专利名称:一种微生物絮凝剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物絮凝剂以及利用饼厂或酒厂废水制备该微生物絮凝剂的方法。
背景技术：
微生物絮凝剂是一种代表着絮凝剂发展方向的新型水处理剂，它由特殊代谢功能的微生物所产生，其功能表现为对液体体系中悬浮颗粒、反离子等进行吸附、絮凝去除。微生物絮凝剂的本质是生物大分子，主要有蛋白质类、多糖类、糖蛋白类、蛋白多糖类及DNA类等，是一类具备无毒、使用安全、可生物降解、可大规模工业化生产等特点的新型水处理齐U。而微生物絮凝剂的制备属于特殊功能生物大分子制剂生产的生物技术。
目前，很多国家对微生物絮凝剂进行了研究，至今发现的具有絮凝性的微生物近80种，包括细菌，霉菌，酵母菌，放线菌和藻类等，并在絮凝条件、絮凝机理；絮凝剂分离纯化、性质、应用；产絮凝剂的基因控制等诸方面进行了一系列的研究。这些具有絮凝活性、被人关注的微生物大都筛选自土壤、污泥、污水。
尽管微生物絮凝剂具有无毒、无二次污染及生物可降解的特点，但由于其制备多利用糖或农副产品作为生产原料，成本偏高，制约了微生物絮凝剂工业化生产和大规模应用。为降低生产成本需要从两个方面着手:一是积极寻找廉价的原材料，大幅度降低生产成本，二是针对生物絮凝剂的理化性质和用途，选择合理的工业化提取工艺和使用方法。
公开号为CN101186366A的中国专利公开提供了一种利用污水处理厂剩余活性污泥生产生物絮凝剂的方法，首先对原材料进行预处理制备净化污泥，然后对净化污泥进行细胞破碎制备抽提浆液，然后进行固液分离分别得到粗品微生物絮凝剂溶液，然后对粗品微生物絮凝剂溶液进行后处理得到微生物絮凝剂成品。此方法的缺点是:制备工艺复杂，且未提及从活性污泥中提取的絮凝剂活性成分，制备具有一定的盲目性，此外，此制备方法得到的微生物絮凝剂的絮凝率较低。
中国专利CN101327975B公开了另一种制备微生物絮凝剂的方法，其利用戴尔福特食酸菌作为制备微生物絮凝剂的来源，通过培养基的制备、菌种的发酵培养、絮凝剂的粗品的制备、絮凝剂的精品的制备，最后得到微生物絮凝剂，此方法工艺过程复杂，制备方法成本较高，且对环境的益处并无体现。
此外，《地球与环境》2008年第36卷2期《絮凝剂产生菌的筛选及应用》中公开了Geotrichum candidum的絮凝作用,但并未利用废水进行培养实验。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明从污水处理厂中筛选出具有高效絮凝能力的菌种，并从生产微生物絮凝剂的原材料入手，利用饼厂或酒厂废水生产微生物絮凝剂，不仅大大降低了微生物絮凝剂的生产成本，同时也为食品行业废水利用找到了一条出路。
为达到上述目的，本发明提供了以下技术方案:[0010]首先，从污水处理厂中分离出的多种菌株中筛选出一株可作为微生物絮凝剂生产菌的菌株，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为:2011年5月18 日，保藏号为:CGMCC 5066,分类命名.,Geotrichum candidum。
其次，本发明还提供了一种利用饼厂或酒厂的废水生产微生物絮凝剂的方法，其具体步骤为:
1、菌种的发酵培养:
(a)、利用饼厂或酒厂的废水制备微生物絮凝剂，首先，将白地霉菌株CGMCC5066接入到种子培养基中，在3(T37°C条件下培养18 36h，得到种子液；
(b)、然后将种子液按占废水体积f 10%的接种量加入到经高压蒸汽灭菌的酒厂或饼厂废水的发酵培养基，并在3(T4(TC条件下进行有氧发酵；
(C)、在发酵过程中，摇床的转速控制在6(T200rpm,并采用5M的碱溶液调节pH值在51的范围；
(d)、发酵24 72h后即可获得微生物发酵液。
2、微生物絮凝剂的制备:
(a)、将获得的发酵液在6000-9000rpm条件下离心20_30min去除菌体,将离心分离后的液体加入到相当于发酵液3倍体积的4°C的乙醇中，并在4°C条件下放置至少12h，可见絮凝沉淀物产生，该絮凝沉淀物即为絮凝剂粗制品；
(b)、在4000rpm条件下离心30min将乙醇与絮凝沉淀物分离。将离心后的絮凝沉淀物在温度为60±2°C、真空度为0.06MPa的条件下真空干燥5_6h，即可获得固体絮凝剂。
当所述的废水为酒厂废水时，使用前需将酒厂废水稀释20 200倍，用氢氧化钠调节pH值5 7，高压蒸汽灭菌。然后再将种子液按占废水体积4 8%的接种量加入到此酒厂废水中。
