一种独蒜兰多倍体植株的培育方法与流程

本发明涉及一种独蒜兰的培育方法，特别涉及一种独蒜兰多倍体植株的培育方法。

背景技术：

兰科植物独蒜兰(Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)的干燥假鳞茎，是中药山慈菇的主要来源之一。2010年版《中国药典》记载山慈姑的主要来源为兰科植物杜鹃兰(Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、独蒜兰(Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)或云南独蒜兰(Pleione yunnanensis(Rolfe)Rolfe)的干燥假鳞茎。前者习称“毛慈姑”，后二者习称“冰球子”，均作为山慈姑使用。其味甘、微辛、性凉，具有清热解毒，消肿散结的功效，主要用于痈肿疔毒、瘰疬痰核、淋巴结结核、蛇虫咬伤等。近年来，由于过度采挖，独蒜兰的自然储量急剧下降，现已呈濒危状态；同时，在自然状态下，其种子由于发育不成熟以及自身不透水、不透气等原因而极难萌发。独蒜兰正面临着资源短缺的严峻现实。

独蒜兰种质的好坏是影响独蒜兰产量重要的因素。因此，加强独蒜兰优良品种的选育至关重要。多倍体植物在自然界中是普遍存在的，由于它们在生理上较普通植物有更强的适应性和遗传上有较大的可塑性，使得育种学家自20世纪30年代开始就热衷于多倍体诱导育种的研究。目前多倍体诱导育种工作在农作物、果树、蔬菜、花卉等领域广泛开展，取得了很好的成绩，如目前多倍体马铃薯、西瓜等都已经投入到生产应用中，已经带来了巨大的经济效益和社会效益。药用植物多倍体育种工作开展得也比较早，自从1937年布莱克斯里用秋水仙素处理曼佗罗获得多倍体，半个多世纪以来，育种学家对多种药用植物进行了多倍体育种的研究，培育了许多高产优质新品种，现今，已在卷叶贝母、青蒿、金银花、罗勒、丹参、紫锥菊、黄芪等药用植物上诱导成功。药用植物多倍体具有以下的优点：

1.生物产量提高

药用植物大多以收获根、茎、叶等营养器官为主，具有巨大性的特点，药用植物可以利用其优势来提高药材产量。川黄柏同源四倍体较原植物叶子宽大而厚实，茎杆粗壮；四倍体决明种子比二倍体决明种子增重70％；S.Amiri等研就表明多倍体曼陀罗叶片宽大，植株干重、叶绿素含量较原植物高。

2.抗逆性提高

多数的多倍体对外界环境条件具有较强的适应性，多倍体植株茎秆粗壮故能较好的抗倒伏有的还有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如张笑艺对不同倍性的盾叶薯蓣进行高温抗性研究，测定叶片内与高温胁迫相关的各项生理指标，表明四倍体盾叶薯蓣对高温胁迫具有更好的耐受性。

3.药用活性成分含量高

药用植物的多倍体育种一方面要提高产量，另一方面应使药用植物内的化学药效成分含量明显增加，并且可增添新的药效成分。例如，有研究表现盾叶薯蓣的同源四倍体中有效成分薯蓣皂苷的含量比原植物高1.2倍左右。

随着生物技术的发展，药用植物的多倍体育种工作也取得了较大的进展，获得了一些多倍体新品种，以其速生、优质、高抗逆性等特性在生产上取得了较好效果。药用植物多倍体育种拓宽了种质资源，防止了由于长期的栽培而导致的药用植物品种退化。可以预见，生物技术在中药材品种改良方面具有很好的应用前景，将随着人类对其应用价值认识的提高，以及有关新技术方法的应用，从而带动未来药用植物的可持续、高效发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种独蒜兰多倍体植株的培育方法，利用该方法可以获得具有四倍体特征的独蒜兰植株，且操作简单，适合规模化生产。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种独蒜兰多倍体植株的培育方法，包括以下步骤：

(1)将消毒后的独蒜兰种子抖入秋水仙素溶液中，黑暗条件下培养6～8d后，离心、洗涤去除秋水仙素；

(2)将步骤(1)处理过的独蒜兰种子转接到独蒜兰种子萌发培养基中，先于培养箱中黑暗条件下培养5～6d，再移至培养室，培养温度23～27℃，光照度2000～2500lx，光照12h/d，培养三个月得到多倍体独蒜兰幼苗；

(3)将步骤(2)培养得到的独蒜兰幼苗，转接到独蒜兰增殖培养基中进行稳定扩繁，选取2～3代性状稳定的植株进行多倍体的鉴定；

(4)鉴定为多倍体的植株转接到生根壮苗培养基中进行培养，即获得独蒜兰多倍体植株的幼苗。幼苗在生根壮苗培养基中待根长到2cm以上时，打开瓶盖，至于室温下培养2～4天后，取出小苗，洗去根部培养基，栽入营养土中，浇透水，并用塑料薄膜覆盖一周后去除地膜，定期进行浇水施肥等管理，直至长成独蒜兰四倍体植株，球茎巨大。

