一种桂花组织的培养方法
【专利摘要】本发明属于植物的组织培养方法【技术领域】，尤其涉及一种桂花组织的培养方法，包括以下步骤：选取健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理；用解剖刀将茎尖截成1～2mm，接种于含有初代培养基的三角瓶中；等茎尖长成2～3cm的无菌苗，将其切成0.5～1cm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖；将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中；移栽，得到生根苗。相对于现有技术，本发明至少具有如下优点：经统计，采用本发明的方法，桂花从一个茎尖到成苗移栽，只需要四个月左右的时间，这一时间优势是其它繁殖手段不能比拟的。另外本发明用到的药品价格相对低廉，从而在很大程度上缩减了生产成本。
【专利说明】一种桂花组织的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的组织培养方法【技术领域】，尤其涉及一种桂花组织的培养方法。【背景技术】
[0002]桂花又名木犀、九里香，其系木犀科木犀属植物。桂花既是园林绿化的优良树种及名贵香料，也是传统的中药材，在很多方面具有重要的价值。例如，桂花可食用，在食品、制茶和酿酒工业中，人们将桂花做为糕点、熏茶、糖果和酿酒的配料，来提高食品的质量。再如，桂花作为一种著名的天然芳香植物，其香味异常，是提炼桂花浸膏、桂花香精和香水的重要原料。还如，桂花具有重要的药用价值。桂花的根或根皮、枝叶、花和果实均可药用。现代医学表明，桂花中含有丰富的黄酮类化合物，具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和镇痛等功效，对人类肿瘤、衰老、心血管疾病的预防和治疗有着重要意义。
[0003]植物组织培养也叫离体培养，是指在无菌条件下，通过将离体的植物细胞、器官、原生质体以及胚胎等，在人工配制的培养基里进行培养，来获得完整的再生植株的技术过程。它是20世纪发展起来的一门新兴技术，它具有效率高、生长周期短、繁殖率高、培养条件可控、方便管理和利于工厂生产等优点，被广泛应用于农业、林业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益。
[0004]目前，木犀科植物的组织培养仍处在开始时期，开展研究的植物还不多，而对于属于木犀科植物的的桂花的组织培养方法的研究更是少之又少。
[0005]因此，确有必要提供一种桂花组织的培养方法，其不仅可以在较短的时间内成功获得桂花生根苗，而且成本较低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于:针对现有技术的不足，而提供一种桂花组织的培养方法，其不仅可以在较短的时间内成功获得桂花生根苗，而且成本较低。
[0007]为了达到上述要求，本发明采用如下的技术方案:
一种桂花组织的培养方法，包括以下步骤:
第一步，消毒灭菌，选取健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理；
第二步，初代培养，取消毒后的桂花嫩枝茎尖，先用消毒后的镊子除去芽体外部的鳞片及嫩叶，再用解剖刀将该茎尖截成I~2mm，接种于含有初代培养基的三角瓶中，所述初代培养基为基本的B5培养基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的琼脂粉、1.0~5.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生长素NAA，所述初代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为1500~20001x，光照时间为12~14h/d，培养25~35d。
[0008]第三步，继代培养，等茎尖长成2~3cm的无菌苗，将其切成0.5~Icm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖，所述继代培养基为基本的B5培养基加上2~4%的蔗糖、1.0~3.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生长素NAA，所述继代培养基的PH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为2000~25001x，光照时间为12~14h/d，培养25~35d ；
第四步，将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中，所述生根培养基为基本的1/2MS培养基加上1.0~3.0mg/L的生长素NAA，培养温度为25±2°C，光照强度为1000~15001x，光照时间为O~4h/d，培养35~45d ;生根培养时，随着光照时间的缩短，黑暗时间的延长，桂花幼苗的生根率逐渐上升，全黑暗处理的生根率高达88%。这可能是因为黑暗条件抑制了材料本身酚类物质的氧化，减少了醌类物质产生的毒害以及对外植体内源激素的破坏。
[0009]第五步，移栽，将装有生根无菌苗的三角瓶在室内散射光下打开，加入5~15mL蒸馏水，炼苗3~5d后除去培养基，将幼苗移栽到温室的营养土中，浇水，得到生根苗。
[0010]其中，蔗糖的浓度不能太高，也不能太低，过高或过低都不利于桂花茎尖的萌发。在培养基中，通过使用不同组合植物激素进行处理，可以调节培养物的生长发育进程、分化方向和器官发生。本发明中，若不使用植物激素，茎尖在体外是不可能萌发的。但是，茎尖的萌发率与植物激素的浓度之间存在一个抛物线关系，即植物激素在某个浓度下时茎尖的萌发率最高，大于或等于这个浓度萌发率都小于该最高的萌发率。这说明细胞分裂素和生长素只有达到一定的浓度比才能起到良好的效果。本发明中，初代培养最适合的培养基是B5+ 2.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+7g/L的琼脂粉，茎尖的萌发率可达到86.7%。
[0011]作为本发明桂花组织的培养方法的一种改进，第一步所述消毒灭菌处理是指先用洗洁精清洗桂花嫩枝茎尖2~4遍，再在自来水下冲洗I~2h，然后移入超净工作台，用
0.1%的HgCl2进行消毒处理2~3min (优选为2.5min,时间低于2.5min时污染率增加，高于2.5min时存活率减小)，最后用无菌水冲洗4_6次。
