，W染色强度评判化n4和Neo表达结果。+~++代表低表达，+++~++++ 代表高表达。
[0048] ELISA法检测细胞上清和病人血清化n4水平：
[0049] 根据试剂盒说明书进行相应操作，其包括主要步骤为：将IOOul细胞上清或血清 加入包被化n4抗体的96孔板，室溫解育2小时后洗涂。加入IOOul酶标抗体解育1小时 后洗涂。加入lOOulHRP解育1小时后洗涂，加入TMB底物液显色后酶标仪检测。
[0050] 细胞转染和过表达：
[0051] RNAiMax 转染 siRNA，Lipofectamine 2000 转染质粒。si化n4-l : 5' GUCCAUGGGAAGUGUAUGUTT 3' ;siNtn4-2 :5' CUCACCUAAUUGUGAUG UUTT 3' ;siNeo : 5，CATTACCTCCCACTTCACT3，，PCDNA3 空载和 pcDNA3-Ntn4 多表达质粒源自 Marko Hyyt陆〇飢。
[0052] 定量PCR检测化n4及其受体mRNA水平：
[0053] Trizol 法提取细胞总 RNA，用 PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒（购自！"akara 公司）将RNA反转录为cDNA，义用F*ower SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（购自 Applied Biosystems)对cDNA进行PCR扩增，将GAPDH作为内参，A A CT法分析基因转录水平。
[0054] 划痕实验和transwell侵袭实验：
[00巧]划痕实验：细胞转染SiRNA或质粒48小时后，用灭菌枪头划线。按0、15、24、48小 时取样拍照。化answell侵袭实验：将Matrigel (购自BD Biosciences)按1:8的比例用 无血清培养基稀释，稀释过的Matrigel均匀铺于transwell小室（购自Corning Costar), 37°C过夜后取出备用；转染SiRNA或质粒的细胞消化重悬于含有1 % BSA的无血清培养基， W 1 X IO5个细胞/孔种于transwell小室，24小时后固定、染色、计数穿过小室的细胞。
[0056] 细胞CCK8检测及克隆形成：
[0057] 转染SiRNA或质粒的细胞消化计数，2000个/孔铺于96孔板中，根据CCK8 (购自 Di jindo)试剂盒说明书进行检测；克隆形成：转染SiRNA或质粒的细胞消化计数，500个/ 孔铺于6孔板，培养10天后固定、染色、计数克隆数。
[0058] 采用GraphPad PrismS和SPSS 16. 0统计软件分析资料，对计量资料，采用非配 对T检验，对计数资料、率的比较用皮尔逊卡方检验、Fisher'S exact test检验，对等级资 料，采用 Mann -怖itney U-test 或 Kruskal - Wallis test 秩和检验，采用 Kaplan - Meier 法进行生存分析，W P<〇. 05认为存在统计学差异，W P<0.0 l认为存在明显统计学差异，W P<0.0 Ol认为存在高度统计学差异，统计均取双尾检验。
[0059] 实验结果显示：
[0060] (一）下调化n4抑制胃癌细胞增殖
[0061] 采用CCK8法检测下调化n4对胃癌细胞株AGS和MGC803生长的影响；实时定量 PCR和ELISA法显示化n4的干扰效果良好，化n4的表达被SiRNA显著下调（如图IA-B所 示），下调化n4可明显抑制AGS和MGC803细胞增殖（如图IC-D所示），克隆形成实验显示 下调化n4可显著抑制AGS和MGC803细胞克隆形成（如图IE所示），综上所述，实验结果表 明，下调化n4可显著抑制胃癌细胞增殖；
[0062] (二）下调化n4抑制胃癌细胞迁移及侵袭
[0063] 采用划痕实验检测下调化n4对胃癌细胞迁移的影响，在划痕0、15、24、48小时后 拍照，测量划痕宽度，图2A显示了下调化n4后细胞划痕愈合速度减慢，愈合时间延长；用 matrigel侵袭实验明确下调化n4是否影响细胞侵袭，图2C显示了，相较转染SiControl的 八65细胞，转染31化114-1和31化114-2能减少61%和63%的细胞穿透111曰付1旨61，在]\?^：803 细胞中观察到（如图2A所示）相似的结果；
