专利名称：：一种恶臭假单胞菌及其喷洒剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种假单胞菌，尤其涉及一种恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)及其喷洒剂。
背景技术：
：水稻白叶枯病(以下简称白叶枯病)和水稻细菌性条斑病(以下简称细条病)是目前威胁我国南方稻区水稻生产的两种重要细菌病害。在南方稻区与稻瘟病和纹枯病并列水稻四大病害。两病的致病菌分别是Xanthomonasoryzaepv.oryzae(俗称白叶枯病菌)与Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(俗称细条病菌)，属于水稻黄单胞菌属下的两个致病变种，亲缘关系极为接近。白叶枯病在我国大部分地区均有发生，一般减产10%30%，严重可达50%以上。水稻细条病亦是水稻一种重要的细菌性病害。在我国部分地区此病发生严重，常年发生面积在460万公顷以上。尤其在我国南方稻区的危害已超过白叶枯病，杂交稻受害更重。目前防治这两种病害主要是使用化学杀菌剂。长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留的问题越来越突出，寻求作物病害防治的新途径一直是人们努力的目标。生物防治以其无污染、无残留、无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中发挥着越来越重要的作用。自20世纪90年代以来，全球化学农药以每年2%左右的比例下降，而生物农药的产量每年以10%至20%的速度递增，各大农药研制企业和科研单位也已经把微生物源农药当做研究的重点予以关注，已成为农药生物技术产业中的研究开发热点之一，我国也把生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划。微生物源农药是新农药创制的重要源头，具有研发周期短、投入低、易于工业化生产和商品化开发的优势，且对人畜安全，易于分解，与环境相容。我国是一个生物资源大国，拥有全球10%的生物遗传资源，发展微生物农药具有得天独厚的条件。近年来研究人员通过大量筛选和利用抗水稻白叶枯和细条病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治正日益成为控制这两种水稻病害的重要途径，不过大部分研究在经过实验室筛选生防菌和菌剂温室试用或小规模田间试验后就没有下文，真正应用于大田防病的菌剂少之又少。中国专利申i青200610048660.2、03117822.7及03117910.X均公开了一种能够防治水稻恶苗病、稻瘟病、纹枯病和稻曲病其中一种或几种水稻病害的菌剂及其制备方法，所含活性成分均是链霉菌(Str印tomyces)的发酵液；中国专利申请03117909.6公开了一种促进水稻生长和防治水稻纹枯病的假单胞菌菌株(Pseudomonasaureofaciens)，菌剂使用方法是用发酵液浸种；中国专利申请200710062503.1公开了一种由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)制成的菌剂及其应用，干粉或菌悬液可用于防治水稻稻瘟病等病害；中国专利申请93100172.2公开了一种用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)生产生物农药的方法，其主要成分是地衣芽孢杆菌发酵液和几种无机盐，可防治水稻白叶枯等病。
发明内容本发明提供了一种恶臭假单胞菌菌株，该菌株可以防治水稻细菌性病害，尤其对水稻细菌性条斑病与白叶枯病病原菌有突出的内吸抑制能力，并且能够促进植株生长。—种恶臭假单胞菌菌株，经鉴定命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月13日，保藏号为CCTCCNO:M209146。上述菌株主要形态及生物学特征如下菌体杆状，营养体大小2.0-4.0iimX0.7-1.liim，有单根极生鞭毛，能运动。不产生芽孢，好氧。革兰氏染色阴性。在LB培养基(胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，琼脂20g，水1000mL;pH7.2)上生长开始为淡黄色，老培养物为淡褐色。菌落圆形光滑、湿润、半透明、边缘整齐、易挑取。在LB液体培养基(LB培养基中不加琼脂)中呈混浊状，不形成菌膜。在KMB培养基(蛋白胨20.Og，甘油10.Og，KH2P043H201.5g，MgS047H201.5g，琼脂15g，H201000mL;pH7.2)上发荧光。