专利名称：一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物和生物肥料领域，特别是涉及哈茨木霉，具体而言，本发明涉及一种防治植物真菌病害的哈茨木霉菌及其应用。
背景技术：
植物病害是影响农业生产的主要因素之一，一直以来化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。但由于化学农药的大量使用，带来很多负面作用，如污染生态环境、危害人畜、产生抗药性，伤害非靶标生物，农药残留等问题，严重影响了人类健康和生态平衡等一系列问题，这促使人们探寻对人类和环境无害并具良好防治效果的新型植物病虫害防治策略。随着全球范围内研制开发高效低毒生防制剂的兴起，开发微生物菌剂来控制有害生物，已经成为替代或减少化学农药使用的新型防治措施之一，受到世界各国学者、企业和消费者的重视。利用有益微生物防治植物病害始于1921年的Hartely利用真菌防治猝倒病(王晓宇，中国农业科学，2011)。木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，由于木霉菌的广泛适应性、抑菌广谱性以及多机制性，本霉菌被普遍认为能够代替多种化学农药的生防因子。早在1932年,Weidling就发现木素木霉对立枯丝核菌等病原菌有抑制作用，之后经多年的研究，发现该菌对很多种植物病原菌具有抑制作用，如在粮食作物中，由立枯丝核菌(Mdzoctonia solani )引起的纹枯病、由稻梨孢(.Magnaporthe grisea)引起的稻痕病、由禾白粉菌iErysiphe raminis)弓丨起的禾谷类白粉病等；蔬菜中由灰葡萄孢(Aoiirii1S cinerea)引起的爺科和葫芦科灰霉病、由尖镰孢菌(.Fusarium引起的黄瓜枯萎病、由瓜果腐霉aphanidermatum^Y^M]根腐病以及由疫霉属{Phytophthora')引起的疫病和核盘菌{Sclerotinia sclerotiorum)等引起的蔬菜病害；木霉菌属还可以控制采后水果的多种疫病如草莓灰霉病(此ciflerea)和白粉病香蕉枯萎病(/7W1Saria oxysporum)等;此外，木霉菌属防治林果病害也有较好的效果，如由聚生小穴壳菌(Pothiorella grearia)引起的杨树溃瘍病，由苹果柱盘孢霉引起的黑点病等。木霉菌对植物病害的生防作用机制包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等。不同作用方式之间往往存在着协同作用。可知，木霉菌属现已成为一种理想的生防菌株，筛选对病原真菌有高效抑制作用的菌株是防治植物病害的有效方法之一。但是，目前已知对植物真菌病害具有防治作用的木霉菌大多效果不佳、作用对象比较单一、易受自然环境影响 、竞争存活能力有限等弊端。出乎意外地，本申请发明人经过多年悉心研究，从植物根际土壤中分离到一株新的哈茨木霉菌菌株，该菌株对多种植物真菌病害具有良好的防治效果，遗传稳定，且不容易产生抗性
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的哈茨木霉菌菌株，所述菌株对多种植物真菌病害的防治有明显效果。本发明所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)于2013年I月28日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC N0.7230。本发明所提供的哈茨木霉菌是从植物根际土壤中分离得到的，其实验室命名为菌株 MSB1211。将菌株MSB1211在PDA培养基上培养，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，将5mm MSB1211菌株的菌丝块接种到PDA培养基上，28°C恒温培养24h后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌落扩展较快，培养72h时菌落直径为68mm，菌丝层较厚，致密绒状，菌落初期为白色，后期因产生孢子而呈绿色。菌落背面初为无色，后期成黄褐色。在显微镜下观察，菌丝透明，有隔，内含物丰富，细胞壁光滑，菌丝生长端呈椭圆形。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，对生二至三级分枝，分枝与分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶体端部尖削，微弯，尖端生分生孢子，表面光滑。根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法初步鉴定菌株MSB1211为木霉属(rricAoiferaa)，利用分子生物学技术对其ITS序列鉴定后该菌为哈茨木霉 Trichoderma harzianum。进一步地，本发明提供上述哈茨木霉菌防治植物真菌病害的用途。 优选地，导致所述植物真菌病害的植物真菌病原体为腐霉病菌{Pythiim spp.)、镰刀菌iFusarium spp.)、灰霉病菌iBotrytis cinerea )中的一种或几种。更优选地，所述植物真菌病害为黄瓜腐霉病菌iPythium aphanidermatum)、激瓜尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum )、番爺灰霉病菌cinerea )
进一步的，本发明的哈茨木霉菌可以制成微生物菌剂，即将本发明的上述菌株接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25°C _30°C、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3-4天，并调节孢子浓度为IXlO6个/mL，即制得本发明哈茨木霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵:将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将IOmL上述哈茨木霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25°C -30°C发酵培养3-4天后制得本发明所述微生物菌剂。进一步地，本发明的哈茨木霉菌可以制成如下生物肥，即将上述哈茨木霉菌的微生物菌剂与有机肥料、大量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2:3:5 ;所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述大量元素肥料为氮肥、磷肥或钾肥。所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾
进一步地，本发明的哈茨木霉菌可以制成如下生物肥，即将上述哈茨木霉菌的微生物菌剂与有机肥料、微量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2:3:5 ;所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述微量元素肥料为选自碳酸锰锌、硼镁肥、钥酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或几种。腐霉菌，是一种适应性较强的细菌。它多侵害植物的叶、花、果等部位。为害瓜类、豆类、茄科、烟草、玉米、棉花、甜菜等植物的幼苗及果实，引起幼苗猝倒，根茎和瓜果腐烂。在潮湿条件下病部表面长出发达的白色棉絮状霉层。腐霉菌侵害不同植物造成不同腐霉病害，如腐霉病菌侵染黄瓜、丝瓜等瓜类植物引发黄瓜腐霉病、丝瓜腐霉病等瓜果腐霉病 ’腐霉病菌侵染爺子等爺科植物引发爺子腐霉病等爺科腐霉病；S 科腐霉病菌等。本发明通过使用哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制侵染黄瓜的腐霉菌的生长，对黄瓜腐霉病具有显著的生防作用。镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最困难的重要病害之一。本发明通过使用哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制镰刀菌枯萎病，对镰刀菌具有显著的生防效果。灰霉病菌属真菌病害，它能危害番茄、黄瓜、草莓、辣椒、葡萄等多种蔬菜、果树和观赏植物，目前已发现的寄主植物至少有235种，且花、果、叶、茎均可发病。寄主植株从苗期到挂果期都可以发病，叶、茎、花、果实均可感染病害。感病后，叶部症状表现有“V”形病斑、不规则病斑、叶柄折断等症状。茎部症状表现为茎腐烂、茎基腐烂。花部症状表现为花腐烂和凋萎。果实症状表现为腐烂和果实脱落。本发明通过哈茨木霉MSB1211的上述微生物菌剂的温室抑菌效果试验证实本发明所述哈茨木霉菌可以有效抑制灰葡萄孢菌，对灰霉病具有显著的生防效果。
本发明的效果
1、在平板对峙法中，本发明的哈茨木霉菌对黄瓜腐霉病菌、甜瓜尖孢镰刀菌和番茄灰霉病菌三类植物病原真菌具有 良好的抑制效果，抑制率均在79.8%以上，说明本发明菌株具有较广的抑菌谱；
2、将本发明所述菌株制成微生物菌剂后，对黄瓜腐霉病菌、甜瓜尖孢镰刀菌和番茄灰霉病菌三类植物病原真菌具有良好的生物防治效果，且防效均在80%以上，说明本发明菌株在田间对植物病原真菌具有较好的防治效果；
3、本发明所述哈茨木霉MSB1211菌丝以缠绕或平行生长等方式寄生于病菌菌丝上，病菌菌丝生长受到限制，菌丝变形和扭曲，从而抑制植物病原真菌的生长，进行防治。
:
图1本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对黄瓜腐霉病菌的抑制效果 图2本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对甜瓜尖孢镰刀菌的抑制效果 图3本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对番茄灰霉病菌的抑制效果 图4本发明的哈茨木霉菌株MSB1211对黄瓜腐霉病菌的重寄生作用
具体实施例方式
本发明公开了一种高抗真菌活性的哈茨木霉菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的木霉已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1 土样的采集和本发明哈茨木霉菌株的分离
1、样品采集
样品采集自河北饶阳黄瓜田间根际土壤。用取土器材拨开田间3_5cm的表土层,将土壤连同植物的根系一起挖出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。2、哈茨木霉菌株MSB1211的分离获取
将粘附土壤的根系稍风干，轻·拍根系，使粘附在上面的土壤脱落，用无菌水梯度稀释，分别吸取0.1mL稀释液滴入到TSM培养基平板基(MgSO4,.7H20 0.2 g，KH2PO4.3 H2O 0.9g, KCI 0.25 g, NH4NO3L O g，葡萄糖 3.0 g,玫瑰红 0.15 g，氯霉素 0.25 g，琼脂 18.0 g,蒸馏水I 000 mL, pH 6.8 7.0)上，用灭菌的L形涂布棒涂布均匀，置于25_28°C的恒温培养箱中培养3-4天。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到PDA平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到I3DA斜面上。筛选:在同一 PDA平板上接种哈茨木霉已纯化木霉菌株菌饼并与病原菌菌饼进行对峙培养(两个菌饼中心的垂直距离为7cm)，25-28°C的恒温培养箱中培养3_4天，观察并统计抑制率，各3次重复。选择一个抑制作用最强的菌株，即本申请所涉及的上述哈茨木霉菌株，将其命名为MSB1211。实施例2本发明哈茨木霉菌株的鉴定 I形态学鉴定
