本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种嘉兰百合快速繁殖的方法。
背景技术：
嘉兰百合(Gloriosa superba Linn)属百合科嘉兰属攀援性草本植物，原产于我国云南省南部、海南省及亚洲非洲热带地区，我国云南西双版纳海拔1200m以下有野生零星分布。花姿奇特，犹如燃烧的火焰，色彩艳丽而高雅；花色变幻多样，花期较长，是一种极具观赏价值的草本花卉。因富含秋水仙碱，其块茎是生产秋水仙碱的理想原料之一。嘉兰百合的繁殖方式有种子繁殖、块茎无性繁殖和组培繁殖。由于嘉兰百合的种子繁殖困难且生长缓慢，需3~4年才能开花，通常采用其地下块茎进行无性繁殖。然而，嘉兰百合的繁殖系数非常低，每株只能形成1个块茎，每个块茎只有2个芽，严重制约了嘉兰百合的规模化生产。采用常规组培繁殖技术生产的组培苗，则面临着过渡移栽成活率低，且后期生长缓慢，培养周期长等问题。也由于嘉兰百合是百合科嘉兰属，而常见的百合品种是百合科百合属，由于不是一个属的植物，其繁殖差异极大，不具有参考价值。因此以常规的繁殖方法难以满足嘉兰百合的规模化快速生产。
技术实现要素：
针对嘉兰百合种子繁殖困难、块茎繁殖系数低、组培繁殖移栽后期生长缓慢、时间长等问题，本发明提供一种嘉兰百合快速繁殖的方法，通过改进生产流程和培养基配方，提高嘉兰百合繁殖系数，快速生产大量优质块茎，以满足优质种苗的大规模生产需要。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种嘉兰百合快速繁殖的方法，包括如下步骤：
A、外植体的选择与灭菌：选取生长健壮且未形成花芽的茎尖和/或腋芽为外植体，剥去外层叶片，切成长为1.5~2.0cm的小段，清洗干净并消毒，然后用无菌水漂洗至无消毒剂残留；
B、不定芽诱导培养：将经过A步骤消毒灭菌后的小段接种于不定芽诱导培养基中，在培养温度为27±2℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为10～12h/d的条件下，诱导培养20~40d直至外植体萌发分化出0.5~1.5cm长的不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：MS培养基+6.0mg/L~8.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/L~0.05mg/L萘乙酸+6.5g/L~7.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8~6.0；
C、不定芽继代增殖培养：将B步骤的不定芽在无菌条件下切下置于增殖培养基中，在培养温度为27±2℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为10～12h/d的条件下进行继代培养，获得带有茎盘的不定芽；
所述的增殖培养基MS培养基+4.0mg/L~5.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.05mg/L~0.1mg/L萘乙酸+琼脂6.5g/L~7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8~6.0；
D、块茎培养：将C步骤获得的带有茎盘的不定芽在无菌条件下切成不定芽和茎盘两部分，切下的不定芽返回接种至C步骤的增殖培养基中，再次进行继代培养；而切下的茎盘去除根、茎、叶后，将其分割成2~4块接种至块茎培养基中，在培养温度为27±2℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为10～12h/d的条件下进行块茎培养50~60d，待块茎长至直径1.0~1.5cm即可出瓶下地种植；
所述的块茎培养基为：MS培养基+1.0mg/L~1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.1mg/L~0.5mg/L萘乙酸+6.5g/L~7.0g/L琼脂+60g/L蔗糖，pH5.8~6.0；
E、移栽：将D步骤出瓶的块茎按常规洗净块茎上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至质量比为红土：腐叶土=1︰1的营养基质中，需40%~45%的遮阴度，按常规进行浇水、施肥管理，生长40~60d后发芽出苗，即可得到嘉兰百合种苗。
进一步，优选的是，步骤A中所述的清洗和消毒的具体方法是用常规的加有洗涤剂的水清洗后，在质量浓度为0.1%的升汞溶液中消毒7~10min，再在质量浓度为0.3%的次氯酸钠溶液中消毒3~5min，然后用无菌水漂洗3~4次。
进一步，优选的是，所述的继代周期为20~30d，继代3~5代，可获得大量带有茎盘的不定芽。
进一步，优选的是，步骤D中，切下的茎盘去除根、茎、叶后，将其分割成2~4块，每块粒径为0.3~0.5c
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、与种子繁殖技术相比，本发明繁殖容易且缩短了生长周期。嘉兰百合种子繁殖困难，其种皮较硬、厚，种子萌发率低，出苗不整齐，且出苗时间长，需要3~4年才能开花。而本发明繁殖容易，繁殖系数高可达6~8倍，进种率可达90%，移栽成活率在95%以上。
