专利名称：一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。
背景技术：
随着饲用抗生素的普及甚至滥用，其所带来的耐药性、药物残留等负面效应日益突出。欧盟自2006年起全面禁止抗生素作为饲料添加剂；美国近年来几乎冻结了所有新型抗生素的审批；我国政府也先后颁布了一系列饲料药物添加剂使用规范。饲用抗生素的淡出是畜牧业发展的必然趋势，而开发利用可选择性促进肠道有益菌增殖、改善肠道内环境、 提高动物机体免疫力，同时不为肠道内酶所分解、不产生耐药性、无残留的新型绿色饲料添加剂是畜牧业可持续发展的必然趋势，酵母培养物就是其中一种。酵母培养物(Yeast culture, YC)是指由酵母菌在特定工艺条件下经充分发酵后所形成的微生态制品，主要包括酵母细胞代谢产物、经发酵后变异的培养基以及少量已无活性的酵母细胞。酵母培养物的复杂成分主要包括酵母细胞内的营养物质和酵母细胞的发酵代谢产物，有维生素、氨基酸、消化酶、有机酸、多糖以及未知的生长因子等。作为集营养、 保健于一体的新型饲料添加剂，酵母培养物通过调控瘤胃微生物区系有效提高反刍动物对饲料的利用率，这也是近年来反刍动物学和营养学研究的热点。酵母培养物的质量受菌种、发酵生产工艺以及检测手段等因素的影响。酵母菌在不同的培养环境下，如不同的温度、湿度或酸碱环境尤其是底物成分，会产生不同的发酵产物，而这其中又包含大量的未知生长因子。生产酵母培养物时所使用的培养基和发酵工艺控制参数对其终端产品中代谢产物的组成、浓度及其生物利用率的稳定性有着至关重要的影响。即便在使用相同酵母菌种的情况下，不同培养基组成或不同的发酵生产控制工艺会导致酵母培养物产品中代谢产物组成和浓度出现明显的差异。
发明内容
本发明的目的是提供一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。本发明所提供的所述酵母培养物的制备方法，包括如下步骤将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)进行液体发酵后，收集发酵液,除去所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。在上述方法中，所述液体发酵在如下条件下进行20-40°C、100-200转/分钟振荡培养10-30小时后再静置培养10-60小时；该振荡培养是在有氧条件下进行的，该静置培养是在厌氧条件下进行的。在上述方法中，所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由如下I) -3) 的物质组成I)碳源，所述碳源为如下A)_C)中的任一种A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；
B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任两种；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一种；2)氮源，所述氮源为如下D)_F)中的任一种D)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任两种；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任一种；3)无机盐，所述无机盐为 KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, GuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30_300g/L ;所述碳源具体可由IOg/ L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜组成；所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25_640g/L ;所述氮源具体可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸铵组成；所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为=KH2PO4O. lg/L-10. Og/ L、MgSO4O. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4O. 068g/L_2. 714g/L、 CaCl2O. lg/L-4. 0g/L、CuSO4O. 0639g/L_2. 556g/L、ZnSO4O. 0561g/L_2. 244g/L ；所述发酵培养基的pH值为4· 0-6. 5。在上述方法中，所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行将所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接种于种子培养基中，20_4(TC、100-200 转/分钟振荡培养18-40小时，获得种子液；再将所述种子液按照(1-30) 100的体积比接种于所述发酵培养基中进行所述液体发酵。所述种子液中所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)的浓度为 106_108cfu/L。在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和 MnSO4，在所述种子培养基中各溶质的浓度分别为葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5. Og/ L-40g/L、蛋白胨 5. 0g/L-40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。由上述方法制备得到的酵母培养物属于本发明保护的范围。本发明所提供的所述酵母培养物可用于制备动物饲料添加剂。所述动物具体可为反刍动物。