技术领域：本发明涉及一种室内高通量玉米粗缩病人工接种鉴定方法及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
：玉米粗缩病是危害玉米的一种世界性病毒病害，由呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fjivirus)的水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)、马德里约柯托病毒(MaldeRioCuartovirus，MRCV)和玉米粗缩病毒(Maizeroughdwarfvirus，MRDV)三种病毒引起。经对我国玉米粗缩病分离物测序比对研究确认引起我国玉米粗缩病的病原物为水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)，该病历史上曾先后多次在我国玉米上暴发流行，据统计，2005年以来在河北、山东、山西、江苏等省的夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米上发生危害严重；2008年山东省发生面积达73.3万hm2，绝产1.67万hm2；同年在大连市也大面积发生，重病田块发病率达60％-80％，造成了巨大的经济损失，目前，粗缩病已经成为我国玉米上主要病害之一，对玉米生产构成了严重威胁。目前玉米粗缩病防治的主要措施是调整播期，其在病害防治中发挥了重要作用。但播期调整在地区间、品种间有其局限性，尤其是鲜食玉米上由于市场需求限制了播期调整的空间，因此培育并利用抗病品种成为玉米粗缩病防控上的新需求。大规模筛选玉米种质资源是培育抗性品种的基础，对候选种质资源进行抗性鉴定是必须措施。目前对玉米粗缩病进行种质资源鉴定主要有自然鉴定法和室内人工接种鉴定法两种。前者因其受到自然条件的约束，容易受环境条件、灰飞虱种群发生迁飞数量、带毒率差异等因素的影响，使得鉴定结果在地区间和年度间差异较大，必须经多年多点重复鉴定才能获得准确结果，不但增加了工作量，而且加长了育种时间；后者在前者基础上，根据该病由灰飞虱刺吸并以持久性方式间歇传播的特点发展起来的一种室内人工接种鉴定方法，而由于种质资源的鉴定需要大量的传毒灰飞虱，灰飞虱人工饲养成本高，饲毒步骤复杂且毒源获得时间有限导致带毒灰飞虱难以获得，难以满足抗性鉴定的规模量需求，从而大大限制了灰飞虱人工接种鉴定的推广应用。本实验室经过多年对灰飞虱及其传播病毒的研究，已经发明了一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法(专利号：ZL201210385208.0)，该方法可常年不间断获得大量高带毒率灰飞虱，满足了室内人工接种鉴定大量接种体的需求；另外经摸索创建了一套关于该病的高通量室内人工接种鉴定方法，该方法有效地掌握了玉米接种的敏感期，确定了适合的接种量和恰当的接种时间，从而大大提高了接种效率和精准度，节约了试验成本，为玉米抗粗缩病的资源发掘筛选、品种选育和抗性遗传规律研究等提供了有效的技术手段。
技术实现要素：
：本发明针对目前玉米粗缩病自然接种鉴定准确性低而人工接种鉴定带毒灰飞虱规模量难以实现等难题，提供了一种室内高通量玉米粗缩病人工接种鉴定方法。本发明的特征在于：在室内条件下，利用常年室内人工饲养的带毒灰飞虱为接种体，一定规模数量的玉米种子在一种特定接种器中，于萌芽初期接种对应数量的接种体，接种一定时间后，移植于盆钵或大田中培养至发病显症，以发病率高低评价待测玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平。在上述方法中，“常年室内人工饲养的带毒灰飞虱”为根据专利“水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法(专利号：ZL201210385208.0)”的方法在室内常年人工饲养的带毒率在30％以上的灰飞虱群体。所述的“一定规模数量的玉米种子”是指单个容器中播有效的玉米种子10～100粒。所述的“一种特定接种器”是指内径4.5～10cm，高6～14cm的圆形或方形透光容器。所述的“于萌芽初期接种对应数量的接种体”中“萌芽初期”是指玉米种子萌动至第一张叶片顶出芽鞘前；“对应数量的接种体”是根据接种时种子萌发时间长短和玉米种子的数量接入相应数量的灰飞虱，平均接种带毒虫量为0.1头/株至0.9头/株。所述的“接种一定时间”是指接种玉米49～72小时。与已有玉米粗缩病鉴定技术相比，本发明提供的一种室内高通量玉米粗缩病人工接种鉴定方法，其有着诸多优点。首先，接种体大量高带毒灰飞虱室内长期活体的保存有效地克服了灰飞虱从患病植株获毒其植株难以长期保存的技术瓶颈，拓宽了鉴定的时间，满足了种质资源鉴定接种体量的需求；其次，特定接种容器“内径4.5～10cm，高6～14cm的圆形或方形透光容器”因其较强的透光性保证了一定规模玉米种子的健康生长；再次，反复试验掌握了玉米萌芽初期为接种的敏感期，确定了有效接种虫量为0.1头/株～0.9头/株，接种时间为49～72小时，大大提高了接种效率。这一鉴定方法不仅实现了玉米粗缩病室内人工接种鉴定的高通量需求，应用于玉米资源的发掘和选育、抗性应用评价，还可应用于抗病基因定位的表型鉴定及抗性遗传规律研究等众多领域，从而为玉米研究提供了强有力的技术支撑。