专利名称：一株产纳他霉素的新菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别涉及一株产纳他霉素的新菌株及其应用。
背景技术：
纳他霉素是一种四烯大环内酯类抗生素，为高效、安全的抗真菌天然产物，由于其对哺乳动物细胞的毒性极低，而对真菌的抑制作用极强，抗菌谱极广，并且能够阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成，加之其溶解度低，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感，因而是一种十分理想的高效、安全的天然食品防腐剂，多年来在30多个国家被广泛用于乳制品、肉类、水果、饮料等许多食品工业中，是国际上被美国FDA正式批准的仅有的两种生物防腐剂之一。我国1996年食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，1997年3月我国卫生部正式批准其作为食品防腐剂，成为我国已批准使用的3种生物防腐剂之一。纳他霉素通过链霉菌发酵生产，菌株的生产能力是关系到其发酵水平和生产成本的关键因素，因此高产菌种的选育是纳他霉素研究的热点之一。前人报道的纳他霉素产生菌有恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanovgensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)和褐黄抱链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)；近年北京市农林科学院植保环保所研究发现了纳他霉素新的产生菌利迪链霉菌(S.1ydicus)菌株AOl (中国专利，申请号为200710187435. 1，授权公告号为CN100590194C)和A02(中国专利，申请号为200610065620. 9，授权公告号为CN100467588C)，其以纳他霉素为主要有效成分的活性产物对包括多种植物病原真菌在内的供试真菌均有强烈的抑制作用。但因其为野生型菌株，在生产能力和工艺性状等方面尚不能满足工业化生产的要求，因此需要通过菌种选育获得性状优良的高产新菌株。目前纳他霉素生产菌菌种选育的手段有诱变育种、原生质体育种和基因组重排育种(genome shuffli ng)和基因工程育种，这些育种手段各有千秋。诱变育种是实验室常规育种手段，其操作简单、成本低，不需要了解菌株的遗传背景。但诱变育种正突变率低，筛选工作量大，故构建一种快速有效的筛选模式是试验成功的关键。鉴于目前对纳他霉素的遗传背景和生物合成途径尚未完全清楚，基因组重排技术在纳他霉素生产菌的遗传改造中将占据重要地位。
发明内容
本发明的目的是提供一株产纳他霉素的新菌株及其应用。本发明所提供的产纳他霉素的新菌株具体为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)JZB130117o 该菌株是以利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AOICGMCC No. 1653与利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654为出发菌株，对其进行诱变、基因组重排(Genome shuffling)后所得新菌株。该菌株已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 5562。
所述利迪链霉菌(Sti^ptomyceslydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 在制备纳他霉素中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的再一个目的是提供一种制备纳他霉素的方法。本发明所提供的制备纳他霉素的方法，具体可包括如下步骤发酵培养所述利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562，收集发酵产物，获得纳他霉素。在上述方法中，所述发酵培养的培养基(发酵培养基)的溶剂为水，溶质及其终浓度如下玉米淀粉(35. 0-40. 0)g/L，棉籽精粉(20. 0-25. 0)g/L，葡萄糖(10. 0_15)g/L，豆柏粉(25. 0-28. 0)g/L，蛋白胨(5. 0-8. 0)g/L, MgSO4 · 7H20(1. 0-1. 2)g/L, KH2PO4 (O. 2-0. 3) g/L, NaCl (4. 0-6. O) g/L, (NH4) 2S04 (5. 0-6. 0) g/L 和 CaCO3 (5. 0-8. 0) g/L, pH7. 0 7. 4。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度具体如下:玉米淀粉40. Og/L，棉籽精粉25. Og/L，葡萄糖10. Og/L，豆柏粉25. Og/L，蛋白胨5. Og/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, KH2PO4O. 2g/L, NaCl5. Og/L, (NH4) 2S045. Og/L, CaC037. Og/L,pH7. 0 7· 4。 在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基中的玉米淀粉为石家庄市天马淀粉厂产品；所述棉籽精粉为北京中棉紫光生物科技有限公司产品；所述葡萄糖为河北省昌黎县淀粉有限公司产品；所述豆柏粉为北京中棉紫光生物科技有限公司产品。在上述方法中，在发酵培养前，还包括利用种子培养基培养所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562获得种子液的步骤，再将所述种子液接种到上述发酵培养基中进行发酵培养。所述种子培养 基的溶剂为水，溶质及其终浓度如下可溶性淀粉(10.0-15.0)g/L,葡萄糖(15. 0-30.0) g/L，豆柏粉(15. 0-30.0) g/L，蛋白胨(5. 0-8. 0) g/L，MgSO4 · 7H20 (0. 8-1. 2) g/L, KH2PO4 (0. 2-0. 3g/L, NaCl (4. 0-5. 0)g/L, CaCO3 (8. 0-10. 0) g/L ；pH7. 0 7· 4。在本发明的一个实施例中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度具体如下可溶性淀粉10. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,豆柏粉20. 0g/L,蛋白胨5. 0g/L,MgSO4 · 7Η201· 0g/L, KH2PO4O. 2g/L, NaC14. Og/L, CaCO3IO. Og/L ；pH7. 0 7. 4。在上述方法中，所述发酵培养的时间具体可为60h_120h。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的时间具体为72h。在上述方法中，所述发酵培养的培养温度具体可为28°C -30°C。在本发明的一个实施例中，所述培养温度具体为30°C。在上述方法中，所述发酵培养可为摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养的培养方式为旋转震荡培养；所述旋转震荡培养的转速为220r/mirT260r/min (如220r/min)，摇床振幅为26mm。在上述方法中，所述发酵培养也可为发酵罐发酵培养；所述发酵罐(如5L发酵罐)发酵培养过程中使发酵培养液中的溶氧量为20-30%。在本发明的一个实施例中，通过控制所述发酵罐发酵培养过程中的通气量为6NL/min (NL/min是发酵过程中通气量的通用单位，读作标准升每分钟，意思是20摄氏度，I大气压的标准状况下的流量是每分钟多少升，转换为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积为1. 85V / V ·π η)，搅拌转速为26(T460r/min，使发酵培养基中的溶氧量达到20%_30%。
