专利名称：利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，具体地说，涉及一种包括肠球菌分离纯化步骤、已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤和海洋水体粪便污染溯源分析步骤的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法。
背景技术：
粪便污染源示踪技术是利用不同动物粪便源本身所含有的示踪因子(化学物、微生物)的特异性，通过一系列实验技术针对水环境中的示踪因子的特异性加以检测识别以溯源的过程。该技术利用环境水体中的粪便污染指示菌来追踪宿主源，基因型(如脉冲场凝胶电泳法)和表型方法的应用尤其广泛。尽管基因方法重现性好，但因其高成本，操作复杂，对仪器设备要求高等特点不容易推广。表型方法中的抗生素抗性分析法只需基因型方法成本的一小部分，因操作简单、用时短、对指示细菌种群的要求低等优点而得到了广泛应用。抗生素抗性分析方法应用的理论基础是寄住于不同物种源肠道内的同种菌群因其生活的抗生素环境的不同，携带了带有其宿主特异性的抗生素抗性指纹，技术应用的关键首先要构建一个已知源指示细菌抗生素抗性指纹图谱库。指示细菌的选择是粪便污染源示踪技术的基础和关键部分。肠球菌为革兰氏阳性需氧及兼性厌氧菌，是人和温血动物肠道内的长期寄住菌群，主要包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌等，多数能在含6. 5% NaCl、40%胆盐、pH 9. 6的介质中生长，与其他指示细菌 (如大肠埃希氏菌)相比，具有对外界环境温度适应性强、抵抗力强及耐受性强、可以与多种抗生素相抵抗、生长营养要求不高等优点，相较于其他菌种更适合作为粪便污染指示细菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，该方法包括肠球菌分离纯化步骤，在该步骤中，选择合适梯度体积的粪便样本，以带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36士 1°C下培养2天后挑取符合肠球菌形态特征的菌落进行2 3次纯化，对经生化鉴定后确定为肠球菌的菌株进行保存；已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤，在该步骤中，采用琼脂扩散法，以MH琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“1”表示抗药，“0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即各菌株的抗生素抗性指纹，构建已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用数据分析软件对图谱库进行判别分析；海洋水体粪便污染溯源分析步骤，在该步骤中，采用数据分析软件，将从海洋水体样本中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。本发明提供的肠球菌分离纯化步骤包括1.选择合适梯度体积的粪便样本，以带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36士 1°C条件下培养2天后挑取符合肠球菌形态特征的菌落进行2 3次纯化， 对经生化鉴定后确定为肠球菌的菌株进行保存；2.在肠球菌分离纯化步骤中，肠球菌生化鉴定要求对每株菌均需进行接触酶实验、10°C和45°C生长验证实验、耐高盐实验、耐高PH实验、牛奶中0. 亚甲基蓝还原性实验共6种实验，对6种实验要求均完全满足的为肠球菌。本发明提供的肠球菌分离纯化步骤可以大批量处理粪便样本，实现对肠球菌的快速分离与纯化。本发明提供的已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤包括1.采用琼脂扩散法，以MH琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“ 1”表示抗药，“0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即各菌株的抗生素抗性指纹， 构建已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用数据分析软件对图谱库进行判别分析。2.图谱库建立方法选用的常用抗生素为青霉素G、四环素、利福平、万古霉素、红霉素、呋喃妥因、氯霉素、环丙沙星、磷霉素、高浓度庆大霉素共10种，本方法要求检测每株菌株对全部10种抗生素的抗药表型，并进行抗药性结果判读。3.图谱库分析方法应用数据分析软件，采用判别分析法对图谱库进行分析，以源验证和交叉验证得到的平均正确归类率评估肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的归类准确性。本发明提供的已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤可用于大批量检测肠球菌的抗药性，能够满足对图谱库建立与分析的时效性与准确性要求，可以用于图谱库的快速建立与准确分析。本发明提供的海洋水体粪便污染溯源分析步骤包括在该步骤中，将从海洋水体样品中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，应用数据分析软件的判别分析程序进行未知源菌株的归类识别，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。本发明提供的海洋水体粪便污染溯源分析步骤可以用于准确、高效识别海洋水体粪便污染来源，及时有效地为近岸海域粪便污染监测与管理提供依据。本发明方法的优点体现在识别海洋水体粪便污染来源的准确性高，检测时间短，一般在48个小时即可得到结果；操作简便易行，具备微生物操作基础即可实现；对仪器要求不高，检测成本低，适于推广；可以进行大批量检测；可用于细菌抗生素学调查和研究。