具体实施方式：下面通过具体实施例来进一步说明本发明，所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中饲养灰飞虱和人工接种的基础设施如下：具有调温和光照设备的养虫室，使温度保持在25～28℃之间并保证每天12h的光照时间；50～1000mL的玻璃烧杯、尼龙纱布(网眼规格1mm)、不锈钢养虫架、微电脑时控开关、饲喂灰飞虱的水稻和小麦种子(水稻：武育粳3号；小麦：扬麦158)；转移灰飞虱用的黑布、毛笔、吸虫器等。实施例1，玉米品种对玉米粗缩病抗性的室内人工接种鉴定方法①一定规模高带毒(RBSDV)灰飞虱的获得。根据专利“水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法(专利号：ZL201210385208.0)”中的方法在养虫室内常年获得高带毒率灰飞虱(带毒率30％以上)，再利用专利“一种室内大量饲养灰飞虱的方法(专利号：ZL201410298198.6)在室内大规模饲养高带毒灰飞虱，即可获得一定规模的高带毒(RBSDV)灰飞虱。研究表明10m2养虫室可在室内一批饲养50000头左右，带毒率30％以上的灰飞虱。②接种器具的确定采用100、200和300mL塑料杯、50、250、500和1000mL玻璃烧杯等进行玉米种子育苗试验，经比较不同容器中玉米种子发芽率有差异，但差异不显著，因此可根据需要进行选择，即选用内径4.5～10cm，高6～14cm的透明容器为育苗接种器具。③接种量的确定接种强度按有效接种虫量(有效接种虫量＝接种虫量×带毒率)设置0.1～0.9头/株共9个处理，重复3次。将感病品种苏951的36粒种子浸泡于250mL烧杯中，24h后将水倒掉用清水冲洗种子2～3遍，播于50mL铺有1/4细沙的烧杯中，12粒/杯，置于温度25℃，光照12h的光照培养箱中生长。待玉米种子萌动至第一张叶片顶出芽鞘时进行接种鉴定(接种前淘汰长势弱的种子，挑选生长一致的10株用于接种鉴定)。接入灰飞虱后每天赶虫2次以确保被测玉米均匀获毒，接种49h后移走灰飞虱，将被测玉米苗移栽至大田，正常水肥管理。30天后开始调查发病率，每7天调查一次，连续调查3次。症状主要表现为植株矮化，叶色浓绿，叶片僵直、宽短而厚，心叶不能正常展开，叶片背部叶脉上产生蜡白色隆起条纹，用手触摸有明显粗糙感。实验表明不同接种强度下玉米品种苏951的发病情况如表1。随着接虫强度的增加，苏951的发病率有所提高，有效接种强度为0.1～0.9头/株处理间没有明显差异，在此接种苗龄期，接种量可确定为0.1～0.9头/株。表1不同接种强度下玉米品种苏951的发病情况注：不同字母表示方差分析在1％(大写)水平上差异极显著(表2、表3和表4同)。④接种苗龄的确定接种苗龄设置芽鞘期(种子萌动至第一张叶片顶出芽鞘)、2叶1心期、4叶1心期3个处理，选用感病品种苏951，每个处理有效苗10株，重复3次。接种强度为有效接种虫量0.1头/株、0.5头/株、1头/株和2头/株4个处理，做一个正交试验。接种及调查方法同上。玉米不同龄期接种不同数量的灰飞虱发病情况如表2。当玉米接种龄期处于芽鞘期时，接种强度为0.1头/株、0.5头/株、1头/株和2头/株4个处理时发病率在90％以上，各不同接种强度间不存在显著性差异；而随着接种苗龄的增加，接种强度也需相应增加。综合考虑苗龄的敏感期和节约虫量的原则确定接种苗龄为芽鞘期，即在种子萌动至第一张叶片顶出芽鞘时接种较为适宜。表2不同龄期玉米接种不同数量的灰飞虱发病情况⑤接种时间的确定接种时间设置24h、48h、72h和96h共4个处理，选用感病品种苏951，每个处理有效苗10株，重复3次。接种强度为有效接种虫量0.5头/株，接种苗龄为芽鞘期，接种及调查方法同上。不同接种时间下品种苏951的发病情况如表3。随着接虫时间的增加苏951的发病率亦不断提高，结果表明接种48h、72h和96h三个时间段发病率间没有显著性差异，所以芽鞘期时接种时间确定为49～72h。表3不同接种时间下玉米品种苏951的发病情况⑥接种规模根据①中提及的本室现有养虫室一批次可饲养50000头左右，带毒率30％以上的灰飞虱，结合②、③、④确定的接种苗龄芽鞘期，接种强度0.1头/株，接种时间72h计算下来，每批次可接种50000(头)×30％(带毒率)÷0.1(头/株)＝150000株玉米苗。本发明主要服务于针对玉米粗缩病开展的抗性资源筛选发掘、抗病品种的鉴定、评价和选育。同时该项技术还可在植物抗病性的遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒转基因的研究工作中，作为精准的生物学检测方法，将能大大加快该领域研究的进程。实施例2，人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较选择河南开封重病区作为鉴定圃，于2015年5月23日播种玉米品种郑单958。苗期玉米上灰飞虱虫量为420/100株，带毒率3.5％。于田间第1次发病高峰期调查发病情况，7天重复调查1次，计算发病率。人工接种鉴定与田间鉴定结果见表4。玉米品种郑单958的人工接种鉴定与重病区田间鉴定结果间无显著差异，说明本研究建立的人工接种鉴定方法能够模拟重病区田间鉴定效果，其抗性评价结果可靠。表4人工接种鉴定与田间鉴定结果上述实施不以任何形式限定本发明。