专利名称：：一种白及可控遗传因子的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及一种白及可控遗传因子的质量控制方法，属于生物
技术领域：
。二、
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白及5/e。77aWr/a^3(T力i/力6j)eyc/^.尸,属兰科，多年生草本。原产中国，广布我国西南、东南及华北大部分地区，生于海拔110m-3200m的林下、沟谷岩石缝中，耐阴性强。性微寒，味苦、甘、涩，具有收敛止血，消胂生肌之功效，白及收载于《中国药典〉〉2005年版一部。白及既是是我国传统名贵药材，也是我国现代医药工业的重要原材料，其系列产品有白及颗粒、白及糖浆、白及片、白及胶嚢等。我国白及原料年需求量在4500-5000吨左右，由于白及的自然繁殖、生长较慢，采挖后几乎不可再生，而对白及的开发利用范围逐步扩大，原料需求剧增，白及的自然产出与利用之间的矛盾凸现，价冲备连年攀升，由2000~2002年的1314元/kg上升到2008年的75-90元/kg,而且价格还在继续上走。由于白及至今尚未实现人工规模化种植，因此，临床中医和现代医药工业所用的白及原料全部来源于自然界，从而导致白及自然资源日趋减少，成为濒危物种，市场供需矛盾日益突出。目前，白及已被列入濒危动植物种国际贸易公约(CITES)和国家二级珍稀濒危保护植物。人工种植白及是緩解资源矛盾，培植新型生物产业的有效途径。目前，白及人工种植方法多使用块茎繁殖，3-4年采收，投入成本高，而且采用块茎繁殖白及根腐病发生频率高，发芽率低，效益不明显，产品生产年限长，技术难以推广应用。另外，通过白及组织培养可以达到种苗快速繁殖与降低根腐病的目的，但是组培苗成本很高，每抹苗O.20元以上，也是难以推广。无菌播种繁育是当前能解决白及人工种植种苗来源的首选途径。无菌播种繁育系通过人工授粉结实，在无菌条件下播种培育获得种苗，种苗成本低廉，每抹不足O.02元，是较理想的白及种苗繁育方式。但是常规的无菌播种繁育存在着成苗较少、成苗率低、成苗时间较长等问题，解决这些问题的关键是获得优良种子，而优良种子取决于其优质的遗传因子，保证优良的遗传因子需要有效、可控的质量控制方法。本发明找到一种从大量的白及花粉中选出优质生活力的花粉，通过微波辐射处理，增加花粉淀粉酶、转氨酶、蛋白酶等的活性，促进蛋白质、游离氨基酸、DNA的合成，用妥当的方法进行保存，经过人工授粉，产出大量饱满、萌发率高、活性强的白及种子，最终为白及无菌繁育提供优良种子。本发明从源头上解决了白及优良种子的难题，具有易操作、效果好、成本低、易推广等优点，为白及实现大规模人工种植提供优良种苗起到至关重要的作用。
发明内容一种白及可控遗传因子的质量控制方法，本发明按以下步骤进行操作1、使用0.3—0.8%TTC染色法测定白及花粉活力在天气晴朗无风的早晨，随机选取15朵花的花粉，各0.2克，使用细腻毛笔操作，称重后在载玻片上滴1-2滴0.5%TTC溶液制成临时观察样本，于40x10倍光学显微镜下观测，每个3次重复，每次重复观测10个视野，10个视野中平均着色的花粉粒占花粉粒总数的85%以上即为优质花粉，计算3次平均值，得出生活力最佳的花粉。2、将选取的优质白及花粉进行微波处理将选取的优质白及花粉用清水浸泡l一5h,自然晾千后用微波炉(2450MH,WD700)辐照种子8s剂量为1.26mw/mm2，存放于培养皿，然后在25°C光照培养箱进行沙培，细沙经0.1%HgCl消毒。3、将经处理的白及花粉进行保存在装花粉的培养皿中装入一定量的变色硅胶，数量根据空气湿度计来确定，将空气湿度控制在60%-70°/。