防治植物真菌病害的生防菌株g58及其菌剂制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了防治植物真菌病害的生防菌G58及其菌剂制备方法和应用。该生防菌命名为BacillusamyloliquefaciensG58，保藏号CGMCCNO.8977；该生防菌菌剂的制备方法为将活化后的菌株G58接种于NA培养液培养22～26h获得种子液，将种子液接种于发酵培养基培养48～72h获得发酵液，即为生防菌菌剂；含菌株G58的生防菌剂对于水稻纹枯病表现出显著的防治效果，防效可达73.6%。菌株G58具有抗菌谱广，定植能力强，效果稳定，制备成本低，应用方法简单，环境友好，无毒害等特点，在植物真菌病害防治方面具有很好的应用前景。
【专利说明】防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌剂制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物【技术领域】，具体涉及防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌剂制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]据联合国粮农组织(FAO)统计，每年由于粮食、蔬菜等作物病害问题引起的作物损失至少有10%~15%，而其中70%~80%的植物病害均是由真菌引起的。一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病害。许多病原真菌形成特殊的组织或孢子可耐受环境的变化，经历严寒和酷暑。真菌在田间主要通过气流、水流传播；此外,风、雨、昆虫也可传播真菌病害。因此，病原真菌较难控制，容易广泛传播。由于真菌性病害的特点和传播途径，目前一般多采用化学药剂进行保护性防治，或通过改进栽培管理措施加以防治。
[0003]化学防治方法简单，效果显著。然而化学农药的长期使用已经带了一系列严重的负面影响。出现了土壤和农产品中大量农药残留，农产品安全质量下降；土壤中大量有益微生物被杀死，产生了抗药性病原微生物，病害防治更加困难等问题。目前农业的可持续发展和农产品安全问题备受关注，这就要生产者在利用土地环境资源的同时要保护和改善环境；保证农产品产量的同时更要关注农产品的质量和安全。植物病害的生物防治是由英国植物病害学家Garrett于1965年提出的。生物防治是以生态学为基础防治植物病害。可以避免化学防治带来的一系列植保、环境等问题。减少了化学农药的残留，提高了农产品安全性，促进了农业的可持续发展。芽孢杆菌是目前生物防治中应用最为广泛的微生物。芽孢杆菌可以通过竞争机制，分泌抗菌物质，溶菌作用以及诱导抗性等机制产生抗病作用。芽孢杆菌中研究最为透彻的是枯草芽孢杆菌，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究始终是国内外研究的热点。而近年来解淀粉芽孢杆菌也被报到具有抗病、促生等作用，因此解淀粉芽孢杆菌在生物防治方面也受到越来越多的关注。
[0004]水稻纹枯病是由真菌立枯丝核菌ijihizoctonia soIaniKuhn)引起的水稻最主要的病害之一。水稻纹枯病以其常发性和对水稻产量造成的巨大损失而越来越受到重视，长江以南许多省份已将其列为水稻生产上的第一大病害。该病一般减产10%~30%，严重时可达50%。考虑到健康和环境因素，欧盟已于2002年禁止使用井R霉素。因此，为了提高综防效益，很有必要探索新的针对水稻纹枯病的防治策略。利用生防菌是水稻纹枯病防治的重要途径，具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，植物病害多发，防治困难，成本较高，化学农药残留严重，土壤微生物区系被破坏，农作物安全等问题，本发明提供了效果稳定、定植能力强，抗菌谱广，无环境污染的防治植物病害的生防菌株G58。
[0006]本发明的目的在于提供一株新菌种:解淀粉芽孢杆舊(Mcillusamyloli quefaci ens ) G58。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述菌株在植物病害防治过程中的应用。
[0008]本发明的再一个目的在于提供一种含有amyloli quefaci e/75G58的植物病害防治剂。
[0009]本发明的再一个目的在于提供生防菌株菌剂的制备方法。
[0010]本发明所采取的技术方案是:
一种植物真菌病害生防菌株G58，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)年2於28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8977，建议的分类命名为及^/77心amy1liquefaciens^,已于2014年3月28日鉴定保藏的菌株是存活的。
[0011]上述生防菌株ifeci77i/5.amyloli quefaci e/75G58在植物病害防治过程中的应用。
[0012]进一步的，上述植物病害为植物真菌病害。
[0013]一种植物病害防治剂，其含有上述的植物真菌病害生防菌株Bacillusamyloli quefaci ensu'd。
[0014]生防菌株ifeci77i/5.<3〃?_77ο7Υ<7--?/<3--Υ--/75.658菌剂的制备方法,包括以下步骤:将生防菌株G58接种于NA平板在29~31°C条件下活化，将活化后的生防菌株G58接种于NA培养液，29~31°C，105~115 rpm条件下培养22~26h，获得种子液；将种子液按1%~3%的接种量接种于发酵培养基，30~37°C，15(Tl80rpm条件下培养48~72 h，获得发酵液，即生防菌株amyloli quefaci (6/75658 菌剂。
[0015]进一步的，上述发酵培养基配方含有0.8~1.2g/L蔗糖、8~12 g/L酵母粉、0.6~1 g/L KCl, pH 为 5~6。
[0016]本发明的有益效果是:
I)本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株G58菌剂制备过程简单，成本较低，无毒害，无环境污染，可替代或减少对化学农药的应用，减少农药残留，定植能力强，改善土壤微生物环境，提高农产品安全性。
[0017]2)本发明的生防菌株G58在试验室平板拮抗试验中表现出良好的竞争抑制效果，极大程度的抑制了植物真菌病原菌生长。竞争抑制可以避免因抑菌物质的分解带来抑菌效果下降或消失的问题。同时，该菌也可产生抑菌物质抑制植物真菌病原菌的生长。
[0018]3)本发明的生防菌株G58在温室试验结果中表明:含本发明所述的生防菌株G58的生防菌剂有效抑制了真菌病原菌的生长，对于水稻纹枯病表现出显著的防治效果，防效可达73.6%ο
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为生防菌株G58抑制水稻纹枯病(TPAizoc1flia平板拮抗试验。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0021]实施例1
一、生防菌株G58的分离、筛选和鉴定
一种植物真菌病害生防菌株G58，命名为amyloliquefaciensQ^,由广东省增城市附近水稻田土壤分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下:
(O生防菌株G58的分离
称取10.0 g混合均匀的土壤样品,加入90 ml无菌水,于30 ° C, 180 rpm下,振荡30min，制成KT1菌悬液，再稀释成梯度为10_2~10_6的菌悬液，吸取适当梯度的菌悬液100μι均匀涂布在营养琼脂(10_5、10_6)平板上，每个稀释度重复三次，于30 ° C恒温培养箱中培养I~2 d。按照细菌形状，大小，色泽等生理性状的不同，挑取单菌落再涂平板直到获得单一形态的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，确为单一形态即为纯化，纯化后4° C冷藏备用。
[0022](2)生防菌株G58的筛选
采用平板拮抗试验方法进行生防菌株的筛选。
[0023]吸取浓度为I X 105CFU/ml的植物真菌病原菌菌液100 μL放入PDA平板中涂布均匀，利用无菌打孔器在平板上打3个孔，每孔中分别注入在30 ° C培养24h的不同分离菌株的培养液50μ1,每个处理重复三次。30 ° C恒温培养箱中培养3~5 d后,观察有无抑菌圈，计算抑菌活性。
[0024]抑菌活性用抑菌圈直径表示:抑菌圈直径=透明圈直径一孔径(8 mm)。
[0025]将具有抑菌活性的菌株在NA平板上连续转接培养10次(每隔7 d一次)，测定每次继代培养菌株的拮抗效果。
[0026]根据对水稻纹枯病、柑橘炭疽病、辣椒炭疽病、玉米炭疽病、番茄叶霉病、小麦赤霉病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黄萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及传代后抑菌活性的稳定性，筛选出一株效果稳定的广谱抗植物真菌病害菌株，将菌株纯化后，用50%的甘油保存于_70°C超低温冰箱。
[0027](3)生防菌株G58的鉴定
经形态、染色、生理生化反应及分子生物学鉴定为Bacillus amyloliquefaciens，命名为 G58。
[0028]a.防治植物真菌病害的解淀粉芽孢杆菌G58的形态特征
观察经NA平板划线培养24h后形成的单菌落形态特征可知，GB58菌落形态较小、边缘不整齐、表面无凸起、干燥、不透明，呈乳白色。液体静止培养时有菌膜形成。通过革兰氏染色、芽孢及鞭毛染色，在显微镜下观察，细胞呈短杆状、革兰氏阳性菌、中生芽孢、周生鞭毛。
[0029]b.本发明的防治植物真菌病害的解淀粉芽孢杆菌G58生理生化特征(见表1) 需氧性，葡萄糖发酵型，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、酪朊水解、明胶水解、糖醇类发酵、M.R.和V-P试验结果为阳性；柠檬酸盐水解、纤维素分解和酪氨酸水解试验结果为阴性。
[0030]表1生防菌株G58的生理生化特征
【权利要求】
1.一种防治植物真菌病害的生防菌株ifeci77i/5.amyloliquefaciens G58,保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC N0.8977。
2.权利要求1所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58在植物病害防治过程中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的植物病害为植物真菌病害。
4.一种植物病害防治剂，其特征在于:所述防治剂中含有权利要求1所述的植物真菌病害生防菌株amyloli quefaci ens G58。
5.权利要求1所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58菌剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:将权利要求1所述的生防菌株G58接种于NA平板在29~31°C条件下活化，将活化后的生防菌株G58接种于NA培养液，29~31°C，105~115 rpm条件下培养22~26h，获得种子液； 将种子液按广3%的接种量接种于发酵培养基，30~37°C，150~180rpm条件下培养48~72 h,获得发酵液，即生防菌株amyloli quefaci ensG58菌剂。
6.根据权利要求5所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58菌剂的制备方法，其特征在于:所述的发酵培养基配方含有0.8~1.2g/L蔗糖、8~12 g/L酵母粉、0.6~1 g/L KCl, pH 为 5~6。
【文档编号】A01P3/00GK104164382SQ201410246750
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】顾文杰 申请人:广东省农业科学院农业资源与环境研究所