[0012]作为本发明桂花组织的培养方法的一种改进，第二步中，镊子采用I~1.lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15~20min。
[0013]作为本发明桂花组织的培养方法的一种改进，第二步中，接种前，先对含有初代培养基的三角瓶采用I~1.lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15~20min。
[0014]相对于现有技术，本发明至少具有如下优点:经统计，采用本发明的方法，桂花从一个茎尖到成苗移栽，只需要四个月左右的时间，这一时间优势是其它繁殖手段不能比拟的。另外本发明用到的药品价格相对低廉，从而在很大程度上缩减了生产成本。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体的实施例来对本发明的内容进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅仅局限于实施例所描述的内容。
[0016]实施例1
本实施例提供的一种桂花组织的培养方法，包括以下步骤:
第一步，消毒灭菌，选取健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理:先用洗洁精清洗桂花嫩枝茎尖3遍，再在自来水下冲洗1.5h，然后移入超净工作台，用0.1%的HgCl2进行消毒处理2min,最后用无菌水冲洗5次。
[0017]第二步,初代培养,取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的镊子除去芽体外部的鳞片及嫩叶，其中的镊子采用1.lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15min。再用解剖刀将该茎尖截成I~2mm，接种前，先对含有初代培养基的三角瓶采用1.lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15min，然后将该I~2mm的茎尖接种于含有初代培养基的三角瓶中，所述初代培养基为基本的B5培养基加上3%的蔗糖、7g/L的琼脂粉、3.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生长素NAA，所述初代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为18001x，光照时间为13h/d，培养30d ；15d时检查存活率和污染率，分别为88.9%和11.1%。30d时检查萌发率，为86.7%。
[0018]第三步，继代培养，等茎尖长成2~3cm的无菌苗，将其切成0.5~Icm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖，所述继代培养基为基本的B5培养基加上3%的蔗糖、2.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.05mg/L的生长素NAA，所述继代培养基的pH为
5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为20001x，光照时间为13h/d，培养30d，统计增殖系数，为 2.08。
[0019]第四步，将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中，所述生根培养基为基本的1/2MS培养基加上2.0mg/L的生长素NAA，培养温度为25 ±2°C，光照强度为12001x，光照时间为Oh/d，即进行全黑处理，培养40d，统计生根率，为88%。
[0020]第五步，移栽，将装有生根无菌苗的三角瓶在室内散射光下打开，加入IOmL蒸馏水，炼苗4d后除去培养基，将幼苗移栽到温室的营养土中，第一浇透水，前3天每天向叶片上喷水5次，后几天逐渐减少喷水次数，并观察生长情况，15d后统计，成活率为82%。
[0021]实施例2
本实施例提供的 一种桂花组织的培养方法，包括以下步骤:
第一步，消毒灭菌，选取 健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理:先用洗洁精清洗桂花嫩枝茎尖2遍，再在自来水下冲洗2h，然后移入超净工作台，用0.1%的HgCl2进行消毒处理2.5min,最后用无菌水冲洗4次。
[0022]第二步,初代培养,取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的镊子除去芽体外部的鳞片及嫩叶，其中的镊子采用lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15min。再用解剖刀将该茎尖截成I~2mm,接种前,先对含有初代培养基的三角瓶采用lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15min，然后将该I~2mm的茎尖接种于含有初代培养基的三角瓶中，所述初代培养基为基本的B5培养基加上2%的蔗糖、9g/L的琼脂粉、2.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生长素NAA，所述初代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为20001x，光照时间为12h/d，培养28d ；15d时检查存活率和污染率，分别为95.6%和O。28d时检查萌发率，为 71.1%。
[0023]第三步，继代培养，等茎尖长成2~3cm的无菌苗，将其切成0.5~Icm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖，所述继代培养基为基本的B5培养基加上2%的蔗糖、3.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.03mg/L的生长素NAA，所述继代培养基的pH为
5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为25001x，光照时间为12h/d，培养35d，统计增殖系数，为 2.01。