具体实施例方式本发明优选采用的肠球菌分离纯化步骤包括(1)粪便样本采集以无菌采样勺采取新鲜粪便样本放入无菌带塞试管，4°C保存运输，并在M小时内处理。( 样本前处理按1 10比例加入无菌生理盐水，玻璃棒研磨，涡旋振荡器振荡5分钟混勻，用无菌生理盐水稀释至合适梯度；(3)滤膜抽滤应用滤膜法，以0. 45 μ m带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36士 1°C条件下培养48小时。(4)菌株纯化选择胰蛋白胨大豆琼脂培养基为基质，挑取白色，点状，带棕黑色晕圈的肠球菌划线分离，进行2 3次的纯化。(5)生化鉴定对纯化后的肠球菌进行包括接触酶实验、10°C和45°C生长验证实验、耐高盐实验、耐高PH实验、牛奶中0. 亚甲基蓝还原性实验共6种实验的生化鉴定。(6)菌株保存将完全符合6种生化鉴定实验指标的菌株配置成含有30%甘油的菌液，-20°C冷冻保存。本发明所采用的已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤包括(I)MH平板制备用90毫米直径培养皿配置MH培养基，pH值7. 2 7. 4，厚度为 4毫米。(2)幼龄菌菌悬液的制备将菌种接种到增菌液37°C，llOr/min振荡培养18小时，将菌悬液稀释到0. 5麦氏单位，菌液浓度达到1 X IO8 2 X 108cellS/mL。(3)接种细菌及贴纸片移取0. 2ml菌液至MH平板，涂布均勻，待干后，将药敏纸片均勻贴于培养基表面，每种平板三个平行。(4)培养15分钟内将平板放入恒温培养箱，37°C培养18 M小时后用游标卡尺读取抑菌圈的直径。(5)抗生素抗性结果判定抗药性结果判读按照美国临床实验室标准化委员会颁布的《纸片法抗菌药物敏感试验的执行标准》(2003版)执行，分为“耐药”、“中敏”、“敏感”
三个等级。(6)指纹图谱建库将肠球菌对10种抗生素的抗性表型数据中的耐药数据标记为 “1”，敏感和中敏标记为“0”，以二元制表示每株肠球菌的抗生素抗性指纹，建立肠球菌抗生素抗性指纹图谱库。(7)图谱库分析应用数据分析软件SPSS 15. O (SPSS Inc,IL,USA)中的判别分析程序对图谱库进行分析，以源验证和交叉验证得到的平均正确归类率评估肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的归类准确性。本发明所采用的海洋水体粪便污染溯源分析步骤包括应用数据分析软件SPSS 15. O (SPSS hc，IL，USA)中的判别分析程序，将从海洋水体样品中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。本发明方法中所选用试剂和材料优选分别为菌株分离基质肠球菌选择性琼脂培养基菌株纯化基质胰蛋白胨大豆琼脂培养基增菌液胰蛋白胨大豆肉汤稀释液0. 9 %生理盐水药敏试验培养基质MH琼脂培养基滤膜0. 45 μ m带栅格纤维滤膜
药敏纸片青霉素G(10yg/片)、四环素(3(^8/片)、利福平(5 48/片)、万古霉素(30 μ g/片)、红霉素(15 μ g/片)、呋喃妥因(30 μ g/片)、氯霉素(30 μ g/片)、环丙沙星(5 μ g/片)、磷霉素(20 μ g/片)、高浓度庆大霉素(120 μ g/片)。以下通过实施例的方式具体说明本发明利用肠球菌抗生素抗性分析识别海洋水体粪便污染来源的方法。建库实施例(1)肠球菌的分离纯化采集新鲜粪便样本，经研磨和梯度稀释后，采用滤膜法， 以0. 45 μ m带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36 士 1°C条件下培养4 后挑取白色，点状，带棕黑色晕圈的肠球菌进行2 3次的纯化，对经生化鉴定确定为肠球菌的菌株进行保存，最终得到646株来自五种不同物种源(人、狗、鸡、牛、猪)的肠球菌菌株。(2)肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立采用Kirby-Bauer琼脂扩散法，以MH 琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“ 1”表示抗药，“0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即抗性指纹，建立已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，应用数学统计软件SPSS 15.0 (SPSS Inc, IL,USA)中的判别分析程序对图谱库进行归类准确性验证。