根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法，采用PDA培养基培养真菌，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，将5mm MSB1211菌株的菌丝块接种到PDA培养基上，28°C恒温培养24h后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌落扩展较快，培养72h菌落直径为68mm，菌丝层较厚，致密绒状，菌落初期为白色，后期因产生孢子而呈绿色。菌落背面初为无色，后期成黄褐色。在显微镜下观察，菌丝透明，有隔，内含物丰富，细胞壁光滑，菌丝生长端呈椭圆形。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，对生二至三级分枝，分枝与分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶体端部尖削，微弯，尖端生分生孢子，表面光滑。根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法初步鉴定菌株MSB1211为木霉属{Trichoderma )。2分子生物学鉴定
ITS鉴定:将筛选菌株的孢子液接入TOB液体培养基中，28°C摇床培养48 h，过滤获得菌丝，提取真菌基因组DNA。以提取的真菌DNA作为模板，以ITS5和ITS8引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μ 1，反应体系为:基因组DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L，NSl 弓丨物 I μ L, NS8 弓丨物 I μ L, dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反应条件为:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循环 30 次；72°C 10 min。PCR 扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列，输入NCBI，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用DNAman进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，本发明所分离的菌株属于木霉属哈茨木霉。
表I MSB1211菌株ITS序列同源比对结果
权利要求
1.一种哈茨木霉菌(Tri choderma harzianum ),其特征在于，保藏编号为CGMCCN0.7230，其于2013年I月28日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉菌在防治植物真菌病害的用途。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述植物真菌病害的真菌病原体为腐霉病菌{Pythium spp.)、键刀菌(/7W1Sari應 spp.)或灰霉病菌cinerea )
4.根据权利要求3的用途，其特征在于，所述植物真菌病害为黄瓜腐霉病菌{Pythiimaphani derma turn)、甜瓜尖抱键刀菌 ifusari um oxysporum )、番爺灰霉病菌 iBo tryti scinerea)。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，将权利要求1所述的哈茨木霉菌接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25°C -30°C、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3_4天，并调节孢子浓度为IXlO6个/mL，即制得所述哈茨木霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵:将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将IOmL上述哈茨木霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25°C _30°C发酵培养3-4天后制得微生物菌剂。
6.一种生物肥，其特征在于，将权利要求5的微生物菌剂与有机肥料、大量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2:3:5 ;所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述大量元素肥料为氮月巴、磷肥或钾肥。
7.根据权利要求6的生物肥，其特征在于，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾。
8.—种生物肥，其特征在于，将权利要求5的微生物菌剂与有机肥料、微量元素肥料相混合制得，三者的重量比为2:3:5 ;所述有机肥料为堆肥或沼气肥，所述微量元素肥料为选自碳酸锰锌、硼镁肥、钥酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或几种。
全文摘要
本发明涉及一种防治植物真菌病害、促进植物生长的高效哈茨木霉菌。本发明所述哈茨木霉菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7230。本发明涉及的哈茨木霉菌具有较高的抑制植物病原真菌生长的能力，不污染环境，生态安全，能够广泛应用到植物病原致病真菌，特别是腐霉病菌(Pythiumspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的防治，是一株在瓜果蔬菜和农作物生物防治中有较高应用价值的菌株。该高效哈茨木霉菌单独使用或与其它植物生长所需要的有机、无机营养成分一起使用,制备成的生物复合肥料具有显著的促生长，抗早衰，防病，增加提高产量和改良品质量的作用。
文档编号C05G3/00GK103146586SQ201310075968
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月11日 优先权日2013年3月11日
发明者赵斌, 董金皋, 赵巍 申请人:赵斌, 董金皋, 赵巍