[0024]第四步，将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中，所述生根培养基为基本的1/2MS培养基加上3.0mg/L的生长素NAA，培养温度为25 ±2°C，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，光照时间为2h/d，培养45d，统计生根率，为50%。
[0025]第五步，移栽，将装有生根无菌苗的三角瓶在室内散射光下打开，加入15mL蒸馏水，炼苗3d后除去培养基，将幼苗移栽到温室的营养土中，第一浇透水，前3天每天向叶片上喷水5次，后几天逐渐减少喷水次数，并观察生长情况，15d后统计，成活率为78%。
[0026]实施例3
本实施例提供的一种桂花组织的培养方法，包括以下步骤:
第一步，消毒灭菌，选取健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理:先用洗洁精清洗桂花嫩枝茎尖4遍，再在自来水下冲洗lh，然后移入超净工作台，用0.1%的HgCl2进行消毒处理3min,最后用无菌水冲洗6次。
[0027]第二步,初代培养,取消毒后的桂花嫩枝莖尖,先用消毒后的镊子除去芽体外部的鳞片及嫩叶，其中的镊子采用1.05kg/cm2的大气压热压消毒灭菌17min。再用解剖刀将该茎尖截成I~2mm，接种前，先对含有初代培养基的三角瓶采用1.05kg/cm2的大气压热压消毒灭菌17min，然后将该I~2mm的茎尖接种于含有初代培养基的三角瓶中，所述初代培养基为基本的B5培养基加上4%的蔗糖、9g/L的琼脂粉、4.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.1mg/L的生长素NAA，所述初代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为15001x，光照时间为14h/d，培养32d ；15d时检查存活率和污染率，分别为68.9%和O。32d时检查萌发率，为72.5%。
[0028]第三步，继代培养，等茎尖长成2~3cm的无菌苗，将其切成0.5~Icm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖，所述继代培养基为基本的B5培养基加上4%的蔗糖、1.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.lmg/L的生长素NAA，所述继代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为22001x，光照时间为14h/d，培养25d，统计增殖系数，为 1.92。
[0029]第四步，将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中，所述生根培养基为基本的1/2MS培养基加上1.0mg/L的生长素NAA，培养温度为25 ±2°C，光照强度为15001x，光照时间为4h/d，培养35d，统计生根率，为44%。
[0030]第五步，移栽，将装有生根无菌苗的三角瓶在室内散射光下打开，加入15mL蒸馏水，炼苗6d后除去培养基，将幼苗移栽到温室的营养土中，第一浇透水，前3天每天向叶片上喷水5次，后几天逐渐减少喷水次数，并观察生长情况，15d后统计，成活率为75%。
[0031]需要说明的是，根据上述说明书的揭示和阐述，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的【具体实施方式】，对本发明的一些等同修改和变更也应当在本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
【权利要求】
1.一种桂花组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步，消毒灭菌，选取健壮桂花嫩枝茎尖，对其进行消毒灭菌处理； 第二步，初代培养，取消毒后的桂花嫩枝茎尖，先用消毒后的镊子除去芽体外部的鳞片及嫩叶，再用解剖刀将该茎尖截成1~2mm，接种于含有初代培养基的三角瓶中，所述初代培养基为基本的B5培养基加上2~4%的蔗糖、5~9g/L的琼脂粉、1.0~5.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生长素NAA，所述初代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为1500~20001x，光照时间为12~14h/d，培养25~35d ； 第三步，继代培养，等茎尖长成2~3cm的无菌苗，将其切成0.5~1cm带腋芽的茎段，转入含继代培养基的三角瓶中使其增殖，所述继代培养基为基本的B5培养基加上2~4%的鹿糖、1.0~3.0mg/L的细胞分裂素6-BA和0.01~0.lmg/L的生长素NAA,所述继代培养基的pH为5.8，培养温度为25±2°C，光照强度为2000~25001x，光照时间为12~14h/d，培养25~35d ； 第四步，将继代培养后得到的3cm以上的无菌苗转入生根培养基中，所述生根培养基为基本的1/2MS培养基加上1.0~3.0mg/L的生长素NAA，培养温度为25±2°C，光照强度为1000~15001x，光照时间为O~4h/d，培养35~45d ； 第五步，移栽，将装有生根无菌苗的三角瓶在室内散射光下打开，加入5~15mL蒸馏水，炼苗3~5d后除去培养基，将幼苗移栽到温室的营养土中，浇水，得到生根苗。
2.根据权利要求1所述的桂花组织的培养方法，其特征在于:第一步所述消毒灭菌处理是指先用洗洁精清洗桂花嫩枝茎尖2~4遍，再在自来水下冲洗1~2h，然后移入超净工作台，用0.1%的HgCl2进行消毒处理2~3min,最后用无菌水冲洗4_6次。
3.根据权利要求1所述的桂花组织的培养方法，其特征在于:第二步中，镊子采用I~1.1 kg/cm2的大气压热压消毒灭菌15~20min。
4.根据权利要求3所述的桂花组织的培养方法，其特征在于:第二步中，接种前，先对含有初代培养基的三角瓶采用1~1.lkg/cm2的大气压热压消毒灭菌15~20min。
【文档编号】A01H4/00GK103798147SQ201410079651
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】刘秀红 申请人:梅州市状元红生态发展有限公司