所述动物饲料添加剂具体可为改善反刍动物瘤胃发酵的制剂。所述改善反刍动物瘤胃发酵体现为增加所述反刍动物瘤胃液中氨态氮的含量，和 /或增加所述反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度。所述挥发性脂肪酸具体可为乙酸、丙酸和丁酸。使用本发明所提供的发酵工艺得到的酵母培养物对反刍动物瘤胃液、乳酸利用菌和纤维素分解菌分别进行体外培养，可使反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度和挥发性脂肪酸含量分别提高38. 3-65. 58%和29. 8-39. 4 %，可使乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌和埃氏巨型球菌的生物量分别提高2. 6-3. 5倍和2. 4-3. 8倍，可使纤维素利用菌产琥珀酸拟杆菌、 牛黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的生物量分别提高75. 6 % -80. 9%,69. 89% -82. 75 %和 64. 78% -76. 76%。本发明对提高反刍动物生产力水平、优化饲料的营养价值具有重要意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所用的培养基、菌株的详细信息如下⑶C培养基青岛海博生物技术有限公司。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) :CGMCC 编号为 2. 1882。产玻拍酸拟杆菌(Fibrobactersuccinogenes subsp. succinogenes (Hungate)) ATCC 编号为 19169。牛黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens Sijpesteijn) :ATCC 编号为 19208。白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus Hungate) :ATCC 编号为 27210。反会兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp. ruminantium Bryant) ATCC 编号为 12561。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii (Gutierrez et al. ) Rogosa) :ATCC编号为 17752。实施例I、酵母培养物及其制备方法与应用一、酵母培养物的制备I、培养基的配制液体种子培养基称取IOg葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和O. Ig MnSO4 ·Η20，用IL 蒸馏水加热溶解后，121°C、0. IMpa高温灭菌15min，备用。液体发酵培养基称取IOg葡萄糖，IOg鹿糖，IOg糖蜜，IOg蛋白胨，IOg酵母膏， 5g 硫酸铵，O. Ig KH2PO4,0. Ig MgSO4 · 7H20，0. Ig MnSO4 · H2O, O. Ig CaCl2,0. IgCuSO4 · 5Η20, O. Ig ZnSO4 · 7Η20 和 O. Ig FeSO4 · 4Η20，蒸馏水溶解后，用 O. lmol/L HCl 溶液调节 pH 值至
4.O,定容至1L, 121°C、0. IMpa高温灭菌15min,备用。2、种子液的获得将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae CGMCC No. 2. 1882)活化三代后接入上述液体种子培养基中，200C、100转/分钟振摇培养18h，获得种子液，经检测，该种子液经15倍稀释后的0D_值为O. 491，酿酒酵母的活细胞数为I. I X 109cfu/L。3、发酵液的获得将步骤2获得的种子液按I : 100的体积比接种于液体发酵培养基中，20°C、100 转/分钟条件下发酵培养IOh后转入20°C恒温箱中静置培养10h，获得发酵液。4、酵母培养物的获得将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清液用细菌过滤器(0. 22 μ m)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌酵母培养物。 二、利用酵母培养物对瘤胃液的体外批次培养反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度是反映其瘤胃代谢和微生态环境状况的重要指标之一，利用这一指标对反刍动物进行氮的营养检测是现代动物营养学中采用的重要手段之一。瘤胃挥发性脂肪酸是指碳水化合物在瘤胃微生物的作用下最后分解为短链脂肪酸 (VFA)包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、戍酸、异戍酸等，其中，乙酸、丙酸、 丁酸占90%以上，其他占不到10%，因此，平时挥发性脂肪酸是指乙酸、丙酸、丁酸。本实验中所检测的挥发性脂肪酸即为乙酸、丙酸和丁酸。反刍动物60%的消化能是由VFA提供的， 因此，VFA是反刍动物重要的能量来源。本实验利用步骤一得到的酵母培养物对瘤胃液进行体外批次培养的培养液进行氨态氮浓度和挥发性脂肪酸测定。I、瘤胃液的体外批次培养从相同且正常条件下饲养的年龄相同、平均体重550kg左右、泌乳期相同的奶牛 (平均泌乳期64d)中随机取4头安装有永久性三位点瘘管的健康荷斯坦奶牛，晨饲(8:00) 前Ih时，用硬质PVC管分别从每头奶牛瘤胃上下左右不同位点采集瘤胃液，分别装入提前预热已达39 °C并通有CO2的保温瓶中，装满后立即盖严瓶口，迅速返回试验室。将上述每头奶牛的瘤胃液分2组每组设3个重复，各组的培养方法如下处理组用四层纱布过滤瘤胃液(期间温度保持在39土TC，且尽量少与空气接触)，持续通入约5min CO2气体后，迅速分装至如上已提前预热并通有CO2的保温瓶中，每保温瓶中瘤胃液为20ml，再加入40ml缓冲液、O. 5ml步骤一得到的酵母培养物、O. 15g精料 (型号B211，长春博瑞饲料有限公司)和O. 15g羊草后于39°C条件下培养24小时得到培养液。