上述菌株可以应用于防治水稻白叶枯病和细条病。本发明还提供一种含上述恶臭假单胞菌菌株的喷洒剂，其原料重量百分比组成为营养剂15%30%植物生长调节剂O.08%0.5%粘结剂O.7%3.0%恶臭假单胞菌ZJUB1995的菌悬液20%40%水余量恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995菌悬液的培养基为NB培养基(牛肉浸膏lg、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化钠5g、蔗糖10g、水1000mL;p朋.8-7.0)，其制备过程是将恶臭假单胞菌ZJUB1995接种于NB培养基，振荡扩大培养两天得到，其成品有效菌含量优选不小于108CFU/mL。优选地，所述的营养剂为尿素、磷酸二氢钾、硝酸钙及硼砂的混合物，该营养剂可补充水稻生长所需营养，培养健壮植株。它们的配比能满足水稻生长即可，重量比优选为i:o.66:o.2o.3:o.oio.i。所述的植物生长调节剂优选为细胞分裂素、三十烷醇和芸薹素的混合物，该生长调节剂具有促进生根、茎叶生长作用，能增强光合作用速率，增加结实率和千粒重。它们的重量百分比没有特别要求，只要满足水稻正常生长即可，重量比优选为i:o.030.3:0.0040.03。所述的粘结剂优选为明胶，能粘结各有效成份、增加各成分在水稻叶面发挥效力的时间，减少流失，避免浪费。本发明喷洒剂在水稻易发病期间施用，恶臭假单胞菌ZJUB1995能通过内吸作用进入水稻体内，在水稻叶围形成一个有利于植株生长的微环境，并能够阻止、抑制外来病菌的侵染与扩散，减轻水稻白叶枯病与细条病的危害。本发明还提供上述喷洒剂的使用方法，包括以下步骤根据当地水稻易发细菌性病害的时间提前喷洒，具体方法是将该喷洒剂稀释100倍后施用于水稻叶片表面。操作简单，不增加劳动量。本发明喷洒剂能显著降低水稻细菌性病害的发生率，防效超过大部分现有化学农药，有效减轻病害危害，促进植物生长；制备简单，不需要特殊加工，成本低廉；更重要的是该产品完全无毒害，无污染，生产、运输、储存和使用安全、方便，具有极强的应用前景。图1是本发明恶臭假单胞菌ZJUB1995对条斑病菌的拮抗图；图2是本发明恶臭假单胞菌ZJUB1995对白叶枯病菌的拮抗图；图3是本发明恶臭假单胞菌ZJUB1995的FAME脂肪酸图谱。具体实施例方式菌株分离纯化从浙江省杭州市华家池的一块水稻田里采集表层土壤，装入无菌聚乙烯塑料袋，封口。称取10g稻田土样品，加入到有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，在摇床上180r/min振荡30min后，依次用无菌水梯度稀释得到10—2、10—3、10—4、10—5的悬浮液，分别取100y110—3、10—4、10—5的悬浮液涂布于KMB平板(蛋白胨20.Og，甘油10.Og，KH2P043H201.5g，MgS04*7H201.5g，琼脂15g，H201000mL;pH7.2)上，28"下培养3天，在紫外灯下选取有荧光的菌株在NA培养基(牛肉浸膏lg，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000mL;p朋.8-7.0)平板上纯化后保存作为待测菌。将水稻白叶枯病菌和细条病菌分别接种于两瓶NB培养基中，180r/min培养48h后，制得菌悬液，将灭过菌的NA培养基冷却到45t:左右时，倒入上述两种菌悬液中，NA培养基与菌悬液体积比为5:l，摇匀后倒平板。4h后将上述分离纯化得到的待测菌点接于上述两种平板上。平板在室温下培养48h，观察抑菌圈的大小，挑选抑菌圈大于10mm的待测菌，转接至NA培养基试管斜面上，连续接种，传代5次，继续采用上述方法，挑取对白叶枯和细条病菌有较强拮抗效力的菌株进行田间小区筛选实验。在田间小区筛选实验中，待水稻长至2叶1心末期时，喷雾接种浓度为1X106CFU/mL的待测菌菌悬液，3d后喷雾接种浓度为1X108CFU/mL的病原菌(水稻白叶枯病菌和细条病菌)菌悬液。接种病原菌后14d观察发病情况，选择对白叶枯和细条病菌防效最好的菌株保存于NA斜面上。菌株鉴定分离得到的菌株主要形态及生物学特征如下菌体杆状，营养体大小2.0-4.0iimX0.7-1.liim，有单根极生鞭毛，能运动。不产生芽孢，好氧。革兰氏染色阴性。在LB培养基(胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，琼脂20g，水1000mL;pH7.2)上生长开始为淡黄色，老培养物为淡褐色。菌落圆形光滑、湿润、半透明、边缘整齐、易挑取。在LB液体培养基(LB培养基中不加琼脂)中呈混浊状，不形成菌膜。在KMB培养基上发荧光。