[0064] (=)过表达化n4促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭
[0065] AGS和MGC803细胞转染PCDNA3和pcDNA3-Ntn4,实时定量PCR和ELISA检测转染 效率，结果显示，转染pcDNA3-Ntn4后，Ntn4表达水平明显上升（如图3A-B所示），CCK8试 验显示过表达化n4可显著促进胃癌细胞增殖（如图3C-D所示）；此外，划痕实验显示划痕 24小时后，转染pcDNA3-Ntn4的AGS细胞较转染PCDNA3的细胞，其划痕宽度减少20%，表 明其划痕愈合速度加快，愈合时间减少（如图3E所示），在MGC803细胞中观察到相似结果； 侵袭实验显示过表达化n4后，穿越matrigel的AGS和MGC803细胞数显著增加（如图3F-G 所示）；实验结果表明，过表达化n4可促进细胞增殖、迁移和侵袭；
[0066] (四）下调化n4的受体一neogenin，可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭
[0067] 化n4为分泌蛋白，其通过与其受体结合发挥生物学功能；基于通过实时定量PCR 对已知netrin家族受体在AGS和MGC803的表达检测，包括化0, DCC，UNC5A-D (如图4A所 示），Neo在所述的2种胃癌细胞系中均高表达，因此，本实验结果表明Neo参与化n4诱导 的细胞增殖和运动性改变。
[0068] 为了明确Neo在胃癌细胞生长中的作用，本实施例中，用RNA干扰技术下调化〇的 表达，通过western blot验证干扰效果，结果显示Neo表达被显著下调（如图4B所示）； CCK试验显示下调Neo可抑制AGS和MGC803细胞生长，72小时抑制率分别为32%和54%; 此外，在侵袭实验中，转染Si^o的AGS和MGC803细胞，其matrigel穿透率分别为对照的 73. 7%和69. 5%，即下调Neo后，细胞侵袭性下降；结果表明，下调化n4的受体化0,也可抑 制细胞生长和侵袭，Ntn4的促增殖和侵袭作用是由其受体Neo所介导；
[0069] (五）Neo介导化n4的促细胞增殖及侵袭作用
[0070] CCK8试验显示过表达化n4促进AGS和MGC803细胞增殖，但同时下调Neo可逆转 化n4的运种促增殖作用（如图5A-B所示），同样地，下调Neo可逆转化n4的促细胞侵袭作 用（如图5C-E所示）；结果进一步表明，只有在Neo存在的情况下，Ntn4才能发挥其促进增 殖和侵袭的作用；
[0071] (六）Ntn4对侵袭相关蛋白表达的影响
[0072] MMP2和TIMPl是侵袭相关重要蛋白，MMP2表达升高和TIMPl表达降低被认为与细 胞高侵袭性相关；如图6A和6C所示，当通过下调化n4或Neo表达来阻断化n4-Neo复合体 的功能后，MMP2表达降低，TIMPl表达升高湘反，过表达化n4则导致MMP2表达升高，TIMPl 表达降低；结果进一步证实了化n4与其受体Neo结合后促进细胞侵袭。
[0073] (屯）化n4对JAK/Stat，PI3K/Akt和邸K/MAPK信号通路的影响
[0074] 为了明确化n4引起MMP2和TIMPl表达水平改变的分子机制，本实施例中检测多 条信号通路相关蛋白的憐酸化水平；如图抓-E所示，下调化n448小时后，Stat3、E服、Akt 和p38的憐酸化水平降低，而过表达化n4后，上述蛋白的憐酸化水平升高；此外，下调化O 表达也导致Stat3、E服、Akt和p38的憐酸化水平降低；结果表明，Ntn4的促增殖和侵袭作 用与JAK/Stat-PI3K/Akt-E服/MAPK信号通路的激活有关；
[00巧](八）化n4在胃癌病人中局表达，且化n4表达升局提不预后较差
[0076] 本实施例进一步研究化n4表达对胃癌的临床意义，首先在82例胃癌病人组织样 品中进行化n4免疫组化染色；如图7A所示，相较癌旁组织，Ntn4在肿瘤组织中表达显著升 高；根据染色强度由弱到强，将样品分为4个组，分别为弱染色组（+)、中度染色组（++)、强 染色组（+++)和超强染色组（++++)(如图7B所示）；化n4在多数胃癌组织样本中呈高表 达，归于强染色组和超强染色组；在癌旁组织中呈弱表达，归于弱染色组和中度染色组（如 图7C所示，P = 0. 001);进一步对胃癌患者及正常对照的血清样本进行化n4的化ISA 检测，结果显示在胃癌病人血清中化n4水平显著高于正常对照（如图7D所示，n = 52， P<0. 0001)。