对照组用四层纱布过滤瘤胃液(期间温度保持在39土TC，且尽量少与空气接触)，持续通入约5min CO2气体后，迅速分装至如上已提前预热并通有CO2的保温瓶中，每保温瓶中瘤胃液为20ml，再加入40ml缓冲液、O. 15g精料(型号B211，长春博瑞饲料有限公司)和O. 15g羊草后于39°C条件下培养24小时得到培养液。上述缓冲液的配制方法如下于培养前Ih准确量取988ml A液，IOml B液，2ml C液，充分混合，通CO2至无色后将其分装于培养瓶内(每个培养瓶加40ml)，持续通入IOmin CO2，盖上装有塑料三通的橡皮塞，置于恒温水浴中预热至39°C待用。上述A液、B液和C液的配制方法如下A 液称取 382. 5mg k2HP04，292mg KH2PO4, 480mg (NH4) 2S04, 200mg NaCl, IOOmgMgSO4 · 7H20和4000mg Na2CO3，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。在使用前一天配制待用。B 液称取 50mg EDTA, 200mg FeSO4 · 7H20, 200mg MnCl2 · 4H20, IOmg ZnSO4 · 7H20, 30mg H3BO3, 20mg CoCl2 · 6H20, Img CuCl2 · 2H20，2mg NiCl2 · 6H20 和 3mg NaMoO4，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，持续通入18小时CO2后，盖严瓶口，置于4°C冰箱备用。C液称取25g Na2S · 9H20置于IOOml容量瓶中加80ml蒸馏水溶解后定容至 100ml，持续通入20min CO2后，盖好瓶口，置于4°C冰箱备用。2、氨态氮浓度的测定采用亚硝基铁氰化钠比色法测定，步骤如下I)氨氮标准系列溶液的配制①准确称量O. 382g氯化铵，用O. 2mol/L盐酸溶液溶解并定容到100ml，作为保存液，于4°C冰箱保存。②取步骤①的保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，作为工作液，其含氮量为 10mg/100ml。
③一次量取步骤②的工作液0、l、2、4、6ml分别置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、4ml，再用O. 2mol/L盐酸溶液定容，得到每IOOml溶液中含氮量分别为0,0. 2,0. 4,0. 8、I. 2mg的标准系列溶液。2)准确量取上述氨氮标准系列各溶液0.4ml于IOml试管中，再依次加入2ml A液和2ml B液，摇匀后静置lOmin，用TU-1901紫外可见分光光度计比色，波长700nm，用不含氮的标准溶液作空白对照。记录各系列标准溶液的消光值。3)用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程回归方程为y = O. 9062-0. 0084，R2 为 O. 9998。4)样品处理取步骤I得到的培养液IOml在3500-4000转/分钟下，离心lOmin， 量取2ml上清液(若氨氮含量较高，可取Iml上清液再加Iml蒸馏水)，置于15ml试管内， 再加入8ml O. 2mol/L盐酸至IOml摇匀(稀释倍数为5或10)。比色操作同步骤2)。把各样品测得的消光值代入步骤3)的回归方程中，算得的结果乘以样品的稀释倍数就是原样中氨态氮的浓度。将组内的各样品取平均值，结果如表I所示。3、挥发性脂肪酸(VFA)的测定I)标准液的配制VFA标准溶液(混标)用移液枪取344 μ L乙酸，373 μ L丙酸和184 μ L正丁酸， 置于IOOmL容量瓶中，用超纯水定容，即60mmol/L(3. 60g/L)乙酸，50mmol/L(3. 72g/L)丙酸和20mmOl/L(1.76g/L)正丁酸混合标准溶液。乙酸(色谱纯，P = I. 049，广州自力色谱公司)，丙酸(色谱纯，P = 0.993，广州自力色谱公司)，正丁酸(色谱纯，P = 0.959，同上)，偏磷酸(分析纯)，实验用水全部为超纯水(18. 2M Ω · cm)。2)样品的预处理取步骤I得到的培养液I. 5ml于10000转/分钟，IOmin离心后，取Iml上清液，加 25%偏磷酸溶液O. 2ml，用涡漩振荡器混合均匀，以10000转/分钟离心10_15min，得到上清液，用于检测。3)气相色谱条件采用Agilent Technologies 7890A气相色谱仪进行测定；色谱柱Nukol毛细管柱(30mXO. 32mmXO. 25 μ m);进样口 220°C ;检测器250°C ;柱温升温程序初始温度 60°C，然后以20°C /min升温速率升至190°C，保持3min，进样口压力IOOkPa ;SPL分流比 20 I ;气体流速载气氮气N275ml/min ;氢气H270ml/min ;空气50ml/min ;进样量=IuL04)上样检测及定量分析色谱柱的选择实验比较了非极性色谱柱DB-I柱和极性色谱柱Nukol柱对挥发性脂肪酸分离效果的影响。结果表明，用非极性柱DB-I柱对标准溶液中的乙酸、丙酸、丁酸进行分析，各组分不易分开，峰重叠现象严重，分离效果不理想。而用Nukol极性柱进行分析， 各组分实现完全分离，且峰形良好。这可能是由于乙酸、丙酸、丁酸本身为强极性物质，符合相似相溶原理，因此实验选强极性的Nukol柱用于实际样品分析。柱温的选择柱温通常有两种方式，一种为恒温分析，另一种为程序升温。本实验采用Nukol毛细柱，分别比较了恒温分析和多种程序升温条件对分离效果的影响。结果表明程序升温分析在分离效果和灵敏度两方面都明显优于恒温分析；采用柱温升温程序: 初始温度60°C，然后以20°C /min速率升温至190°C，保持3min，可实现对VFA的良好分离。