该菌株经Biolog、FAME脂肪酸分析禾口16SrDNA序列(如SEQIDNO:1所示)比对，将其鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995。抑菌活性测定将水稻白叶枯病菌、细条病菌和恶臭假单胞菌ZJUB1995分别接种于三瓶NB培养基中，180r/min培养48h后，制得菌悬液，将灭过菌的NA培养基冷却到45。C左右时，倒入两种病原菌菌悬液中，NA培养基与菌悬液体积比为5:l，摇匀后倒平板。4h后在平板中央用灭菌牛津杯打孔，取恶臭假单胞菌ZJUB1995菌悬液100iiL滴于上述两种平板孔内，平板在28t:培养48h后观察抑菌圈的大小。如图1和图2所示，恶臭假单胞菌ZJUB1995对细条病菌和白叶枯病菌有极强的抑制能力，抑菌圈分别达到43.Omm与32.Omm(—般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈>10mm即可称为有较强抑菌能力)。喷洒剂配制将恶臭假单胞菌ZJUB1995接种于NA培养基中，180r/min培养48h，制得恶臭假单胞菌ZJUB1995的菌悬液，该菌悬液的成品有效菌含量大于108CFU/mL。在少量热水中依次加入明胶、芸薹素、细胞分裂素和三十烷醇，搅拌均匀后冷却；另取容器将尿素、磷酸二氢钾、硝酸钙、硼砂溶于水中，制成营养液；二者混合均匀后加入到恶臭假单胞菌ZJUB1995的菌悬液中，在常温下混合拌匀，制得喷洒剂。通过上述方法制得4种喷洒剂，各组分重量百分比如下表所示，所有组分重量百分比以喷洒剂总重量为基准。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>菌株对稻种促生作用的测定取上述配置好的恶臭假单胞菌ZJUB1995菌悬液稀释100倍，以此浸种24h，浸种后的稻种置于铺有湿润滤纸的培养皿中播种，以清水和市售强氯精(湖南省海洋生物有限公司生产)浸种作为对照。出苗7d后统计稻种出苗率，测量根长和苗高，试验重复3次，并取平均值。实验结果如下表所示处理发芽率(％)根长(mm)苗高(mm)82.034.822.580.735.621.683.340.123.2从上表中可以看出，稻种经恶臭假单胞菌ZJUB1995菌悬液浸种后，发芽率有很大提高，且能显著提高改善稻种生活力。喷洒剂的温室防病效果测定在水稻长至2叶1心末期时，饱和喷雾接种已生长48h、浓度约为1X108CFU/mL的病原菌菌悬液，薄膜覆盖保湿ld，3d后分别以实施例1、2、3、4所述的喷洒剂稀释100倍喷雾，以目前市场上防治水稻细条病和白叶枯病应用最广的化学杀菌剂龙克菌(浙江龙湾化工有限公司生产)和清水作为对照。接种后病原菌14d后统计发病情况，记载病级。结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果显示，在水稻细条病菌与白叶枯病菌高浓度的强选择压力下，本发明喷洒剂对细条病和白叶枯病的防效均好于对照。喷洒剂的大田防病效果测定在浙江省温州市瑞安区分别选取一块连年严重遭受水稻细条病和白叶枯病侵染的水稻田块作为试验场地，台风来临前3天(此地每年8月份左右台风过后该病就大流行)以实施例3所述喷洒剂稀释100倍喷雾，未处理稻田作为空白对照。对照严重发病后开始统计发病情况。结果如下表所示清水强氯精菌悬液细条病细条病对细条病白叶枯病白叶枯病对白叶枯病发病率(％)病情指数防效(％)发病率(％)病情指数防效(％)空白对照46.325.6053.235.60龙克菌14.410.857.815.915.456.7实施例310.05.279.710.58.675.8结果表明，在大田试验中，本发明喷洒剂仍然对细条病和白叶枯病有稳定的防效。SEQUENCELISTING〈110>浙江大学〈120〉一种恶臭假单胞菌及其喷洒剂〈130〉〈160>1〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1252〈212>DNA〈213〉恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)〈400〉1tcgtgttttgcggcagcctetcgagcggatgacgggagcttgctccttga60ttcagcggcggacgggtgagteatgccteggaatctgcctggtegtgggggacaacgttt120Cg皿3gg皿Cgcteateccgcatecgtcct3Cggg3g皿3gtgggggatcttcggacctc180acgctetcagatgagccteggtcggattegctegttggtgtcaccaaggc240gacgatccgtaactggtctg卿ggatgatcagtcacactgg皿ctgagacacggtccag300actcctecggtgggg皿tettgg織atgggcga皿gcctgatccagcca360tgccgcgtgttcttcggattgte皿gcacttt皿gttggg420gteagtteataccttgctgttttgacgtteCCg3C3g皿t皿gcaccggcteactctgtg■ccagcagccgcggteatecag郷gtg咖gcgtteatcgg皿ttectgggcgte皿gcg540cgcgteggtggttcgtteagttggatgtga皿gccccgggctcaacctgggaactgcatc600c皿皿ctggcgagct卿gtacggt卿gggtggtgg皿tttcctgtgtegcggtg腿t660gcgtegatetagg皿gg皿c3CC3gtggCg皿ggCg3CC3cctggactgatectgacact720g郷tgcg皿3gCgtgggg3gC皿3C3gg3ttegateccctggtegtccacgccgteaac780gatgtcaact3gCCgttgg3atccttgagattttegtggcgcagcteacgcatteagttg840accgcctggggagtecggccgc皿ggttea皿ttgacgggggcccgcaca■agcggtggagcatgtggttt皿CgCgg3g3cctteccacgccttgacatg960cag皿g朋ctttccagagatggattggtgccttcgggactCtg3C3C3ggtgctgcatgg1020ctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttegtcccgteacgagcgcaacccttgtt1080cttegteacagracggtetggtggcactct3gg3g3CtgCggtgac皿ccgg卿ggtgg1140gatgacgtcagtcatcatgccttecgctggcteccactgctecatgtcgt皿gaggtgc31200gcccgaggtggacctetccc朋acgattcgtettcgg皿tcgcggtctga皿125权利要求一种恶臭假单胞菌菌株，其特征在于命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995，保藏号为CCTCCNOM209146。2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌ZJUB1995在防治水稻稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病中的应用。3.权利要求1所述的恶臭假单胞菌ZJUB1995在促进水稻秧苗生长中的应用。4.一种含权利要求1所述的恶臭假单胞菌ZJUB1995的喷洒剂，其特征在于，原料重量百分比组成为营养剂15%30%植物生长调节剂0.08%0.5%粘结剂0.7%3.0%恶臭假单胞菌ZJUB1995菌悬液20%40%水余量。5.根据权利要求4所述的喷洒剂，其特征在于所述的恶臭假单胞菌ZJUB1995菌悬液中成品有效菌含量不小于108CFU/mL。6.根据权利要求4所述的喷洒剂，其特征在于所述的营养剂为尿素、磷酸二氢钾、硝酸钙及硼砂的混合物。7.根据权利要求6所述的喷洒剂，其特征在于所述的尿素、磷酸二氢钾、硝酸钙及硼砂重量比为i:o.66:o.2o.3:o.oio.i。8.根据权利要求4所述的喷洒剂，其特征在于所述的植物生长调节剂为细胞分裂素、三十烷醇和芸薹素的混合物。9.根据权利要求8所述的喷洒剂，其特征在于所述的细胞分裂素、三十烷醇和芸薹素的重量比为1:0.030.3:0.0040.03。全文摘要本发明公开了一种恶臭假单胞菌ZJUB1995(Pseudomonasputida)，菌种保藏编号为CCTCCNOM209146。本发明公开了由具有内吸性的恶臭假单胞菌ZJUB1995制成的喷洒剂，其重量百分比组成为营养剂15％～30％、植物生长调节剂0.08％～0.5％、粘结剂0.7％～3.0％，恶臭假单胞菌ZJUB1995的培养物20％～40％，其余为水。本发明喷洒剂能显著降低水稻细菌性病害的发生率，防效超过部分现有化学农药；而且能促进水稻生长；制备简单，不需要特殊加工，成本不高；更重要的是完全无毒害，无污染，生产、运输、储存和使用安全、方便，具有极强的应用前景。文档编号A01N63/02GK101709279SQ200910154738公开日2010年5月19日申请日期2009年12月3日优先权日2009年12月3日发明者余山红,怀燕,李斌,谢关林申请人:浙江大学