步骤(1)独蒜兰种子的消毒方法可如下：取独蒜兰蒴果，用0.1％洗衣粉溶液浸泡8～10min，自来水冲洗5～15min，然后用75％乙醇消毒2～3min，无菌水冲洗，0.1％升汞消毒15～20min，无菌水冲洗，无菌吸水纸将蒴果表面残留的水吸干，消毒后的独蒜兰蒴果切开即获得消毒后的独蒜兰种子。

步骤(1)独蒜兰种子的消毒方法还可如下：独蒜兰蒴果切开，取独蒜兰种子，加入75％乙醇，10s后立即加入无菌水，离心或过滤，取独蒜兰种子加入0.1％升汞溶液，5min后加入无菌水，离心或过滤，取独蒜兰种子用无菌吸水纸上吸干，即得消毒后的独蒜兰种子。具体可如下：直接取独蒜兰种子，每100～200mg的种子中加入0.5～1mL的75％乙醇，10s后立即加入30～50mL的无菌水，1000～1500rpm离心2～5min使种子沉淀，去除液体，或者用无菌滤膜过滤出独蒜兰种子，之后加入0.5～1mL的0.1％升汞溶液，5min后加入，30～50mL的无菌水，1000～1500rpm离心2～5min使种子沉淀，去除液体，或者用无菌滤膜过滤出独蒜兰种子，无菌吸水纸上将残留的水吸净，可得无菌独蒜兰种子。

作为优选，步骤(1)中，所述秋水仙素溶液的pH为5.8～6.2，其中秋水仙素的质量浓度为0.1～0.4％，秋水仙素溶液的溶剂为1/2MS液体培养基或MS液体培养基。

作为优选，所述秋水仙素溶液中还添加有0.1mg/L-1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤。

作为优选，步骤(2)中，所述独蒜兰种子萌发培养基组成如下：1-萘乙酸0.2～0.5mg/L，pH 5.8～6.2，溶剂为1/2MS液体培养基或MS液体培养基。作为优选，步骤(3)中，所述独蒜兰增殖培养基组成如下：6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L，1-萘乙酸0.1～0.5mg/L，pH 5.8～6.2，溶剂为1/2MS液体培养基或MS液体培养基。

作为优选，步骤(4)中，所述生根壮苗培养基组成如下：1-萘乙酸0.5～0.6mg/L，香蕉汁5～10％(v/v)，pH 5.8～6.2，溶剂为1/2MS液体培养基或MS液体培养基。

作为优选，所述香蕉汁制备方法为：去皮香蕉切片后加水煮沸20min，按照去皮香蕉重量定容后过滤即得；按照去皮香蕉重量定容的标准为300g去皮香蕉定容至1L。

本发明的有益效果是：本发明利用独蒜兰种子为材料获得的独蒜兰多倍体植株，具有显著的多倍体特征，且制备方法简单，对独蒜兰新品种的培育工作具有重要的指导意义，本发明获得的独蒜兰多倍体具有较高的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤4)流式分析结果，a为二倍体独蒜兰，b为本发明所制备的四倍体植株。

图2为实施例1步骤5)生根壮苗后得到的植株，a为本发明所制备的植株，b为二倍体独蒜兰植株。

图3为实施例1步骤5)得到的独蒜兰多倍体幼苗的气孔大小结果，上部为二倍体独蒜兰，下部为本发明得到的多倍体独蒜兰植株，10×40倍镜下单个视野中的气孔数目和大小。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

在本发明中，MS液体培养基的配方举例如下：

大量元素母液：NH₄NO₃ 16.5g；MgSO₄·7H₂O 3.7g；KH₂PO₄ 1.7g；KNO₃ 19g，加水溶解，定容至500mL；

钙盐母液：CaCl₂ 3.32g，加水溶解，定容至500mL；

微量元素母液：KI 0.0415g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.0125g；H₃BO₃ 0.31g；CuSO₄·5H₂O 0.00125g；MnSO₄·H₂O 0.845g；CoCl₂·6H₂O 0.00125g；ZnSO₄·7H₂O 0.43g，加水溶解，定容至500mL；

铁盐母液：EDTA二钠3.725g，加100mL水加热溶解，FeSO₄·7H₂O 2.785g，加100mL水溶解后两者混匀，加水配成500mL；

维生素母液：盐酸吡哆醇(VB₆)0.025g；盐酸硫胺素(VB₁)0.025g；烟酸0.025g，甘氨酸0.1g，加水溶解，定容至500mL；

配1L MS液体培养基：取大量元素母液50mL，钙盐母液50mL，微量元素母液10mL，维生素母液10mL，铁盐母液5mL，加肌醇0.1g，蔗糖或白砂糖20～30g，蒸馏水定容至1L。

1/2MS液体培养基指溶液中所含的大量元素和钙盐为MS的一半，其他不变。

实施例1：

1)取独蒜兰蒴果一个，用0.1％洗衣粉溶液浸泡10min，用自来水冲洗5min。然后用75％乙醇消毒2min，无菌水冲洗，0.1％升汞消毒15min，无菌水将残留的升汞冲洗干净，无菌吸水纸将蒴果表面残留的水吸干；