标准曲线将混合标准溶液稀释制备一系列不同浓度的标准溶液，分别取ImL混合标准溶液置于1.5mL离心管中，加入0.200mL 25 %偏磷酸溶液，用涡漩振荡器混合均匀，以10000转/分钟离心15min，用微量注射器取上清液I μ L，注入气相色谱仪中，进行分析，记录峰面积，以峰面积y对浓度X作标准曲线。结果表明，乙酸、丙酸、丁酸峰面积与其浓度呈良好线性关系，回归方程分别为y = 338. 96x+84. 185，y = 832. 3x+464. 32，y = 1556. 6x+645. 94，线性相关系数R2分别为O. 9998,0. 9993,0. 9968。按照相同的方法检测步骤2)经过预处理的样品，将得到的乙酸、丙酸和丁酸峰面积数值分别代入上述三个回归方程，得出各样品中乙酸、丙酸和丁酸的浓度，计算总浓度，组内样品取平均值，结果如表I所
/Jn ο4、表I结果表明与对照组相比，处理组培养液的氨态氮浓度提高45. 1%，挥发性脂肪酸含量提闻31. 6%。表I.氨态氮和挥发性脂肪酸含量测定结果
权利要求
1.一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述液体发酵在如下条件下进行 20-400C >100-200转/分钟振荡培养10-30小时后再静置培养10-60小时。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由如下I)-3)的物质组成1)碳源，所述碳源为如下A)-C)中的任一种A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任两种；C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一种；2)氮源，所述氮源为如下D)-F)中的任一种D)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；E)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任两种；F)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任一种；3)无机盐，所述无机盐为KH2P04、MgSO4, MnSO4, CaCl2, CuSO4, ZnSO4 和 FeSO4 ；所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L;所述碳源具体可由IOg/L-100g/L 葡萄糖、10g/L-100g/L 鹿糖和 10g/L-100g/L 糖蜜组成；所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L;所述氮源具体可由IOg/ L-300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L_40g/L硫酸铵组成；所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为=KH2PO4O. lg/L-10. 0g/L、 MgSO4O. 0488g/L-4. 88g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L、FeSO4O. 068g/L_2. 714g/L、CaCl2O. lg/ L-4. 0g/L、CuSO4O. 0639g/L-2. 556g/L、ZnSO4O. 0561g/L_2. 244g/L ；所述发酵培养基的pH值为4. 0-6. 5。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行将所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2. 1882)接种于种子培养基中，20-40°C、100-200转/分钟振荡培养18-40小时，获得种子液；再将所述种子液按照(1-30) 100的体积比接种于所述发酵培养基中进行所述液体发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO4，在所述种子培养基中各溶质的浓度分别为葡萄糖10g/L-40g/ L、酵母粉 5. 0g/L-40g/L、蛋白胨 5. 0g/L_40g/L、MnSO4O. 089g/L_3. 56g/L。
6.由权利要求1-5中任一所述方法制备得到的酵母培养物。
7.权利要求6所述酵母培养物在制备动物饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述动物饲料添加剂为改善反刍动物瘤胃发酵的制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述改善反刍动物瘤胃发酵体现为增加所述反刍动物瘤胃液中氨态氮的含量，和/或增加所述反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述挥发性脂肪酸为乙酸、丙酸和丁酸。
全文摘要
本发明公开了一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。该酵母培养物按照包括如下步骤的方法制备将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。使用本发明所提供的酵母培养物对反刍动物瘤胃液、乳酸利用菌和纤维素分解菌分别进行体外培养，可使反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度和挥发性脂肪酸含量分别提高38.3-65.58％和29.8-39.4％，并显著促进乳酸利用菌和纤维素利用菌的增殖。本发明对提高反刍动物生产力水平、优化饲料的营养价值具有重要意义。
文档编号A23K1/16GK102586329SQ20121005217
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者刘萍, 徐乐, 解洛香 申请人:中国农业大学