本图谱库物种源模式的源验证和交叉验证的平均正确归类率分别为52. 9%和52. 2%, “人源VS动物源”模式的源验证和交叉验证平均正确归类率均为70%，两种模式各自在两种验证下的平均正确归类率之差均< 5%，说明图谱库归类准确性良好，实践可用。应用实施例选择已知源肠球菌50株作为未知源菌株，在物种源模式和“人源VS动物源”模式下应用已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库分别进行溯源，查验归类源与真实源之间的一致性。(1)物种源模式溯源结果由表1可知，人源，狗源，鸡源，牛源，猪源的正确归类率分别为60 %，50 %，50 %， 40%和40%。对已知源肠球菌中人源的归类准确性较高，对牛源和猪源的归类准确性偏低， 鸡源和狗源居中。50株肠球菌整体的平均正确归类率为48%，与图谱库物种源模式的交叉验证的平均正确归类率之差为4. 2% ( < 5% )，说明已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库在物种源模式下的归类准确性良好，证实图谱库的物种源模式实践可用。表1物种源模式溯源结果
权利要求
1.一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，该方法包括肠球菌分离纯化步骤，在该步骤中，选择合适梯度体积的粪便样本，以带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36士 1°C下培养2天后挑取符合肠球菌形态特征的菌落进行2 3次纯化，对经生化鉴定后确定为肠球菌的菌株进行保存；已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤，在该步骤中，采用琼脂扩散法，以MH琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“1”表示抗药， “0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即各菌株的抗生素抗性指纹，构建已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用数据分析软件对图谱库进行判别分析；海洋水体粪便污染溯源分析步骤，在该步骤中，采用数据分析软件，将从海洋水体样本中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。
2.根据权利要求1所述的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法， 其中在肠球菌分离纯化步骤中对肠球菌进行生化鉴定时，对每株菌均需进行接触酶实验、 10°C和45°C生长验证实验、耐高盐实验、耐高pH实验、牛奶中0. 亚甲基蓝还原性实验共 6种实验，对6种实验要求均完全满足的为肠球菌。
3.根据权利要求1中所述的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，其中在已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤中，选用的常用抗生素为青霉素G、四环素、利福平、万古霉素、红霉素、呋喃妥因、氯霉素、环丙沙星、磷霉素、高浓度庆大霉素共10种，本步骤要求检测每株菌株对全部10种抗生素的抗药表型，并进行抗药性结果判读。
4.根据权利要求1所述的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法， 其中在已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤中，应用数据分析软件，采用判别分析法对图谱库进行分析，以源验证和交叉验证得到的平均正确归类率评估肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的归类准确性。
5.根据权利要求1所述的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法， 其中在海洋水体粪便污染溯源分析步骤中，采用判别分析法进行未知源菌株的归类识别。
全文摘要
本发明提供一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法。本发明采用肠球菌选择性培养基滤膜法分离纯化肠球菌，选用琼脂扩散法检测肠球菌对抗生素的抗药表型，从而建立已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库并对其进行分析，将从海洋水体样本中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此识别海洋水体中粪便污染来源。本发明具有所需仪器设备简单、检测成本低、耗时短等优点，能够满足有关研究单位、环境监测与管理部门对近岸海域粪便污染监测、管理的需求。
文档编号G06F19/10GK102181513SQ201010609989
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者冯雯雯, 曹宾霞, 杨玉敏, 梁斌, 王耀兵, 程亮 申请人:国家海洋环境监测中心