在上述方法中，当用发酵罐培养时，在所述发酵培养过程中还需向发酵培养液中补加葡萄糖；所述补加葡萄糖的时间为发酵开始后的12tT60h之间，所述补加葡萄糖为流加50% (50g/100mL)葡萄糖水溶液，使所述发酵培养液中还原糖的终浓度维持在1.0g/100ml。所述利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)JZB130117CGMCC No. 5562 在如下 a)或b)中的应用也属于本发明的保护范围a)制备纳他霉素敏感圃抑制剂；b)抑制纳他霉素敏感菌。本发明所提供的利迪链霉菌(Sti^ptomyceslydicus) JZB130117CGMCC No. 5562,摇瓶发酵平均产纳他霉素的量达到2. 43g/L,较两个亲本菌株利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A01CGMCC No. 1653 与利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654 分别提高了 38. 86%和55. 77% ;并且其发酵周期缩短了 40%，平均发酵产率(产物浓度/发酵时间)较亲本菌株AOl提高了 132. 99%，较A02提高了 161.54%。另外，该菌株表型也发生了改变，高氏一号斜面培养基上不产生黄色色素，这有利于下一步的纳他霉素分离纯化工艺。保藏说明囷种名称利迪链霉囷拉丁名(Streptomyceslydicus)菌株编号JZB130117保藏机构中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2011年12月9日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 556
图1为纳他霉素标准曲线。图2 为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 与两个亲本菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A01CGMCC No. 1653与利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654在高氏一号斜面培养基上的培养性状。其中，A为斜面培养基的正面；B为斜面培养基的背面。图3 为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 菌株与其它5株纳他霉素产生菌的RAPD分析结果。其中，A为随机引物P64941所对应的结果；B为随机引物P64944所对应的结果。A和B中，泳道I均为恰塔努加链霉菌(Sti^ptomyceschattanoogensis) NRRL B-2255 ;泳道 2 均为纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)NRRL B-5314 ;泳道 3 均为揭黄抱链霉菌(Streptomyces gilvosporeus) NRRL B-5623 ;泳道4均为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01 ;泳道5均为利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 ;泳道 6 均为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562。图4为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)活性产物的HPLC第一次分离谱图。图5为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)活性产物的HPLC第三次分离谱图。
图6为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的紫外扫描图谱。图7为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的红外吸收光谱。图8为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的高分辨质谱图(负离子)。图9为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的高分辨质谱图(正离子)。图10为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的核磁共振碳谱(500MHz)。图11为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)的纳他霉素样品的核磁共振氢谱(500MHz)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) A01CGMCC No. 1653 :参见中国专利，申请号为 200710187435. 1，授权公告号为 CN100590194C。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) A02CGMCC No. 1654 :参见中国专利，申请号为 200610065620. 9，授权公告号为 CN100467588C。恰塔努加链霉菌(Str eptomyceschattanoogensis) NRRL B-2255 :美国农业部菌种保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-2255 ;中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCCNo. 4. 1415。纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis) NRRL B-5314 :美国农业部菌种保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-5314。褐黄抱链霉菌(Streptomycesgilvosporeus) NRRLB-5623 :美国农业部菌种保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-5623。下述实施例中，所涉及的纳他霉素检测方法均为紫外分光光度测定法。依据纳他霉素在303nm处(纳他霉素的最大吸收波长为303nm，且该波长附近吸收值稳定范围较宽，即使有小的漂移也不会引起大的检测误差)的光密度(0D值)，以质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9g/L的纳他霉素标准品(sigma-P9703)溶液做标准曲线(图1)，得到回归方程y=0. 1028x-0. 0009, R2=O. 9988，说明在lg/L 9g/L范围内线性关系良好。测得待测发酵上清液在303nm处的OD值，代入上述标准曲线方程，计算得到纳他霉素含量。实施例1、JZB130117菌株的获得及鉴定一、JZB130117 菌株的获得1、出发菌株的诱变以利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AOICGMCC No. 1653 和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654 (以下简称 AOl 和 A02)作为出发菌株，进行紫外线和LiCl2复合诱变。紫外线指波长范围在135 390nm区域内所产生的射线，而诱变育种最有效的波长为260nm，它是一种非电离辐射。本发明所用紫外灯为实验室超净工作台中的15w低功率紫外灯，约为253. 7nm，是比较有效的作用光谱，距离控制在30cm处。LiCl2为增变剂，本身并无诱变作用，但是在抗生素产生菌的诱变育种中表明其与一些诱变因子具有协同作用。本发明LiCl2的使用浓度为O. 5% (O. 5g/100ml)。将LiCl2、硫酸链霉素和培养基一起加入培养皿中制成平板，使所述LiCl2的终浓度为O. 5%(0. 5g/100ml)，硫酸链霉素的终浓度为出发菌株的最小抑制浓度。将制备好的出发菌株的孢子悬浮液直接均匀涂布在上述所制平板中，放到距紫外灯30cm下进行诱变，处理时间为通过预实验所测得的出发菌株最佳照射时间。处理后，用报纸包好，避免见光。然后放置在28°C的条件下培养天，挑取长出的菌落(链霉素抗性突变株)，转接到斜面培养。其中，硫酸链霉素对出发菌株AOl和A02的最小抑制浓度分别为4. 5 μ g/ml和1.25 μ g/ml O出发菌株AOl和A02的最佳照射时间分别为240s和12(Tl50s，在相应的照射时间下，两个出发菌株均具有80%的致死率。经摇瓶发酵试验并检测发酵液中纳他霉素含量，结果显示，对于AOl菌株，共分离得到5株纳他霉素产量高于出发菌株A01，且5代内遗传稳定的突变株(表I)。对于A02菌株，共分离得到7株纳他霉素产量高于出发菌株A02，且5代内遗传稳定的突变株(表2)。表IAOl (1. 75g/L)为出发菌株诱变获得突变株的产量
权利要求
1.利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) JZB130117,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5562。
2.权利要求1 所述的利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 在制备纳他霉素中的应用。
3.一种制备纳他霉素的方法，包括如下步骤发酵培养权利要求1所述的利迪链霉菌 (Streptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562，收集发酵产物，获得纳他霉素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基的溶剂为水， 溶质及其终浓度如下玉米淀粉(35. 0-40. O) g/L，棉籽精粉(20. 0-25. O) g/L，葡萄糖 (10. 0-15) g/L，豆柏粉(25. 0-28. 0)g/L，蛋白胨(5. 0-8. O) g/L, MgSO4 · 7H20 (1. 0-1. 2) g/L, KH2PO4 (O. 2-0. 3) g/L, NaCl (4. 0-6. 0) g/L, (NH4) 2S04 (5. 0-6. 0) g/L 和 CaCO3 (5. 0-8. 0) g/L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养时间为 60-120h。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述发酵培养的培养温度为 280C -30O。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于所述发酵培养为摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养的培养方式为旋转震荡培养；所述旋转震荡培养的转速为220r/ min 260r/min,摇床振幅为26mm。
8.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养为发酵罐发酵培养；所述发酵罐发酵培养过程中使发酵培养液中的溶氧量为20-30%。
9.根据权利要求3-6和8中任一所述的方法，其特征在于所述发酵罐发酵培养过程中向发酵培养液中补加葡萄糖；所述补加葡萄糖的时间为发酵开始后的第12tT60h之间， 使所述发酵培养液中还原糖的终浓度维持在1. 0g/100ml。
10.权利要求1 所述的利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562 在如下a)或b)中的应用a)制备纳他霉素敏感圃抑制剂；b)抑制纳他霉素敏感菌。
全文摘要
本发明公开了一株产纳他霉素的新菌株及其应用。本发明所提供的产纳他霉素的新菌株为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5562。本发明所提供的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No.5562，平均产纳他霉素量达到2.43g/L，较出发菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01CGMCC No.1653与利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654分别提高了38.86%和55.77%；并且其发酵周期缩短了40%，计算综合发酵产率较亲本菌株A01提高了132.99%，较亲本菌株A02提高了161.54%；另外，该菌株的培养特性也发生了改变，斜面上观察菌株不产生黄色色素，这有利于下一步的纳他霉素分离纯化工艺。
文档编号C12R1/465GK103045516SQ201210581720
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者刘伟成, 刘建华, 卢彩鸽, 吴慧玲, 董丹, 张涛涛, 刘霆, 张殿朋, 刘德文, 田兆丰, 裘季燕, 亓芳 申请人:北京市农林科学院