2)将独蒜兰蒴果切开，取蒴果中的种子接入0.1％秋水仙素溶液中(以1/2MS为溶剂)，黑暗条件下培养7d。处理完毕后，1000rpm离心1min使种子沉淀，取种子，用无菌蒸馏水洗涤三次，得到初步萌发的独蒜兰种子；

3)将上述秋水仙素处理过的独蒜兰种子转接到MS+0.2mg/L 1-萘乙酸的培养基中，放在培养箱进行暗培养5d，再移至培养室，培养温度(25±2)℃，光照度2000～2500lx，光照12h/d，培养三个月得到多倍体独蒜兰幼苗；

4)将上述培养得到的独蒜兰幼苗，挑选出茎变粗、叶片加厚、叶色加深等外观形态特征的植株，转接到MS+1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.1mg/L 1-萘乙酸的培养基中进行稳定扩繁，相同培养基中续代培养2～4代，2～3代后若性状仍稳定，则进行多倍体的鉴定；

具体步骤为：于上午8～9时取多倍体以及普通独蒜兰组培苗植株的根尖，立即将材料放进0.002mol/L 8-OH喹啉溶液，在4℃下预处理4～6h，蒸馏水清洗3遍，在4℃下，卡诺氏液(冰醋酸：无水乙醇＝1:3，混匀，现用现配)在4℃下固定24h，蒸馏水漂洗3次，每次10min，用1.0mol/L的盐酸常温解离15～20min，至除根尖外根段透明呈黄色时为宜，将根尖置于蒸馏水中低渗处理约30min或更长时间，用改良苯酚品红溶液和醋酸洋红溶液进行染色，30min后压片，压至根尖分开成云雾状，镜检观察多倍体植株2n＝4X＝84，普通独蒜兰植株2n＝2X＝42，确定所得到的为四倍体植株。

多倍体的鉴定染色体中流式分析的具体内容如下：

(a)细胞核提取液的配制

组成为15mM Tris；80mM KCl；20mM NaCl；20mM EDTA-Na₂；15mMβ-巯基乙醇；4mM MgCl₂·6H₂O；0.1％Triton X-100；PH7.5。

(b)制备RNA酶及染色液

将RNA酶A溶于10mmo1/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmo1/L NaC1中，配成10mg/mL的溶液，于100℃水浴中加热15min，缓慢冷却至室温后分装成小份，保存于-20℃中。碘化丙锭(propidium iodide，PI)及RNase(DNase-free)加入到细胞核提取液中，使其终浓度为100μg/mL，现配现用。

(c)处理材料及结果分析

取独蒜兰多倍体叶片以及普通独蒜兰叶片各1g左右，加入1.8mL冰浴预冷的细胞核提取液，在培养皿里用锐利的眼科剪快速将其剪碎，以二倍体独蒜兰叶片作对照。然后经350目尼龙网过滤至1.5mL离心管中，4℃条件下，1000rpm离心5min，吸取上清液200～300μl，加入等体积上述染色液，悬起，暗处染色5-15min，进行流式细胞仪检测及软件分析，发现对照组即普通独蒜兰含2C DNA，多倍体独蒜兰含4C DNA(图1)，进一步表明本发明所得到的独蒜兰多倍体植株为四倍体植株。

按照本发明方法得到的独蒜兰四倍体幼苗，其特征如下：与二倍体独蒜兰相比，叶片明显变厚，颜色变深，整个植株形态上明显比二倍体独蒜兰粗大(图2)，4×100倍镜下单个视野气孔数目为5±0.907(二倍体14±4.90)，保卫细胞长和宽分别为2.111±0.231、1.867±0.239(二倍体独蒜兰保卫细胞长和宽分别为1.414±0.408、1.083±0.427)(图3)。

5)将四倍体独蒜兰转接到MS+0.5mg/L 1-萘乙酸+10％香蕉汁的培养基中，待根长到2cm以上时，打开瓶盖，至于室温下2～4天，取出小苗，洗去根部培养基，栽入营养土中，浇透水，并用塑料薄膜覆盖一周；

6)上述独蒜兰苗在地膜覆盖一周后去除地膜，定期进行浇水施肥等管理，三年后长成独蒜兰四倍体植株，取其中一棵植株，测得株高：66cm，球茎直径为：5cm。叶1片，长39cm，宽4.5～7.0cm，球茎重43g，整个植株重128g，蒴果长2.5cm，直径0.7cm。

实施例2：

具体步骤如实施例1所述，不同的是步骤2中的秋水仙素浓度为0.20％，处理时间为9d，变异率为41.07±1.34％。

本发明所获得的多倍体独蒜兰植株具有能显著提高单个球茎的重量，植株形态特征为：株高40～70cm，花葶长15～40cm，叶1片，长35～55cm，宽5～9cm。蒴果长3～5cm，直径0.7～1.5cm。蒴果平均重1200～1800mg，最大蒴果重2300mg，单个球茎重25～45g，直径3～5cm。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。