之间，湿度确定后密封培养皿，然后将其放入-5°C~-1(TC的水箱中进行保存。4、定期检验白及花粉活力每隔两星期及在进行人工授粉前，同样使用0.3—0.8OTTC染色法测定其花粉活力，以确定白及花粉活力。5、通过人工授粉，结实率可达98%以上，是花粉不经过处理繁育的约10倍。6、通过无菌播种繁育，成苗率达到95°/。以上，是花粉不经过处理繁育的5-7倍，成苗时间缩短了一半时间，为2-3个月。四具体实施方式实施例l:白及可控遗传因子的质量控制方法，按以下操作步骤进行1、使用0.3°/TTC染色法测定白及花粉活力在天气晴朗无风的早晨，随机选取15朵花的花粉，各0.2克，使用细腻毛笔搡作，称重后在载玻片上滴1-2滴0.3%TTC溶液制成临时观察样本，于40x10倍光学显微镜下观测，每个3次重复，每次重复观测10个视野，经过统计后得出结论平均生活力最高的为94%。2、将选取的优质白及花粉进行微波处理将选取的优质白及花粉用清水浸泡lh,自然晾干后用微波炉(245謹H,WD700)辐照种子5s剂量为1.26丽/mnf,存放于培养皿，然后在25°C光照培养箱进行沙培，细沙经0.1%HgCl消毒。3、将处理过的白及花粉进行保存在装花粉的培养皿中装入一定量的变色硅胶，数量根据空气湿度计来确定，将空气湿度控制在60%左右，湿度确定后密封培养亚，然后将其放入-5°C~-10°C的冰箱中进行保存。4、两星期后检验白及花粉活力两星期后，使用0.3订TC染色法测定其花粉活力，花粉生活力为92%,降低2%。同时，设空白对照(不做任何处理的保存)，其花粉生活力为15%,降低79%。通过人工授粉、无菌播种繁育、炼苗后，其活力、结实率、成苗率、成苗时间、成活率等与未经过处理的空白对照組比较如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本试验结果提示，经处理的花粉，通过人工授粉，受精结实获得的白及种子及繁育的种苗，其质量优于未经过处理的白及花粉。实施例2:白及可控遗传因子的质量控制方法，按以下操作步骤进行1、使用0.5%TTC染色法测定白及花粉活力在天气晴朗无风的早晨，随机选取15朵花的花粉，各0.2克，使用细腻毛笔操作，称重后在载玻片上滴1-2滴0.5订TC溶液制成临时观察样本，于40xio倍光学显微镜下观测，每个3次重复，每次重复观测10个视野，经过统计后得出结论平均生活力最高的为95°/。2、将选取的优质白及花粉进行微波处理将选取的优质白及花粉用清水浸泡3h,自然晾干后用微波炉(2450MH，TO700)轾照种子5s剂量为1.26mw/mm2,存》t于培养皿，然后在25°C光照培养箱进行沙培，细沙经0.1%HgCl消毒。3、将处理过的白及花粉进行保存在装花粉的培养皿中装入一定量的变色硅胶，数量根据空气湿度计来确定，将空气湿度控制在65°/。左右，湿度确定后密封培养m，然后将其放入-5°C~-10°C的冰箱中进行保存。4、两星期后检验白及花粉活力两星期后，使用0.5!TTC染色法测定其花粉活力，花粉生活力为94%,降低1%。同时，设空白试验(不做任何处理的保存)，其花粉生活力为16%,降低79°/。通过人工授粉、无菌播种繁育、炼苗后，其活力、结实率、成苗率、成苗时间、成活率等与未经过处理的空白对照组比较如下项目活力结实率成苗率成苗时间成活率空白组16%19.8%14.6%4.5个月11,5%处理组94%96.2%97.6%3个月92.4%本试验结果提示，经处理的花粉，通过人工授粉，经受精结实获得的白及种子及繁育的种苗，其质量优于未经过处理的白及花粉。