[0077] 本发明实验进一步分析化n4表达与胃癌病人预后的关系，Kaplan-Meier分析显 示化n4高表达组（+++、++++)的患者总生存率显著低于化n4低表达组（+、++)(如图7E所 示，P = 0. 038)。
[0078] 表1是化n4与胃癌患者临床病理分期的关系分析结果。
[0079] 表 1
[0080]
[0081] 冲<.OSwas considered statistically significant.
[0082] NA:data not avail油Ie。
[008引如表1所示，对82例胃癌病人进行?!分期，其中13例（16%)病人为?! I期， 24 例（29 % ) TNM II 期，39 例（48 % ) TNM III期和 6 例（7 % ) TNM IV期。在 45 例III期和IV期 病人中，有34例病人的肿瘤组织表现为化n4高表达（+++、++++)，而在37例I期和II期病 人中，只有12例病人的肿瘤组织表现为化n4高表达。统计学分析显示化n4高表达与更高 的?M分期呈正相关（P = 0. 008)。
[0084] 表2显示了评估胃癌患者组织化n4表达与Neo表达的关系（类似于化n4，Neo的 在肿瘤组织表达也根据染色强度分为4组）；如表2所示，所述化n4表达与Neo表达呈显 著正相关（P = 0. 003)，表明高表达化n4的肿瘤组织同时高表达化0,结果进一步证实，所 述化0的高表达对化n4诱导的肿瘤生成起重要作用。
[0085] 上述实施例的结果表明，Ntn4过表达与胃癌发生、发展相关，其可作为一种潜在的 分子祀标用于胃癌的诊断和预后。
[0086] 表 2
[0087]
o.
【主权项】
1. Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途。2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测胃癌及预后标志物的制剂是检 测胃癌及预后标志物的试剂。3. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测胃癌及预后标志物的制剂是检 测胃癌及预后标志物的试剂盒。4. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Netrin-4与其配体neogenin结合、激 活Jak/Stat、PI3K/Akt和ERK/MAPK促癌通路，促进胃癌细胞增殖及侵袭。5. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，下调Ntn4的表达抑制胃癌细胞增殖，迀移及 侵袭。6. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，下调Ntn4的受体一neogenin表达抑制胃癌 细胞的增殖和侵袭。7. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，Ntn4通过Neo介导促细胞增殖及侵袭。8. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Ntn4与其受体Neo结合后促进细胞 侵袭。9. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Ntn4表达与胃癌病人预后有关系， Ntn4高表达组的总生存率低于Ntn4低表达组。10. 按权利要求1的用途，所述的制剂检测Ntn4的表达以及Netrin-4与其配体 neogenin结合的表达水平。
【文档编号】G01N33/68GK105988009SQ201510092010
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月28日
【发明人】刘杰, 杨冬琴, 吕彬, 张骏, 章琦
【申请人】复旦大学附属华山医院