如上所述的使用酒厂废水制备絮凝剂的方法，得到的絮凝剂在应用时，先将固体絮凝剂部分加入与离心上清液等量的水，混匀待用。在每吨需要处理的废水中加入0-500g氯化钙，再加入混匀后的2-50升微生物絮凝剂，混匀后用氢氧化钠调节pH值4.0-8.0，充分摇匀，静置沉降。
当所述的废水为饼厂废水时，其先用氢氧化钠溶液将饼厂废水的pH值调至5-8，高压蒸汽灭菌，然后将种子液按体积I 10%的接种量加入到饼厂废水的发酵培养基中。
使用饼厂的废水制备得到的絮凝剂，在应用时，先将固体部分加入与离心上清液等量的水，混匀待用。
如上所述的方法制备得到的絮凝剂，在应用时，维持使用环境的pH值为4.0-8.0。
如上所述的酒厂废水，其内含有机酸、糖类物质及含氮化合物，COD为100g/l左右，pH呈酸性，使用前需将酒厂废水稀释20 200倍，即COD为0.5g/l 5 g/Ι，用氢氧化钠调节pH值5 7。
如上所述的饼厂废水，其内含淀粉、糖类物质及脂肪等含氮化合物，COD为3g/L左右，可以不经稀释直接用来做发酵培养基。[0027]Geotrichum candidum CGMCC 5066的筛选:以污水处理厂的活性污泥作为菌种来源样品，按常规方法制备培养基，采用稀释涂布平板分离法对样品进行微生物菌种分离，待形成单菌落后，按各单菌落所用的固体培养基配制液体培养基，按常规方法将单菌落接种于液体培养基中进行空气浴震荡器震荡培养，制备成微生物培养液，然后对所培养的微生物进行初筛。
初筛的方法为:在试管中装入浓度为4g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2_3滴培养后的微生物发酵液，观察是否有絮团生成，若有絮团生成，则说明该菌具有絮凝效果，能够作为微生物絮凝剂进行培养。将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，对高岭土悬浮液进行絮凝处理，将所产微生物絮凝剂絮凝率最高的菌种作为研究对象，并进行鉴定，鉴定方法为:该菌在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长快速，25°C黑暗条件下培养14天，菌落直径50-60mm,白色，平铺，粉状；菌落背面浅褐色，无水溶性色素，营养菌丝壁光滑，无分隔，具分枝，宽2.5-5.5 μ m。以菌丝断裂方式产生节孢子，柱状，长4.0-44.2 μ m,与菌丝同宽，未见有性态产孢子结构，其产生的胞外分泌物具有良好的除浊脱色能力，同时采用分子生物学方法进行了核糖体rRNA序列分析检测，根据培养特征、显微形态和基因序列特征等实验数据综合分析，该菌种为feoiricAw candidum,实验室命名为Mva,并经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC 5066。
絮凝率的确定如下:在IOOOml烧杯中加入IOOOml蒸馏水，4 g高岭土，0.2g的CaCl2，配制4g/L的高岭土悬浊液。用量筒量取IOOml的高岭土悬浊液，加一定量的微生物培养液，搅拌后静置3min，取50ml处上清液在722型分光光度计上测定光密度值0D550，与絮凝前的OD值相比，计算絮凝率。
絮凝率的计算方法:E (%)= (A-B)/AX 100%，其中，A为絮凝处理前550nm处的光密度值为絮凝处理后550nm处的光密度值。
如上所述的对菌株的 筛选，其常规培养基为固体培养基或液体培养基。
如上所述的固体培养基，其为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基或通用发酵培养基中的任意一种。
优选的是，如上所述的固体培养基为查氏培养基。
按照本发明，利用污水处理厂的废水筛选出一株可作为微生物絮凝剂生产菌的菌株，并且直接利用饼厂或酒厂废水生产微生物絮凝剂，不仅大大降低了微生物絮凝剂的生产成本，为食品行业副产物的增值利用找到了一条出路，同时也为环境的保护起到了良好的作用。
具体实施方式
实施例1
Geotrichum candidum CGMCC 5066 的筛选
1、微生物培养液的制备:以污水处理厂的活性污泥作为菌种来源样品，采用查氏培养基，其成分为:蔗糖 6g，FeSO4 0.002g，K 2Ρ041.0g, (NH4)2SO4 1.0g, KCl 0.5g，NaNO3
3.0g，MgSO4 0.5g，琼脂15 g，H20 1000ml,p H 7.0 ;采用稀释涂布平板分离法对样品进行微生物菌种分离，待形成单菌落后，配制查氏液体培养基，按常规方法将单菌落接种于液体培养基中进行空气浴震荡器震荡培养，制备成微生物培养液。