实施例3:白及可控遗传因子的质量控制方法，按以下操作步骤进行1使用0.8%TTC染色法测定白及花粉活力在天气晴朗无风的早晨，随机选取15朵花的花粉，各0.2克，使用细腻毛笔操作，称重后在载玻片上滴1-2滴0.3WTC溶液制成临时观察样本，于40x10倍光学显农i镜下观测，每个3次重复，每次重复观测10个视野，经过统计后得出结论平均生活力最高的为93%。2、将选取的优质白及花粉进行微波处理将选取的优质白及花粉用清水浸泡5h,自然晾干后用微波炉(2450MH,WD700)辐照种子5s剂量为1.26mw/mm2,存力t于培养皿，然后在25。C光照培养箱进行沙培，细沙经0.1%HgCl消毒。3、将处理过的白及花粉进行保存在装花粉的培养皿中装入一定量的变色硅胶，数量根据空气湿度计来确定，将空气湿度控制在70°/。左右，湿度确定后密封培秦亚，然后将其放入-5°C~-10°C的水箱中进行保存。4、两星期后^r验白及花粉活力两星期后，使用0.8订TC染色法测定其花粉活力，花粉生活力为91%，降低2%。同时，设空白试验(不做任何处理的保存)，其花粉生活力为18%,降低75%。通过人工授粉、无菌播种繁育、炼苗后，其活力、结实率、成苗率、成苗时间、成活率等与未经过处理的空白对照组比较如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本试验结果提示，经处理的花粉，通过人工授粉.受精结实获得的白及种子及繁育的种苗，其质量优于未经过处理的白及花粉。权利要求1、一种白及可控遗传因子的质量控制方法，其特征在于经过以下工艺(1)使用0.3-0.8％TTC染色法测定白及花粉活力在天气晴朗无风的早晨，随机选取15朵花的花粉，各0.2克，使用细腻毛笔操作，称重后在载玻片上滴1-2滴0.3-0.8％TTC溶液制成临时观察样本，于40×10倍光学显微镜下观测，每个3次重复，每次重复观测10个视野，10个视野中平均着色的花粉粒占花粉粒总数的85％以上即为优质花粉，计算3次平均值，得出生活力最佳的花粉。(2)将选取的优质白及花粉进行微波处理将选取的优质白及花粉用清水浸泡1-5h，自然晾干后用微波炉(2450MH，WD700)辐照种子8s剂量为1.26mw/mm2，存放于培养皿，然后在25℃光照培养箱进行沙培，细沙经0.1％HgCl消毒。(3)将经处理的白及花粉进行保存在装花粉的培养皿中装入一定量的变色硅胶，数量根据空气湿度计来确定，将空气湿度控制在60％-70％之间，湿度确定后密封培养皿，然后将其放入-5℃～-10℃的冰箱中进行保存。(4)定期检验白及花粉活力每隔两星期及在进行人工授粉前，同样使用0.3-0.8％TTC染色法测定其花粉活力，以确定白及花粉活力。全文摘要本发明公开了一种白及可控遗传因子的质量控制方法，其中包括测定白及遗传因子的载体花粉的活力，选取带有较强生活力的遗传因子的白及花粉，对选取的优良花粉进行微波处理以增强其抗逆性与适应性，通过对处理过的优质花粉进行低温保存并定期检测其活力，在适宜的时期进行人工授粉，结实后通过无菌播种育苗。本发明可极大提高授粉结实率和无菌播种育苗的成苗率。目前，无菌繁育是白及种苗繁育有效途径之一，也是能实现白及产业化较可行的繁殖方式。白及优良的种子对于白及无菌种苗繁育效果至关重要，白及种子是通过人工授粉进行受精结实，遗传因子是影响其质量的关键因素，有效、可控的质量控制方法是确保优良遗传因子的前提条件。文档编号A01H1/02GK101401544SQ20081023356公开日2009年4月8日申请日期2008年11月13日优先权日2008年11月13日发明者敏周,宋天顺,东赵,黄春球申请人:云南植物药业有限公司