2、对所培养的微生物进行初筛:[0039]初筛的方法为:在试管中装入浓度为4g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2-3滴培养后的微生物发酵液，观察是否有絮团生成，若有絮团生成，则说明该菌具有絮凝效果，能够作为微生物絮凝剂进行培养。将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，对高岭土悬浮液进行絮凝处理，测定其絮凝率。
3、絮凝率的确定:在IOOOml烧杯中加入IOOOml蒸馏水，4 g高岭土，0.2g的CaCl2，配制成4g/L的高岭土悬浊液。用量筒量取IOOml的高岭土悬浊液，加一定量的微生物培养液，搅拌后静置3min，取50ml处上清液在722型分光光度计上测定光密度值0D550，与絮凝前的OD值相比，计算絮凝率。
4、将所产微生物絮凝剂絮凝率最高(絮凝率为94%)的菌种作为研究对象，并进行鉴定:该菌在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长快速，25°C黑暗条件下培养14天，菌落直径50— 60mm，白色，平铺，粉状；菌落背面浅褐色，无水溶性色素，营养菌丝壁光滑，无分隔，具分枝，宽2.5—5.5 μ m。以菌丝断裂方式产生节孢子，柱状，长4.0—44.2 μ m,与菌丝同宽，未见有性态产孢子结构，其产生的胞外分泌物具有良好的除浊脱色能力，同时采用分子生物学方法进行了核糖体rRNA序列分析检测，根据培养特征、显微形态和基因序列特征等实验数据综合分析，该菌种为Geotrichum candidum,实验室命名为Mva,并经保藏为CGMCC5066。
实施例2
利用酒厂废水制备微生物絮凝剂
1、菌种-,Geotrichum candidum CGMCC 5066。
2、微生物絮凝剂生产菌的液体培养基的配制:
种子培养基:以 IOOOml 蒸懼水计，鹿糖 18g, FeS04 0.006g, K2P04 0.6g,(NH4) 2S04 0.6g, KCl 0.3g, NaN03 1.8g, MgSO4 120.3g。
发酵培养基:将酒厂废水稀释100倍，pH值调为5.5，高压蒸汽灭菌。
3、微生物絮凝剂生产菌的制备:
种子培养:将feoiricto candidum CGMCC 5066菌接入种子培养基(250ml三角瓶，装液量50ml)，培养温度30°C，摇床转速150rpm，好氧培养24h。
发酵培养:将(SteoiricAa candidum CGMCC 5066种子液按体积4%接种量接入发酵培养液中，期间用浓度为5M的氢氧化钠溶液控制pH值在5 6，培养温度37°C，转速160rpm, 48h 发酵结束，获得(SteoiricAtt candidum CGMCC 5066 发酵液。
4、微生物絮凝剂的制备与应用:
将发酵液在9000rpm条件下离心25min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，该絮凝沉淀物为絮凝齐IJ，在4000rpm条件下离心30min将乙醇与絮凝沉淀物分离。将离心后的絮凝沉淀物在温度为60°C，真空度为0.06MPa的条件下真空干燥5h，即可获得固体絮凝剂。应用时，絮凝剂加入与离心上清液等量的水，混匀待用。先在每吨需要处理的废水中加入250g氯化钙，再加入50L微生物絮凝剂，混匀后用氢氧化钠调节pH值使其维持在4.(Γ8.0,充分摇匀，静置沉降。
5、絮凝率的测定:在100毫升0.4%的高岭土中，先加入I毫升1%氯化钙溶液，再加入0.05ml微生物絮凝剂，未调pH值，充分混匀后，静置6分钟，原来混浊的高岭土混浊液迅速结团沉淀，固液界面清晰，取上清液在722型分光光度计上，测定550nm下的OD值，与絮凝前的OD值相比，絮凝率为97.2%。
实施例3
利用饼厂加工废水生产微生物絮凝剂
1、菌种-,Geotrichum candidum CGMCC 5066。
2、微生物絮凝剂生产菌的 液体培养基的配制:
种子培养基:以IOOOml 蒸懼水计，鹿糖 18g, FeS04 0.006g, K2P04 0.6g,(NH4) 2S04 0.6g, KCl 0.3g, NaN03 1.8g, MgSO4 120.3g ；
发酵培养基:将饼厂废水的pH值调为6.5，高压蒸汽灭菌。
3、微生物絮凝剂生产菌的制备:
种子培养:将(SteotricAiffl candidum CGMCC 5066菌接入种子培养基中(250ml三角瓶，装液量100ml)，然后在培养温度35 °C，摇床转速150rpm，好氧培养24h，获得Geotrichum candidum CGMCC 5066 种子培养液。
发酵培养:用氢氧化钠将发酵培养液pH值调为6.5,将Geo trichum candidumCGMCC 5066种子液按体积5%接种量接入发酵培养液中，培养温度35°C，转速180rpm，24h发酵结束，获得 feoiricAa candidum CGMCC 5066 发酵液。
4、微生物絮凝剂的制备与应用:
将发酵液在9000rpm条件下离心25min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，该絮凝沉淀物为絮凝齐IJ，在4000rpm条件下离心30min将乙醇与絮凝沉淀物分离。将离心后的絮凝沉淀物在温度为60°C，真空度为0.06MPa的条件下真空干燥5_6h，即可获得固体絮凝剂。应用时，絮凝剂加入与离心上清液等量的水，混匀待用。每吨废水中加入20L絮凝剂，充分摇匀，静置沉降。
5、絮凝率的确定:在100毫升0.4%的高岭土中，先加入I毫升1%氯化钙溶液，再加入0.02ml微生物絮凝剂，未调pH值，充分混匀后，静置6分钟，原来混浊的高岭土混浊液迅速结团沉淀，固液界面清晰，取上清液在722型分光光度计上测定550nm下的OD值，与絮凝前的OD值相比，絮凝率达到96.8%。
实施例4
1、菌种-,Geotrichum candidum CGMCC 5066。
2、微生物絮凝剂生产菌的液体培养基的配制:
种子培养基:以IOOOml 蒸懼水计，鹿糖 18g, FeS04 0.006g, K2P04 0.6g,(NH4) 2S04 0.6g, KCl 0.3g, NaN03 1.8g, MgSO4 120.3g ；
发酵培养基:将酒厂废水稀释100倍，pH值调为7.5，高压蒸汽灭菌。
3、微生物絮凝剂生产菌的制备:
种子培养:将feoiricto candidum CGMCC 5066菌接入种子培养基(250ml三角瓶，装液量50ml)，培养温度37 °C，摇床转速150rpm，好氧培养24h ；
发酵培养:将(SteoiricAa candidum CGMCC 5066种子液按体积4%接种量接入发酵培养液中，期间用浓度为5M的氢氧化钠溶液控制pH值在5 6，培养温度37°C，转速160rpm, 48h 发酵结束，获得(SteoiricAtt candidum CGMCC 5066 发酵液。
4、微生物絮凝剂的制备与应用:
将发酵液在9000rpm离心25min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，该絮凝沉淀物为絮凝剂，在4000rpm条件下离心30min将乙醇与絮凝沉淀物分离。将离心后的絮凝沉淀物在温度为60°C，真空度为0.06MPa的条件下真空干燥5h，即可获得固体絮凝剂。
在100毫升红色染料中加入0.2ml微生物絮凝剂，充分混匀，静置片刻即产生明显的絮凝现象，有大块絮凝体沉降，上清液颜色基本去除，静置Ih后，取上清液在722型分光光度计上测定550nm下的OD 值，与加入絮凝剂前的上清液相比，比色测定脱色率达到75.5%,絮凝率为65.9%ο
对于在应用时，絮凝剂的使用量，本领域技术人员可以根据具体情况很好地进行控制。
权利要求
1.利用饼厂或酒厂废水制备微生物絮凝剂的生产菌，其特征在于，该菌株白地霉{Geotrichum candidum)为污水处理厂的活性污泥中筛选的絮凝剂生产菌，经中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为=CGMCC 5066。
专利摘要
一种微生物絮凝剂及其生产方法首先，利用污水处理厂中的废水筛选具有高效絮凝能力的菌种，保藏号为CGMCC5066，分类命名Geotrichumcandidum，然后将菌种放到种子培养基中培养得到种子液，接着将种子液接种到饼厂或酒厂的废水中，发酵得到微生物发酵液，再将微生物发酵液进行后处理，即可得到一种微生物絮凝剂。该生物絮凝剂以饼厂或酒厂废水为原料，大大降低了生产成本，并且絮凝能力强，对环境的保护起了良好的作用。
文档编号C12R1/01GKCN102517233 B发布类型授权 专利申请号CN 201110439536
公开日2013年6月5日 申请日期2011年12月26日
发明者万鹰昕 申请人:北京联合大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (3),