2、与现有的常规组培繁殖方法相比，本发明的出瓶移栽成活率高，更易于养护管理。目前，现有的常规组培繁殖方法是通过不定芽诱导，然后进行不定芽增殖从而获得组培苗，繁殖系数可达4~5倍，但是过渡移栽的成活率低，仅60%左右，且后期生长速度慢。本发明通过不定芽诱导、增殖，然后通过不定芽诱导产生小块茎，经过50~60d培养后获得约1.0~1.5cm的块茎，出瓶移栽后成活率高，可达95%；后期生长速度快，而且还可生长出3~5个芽，大大提高了繁殖效率，经济效益显著增加，同时便于栽培管理。
3、本发明方法建立了不定芽诱导，然后通过不定芽诱导产生块茎的嘉兰百合繁殖体系，同时通过激素、营养、培养环境的综合调节，解决了嘉兰百合繁殖系数低、生产周期长的难题，达到了进种率高、增殖速度快，生产技术稳定的目的，实现了嘉兰百合规模化、标准化、工厂化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
A．外植体的选择与灭菌：选取生长健壮且未形成花芽的茎尖和腋芽为外植体，剥去外层叶片，切成1.5~2.0cm的小段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗后，在质量浓度为0.1%的升汞溶液中消毒7min，再在质量浓度为0.3%的次氯酸钠溶液中消毒5min，然后用无菌水漂洗4次，每次2min，然后用无菌滤纸吸干，备用；
B、不定芽诱导培养：在无菌条件下，将经过A步骤消毒灭菌后的小段接种于下列诱导培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 6.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.01mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养40d直至外植体萌发分化出0.5~1.5cm不定芽；
C、不定芽继代增殖培养：将B步骤的不定芽在无菌条件下切下置于下列增殖培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)4.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.05mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，继代周期为30d，继代3代，获得大量的带有茎盘的不定芽；
D、块茎培养：将C步骤获得的带有茎盘的不定芽在无菌条件下切成不定芽和茎盘两部分，切下的不定芽返回接种至C步骤的增殖培养基中，再次进行继代培养；而切下的茎盘去除根、茎、叶后，将其分割成2~4块（每块粒径为0.3~0.5cm大小）接种至下列块茎培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.1mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为10h/d的条件下进行块茎培养60d，待块茎长至直径约1.0cm即可出瓶下地种植。
E、移栽：将D步骤出瓶的块茎取出，按常规洗净块茎上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至质量比为红土：腐叶土=1︰1的营养基质中，需40%~45%的遮阴度，按常规进行浇水、施肥管理，生长40~60d后发芽出苗，即可得到嘉兰百合种苗。
实施例2
A．外植体的选择与灭菌：选取生长健壮且未形成花芽的茎尖和腋芽为外植体，剥去外层叶片，切成1.5~2.0cm的小段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗后，在质量浓度为0.1%的升汞溶液中消毒8min，再在质量浓度为0.3%的次氯酸钠溶液中消毒4min，然后用无菌水漂洗4次，每次2min，然后用无菌滤纸吸干，备用；
B、不定芽诱导培养：在无菌条件下，将经过A步骤消毒灭菌后的小段接种于下列诱导培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 7.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.03mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为11h/d的条件下，诱导培养30d直至外植体萌发分化出0.5~1.5cm不定芽；
C、不定芽继代增殖培养：将B步骤的不定芽在无菌条件下切下置于下列增殖培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)4.5mg/L+萘乙酸（NAA）0.08mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为11h/d的条件下进行继代培养，继代周期为25d，继代4代，获得大量的带有茎盘的不定芽；
D、块茎培养：将C步骤获得的带有茎盘的不定芽在无菌条件下切成不定芽和茎盘两部分，切下的不定芽返回接种至C步骤的增殖培养基中，再次进行继代培养；而切下的茎盘去除根、茎、叶后，将其分割成2~4块（每块粒径为0.3~0.5cm大小）接种至下列块茎培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.3mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为11h/d的条件下进行块茎培养55d，待块茎长至直径约1.0cm即可出瓶下地种植。
E、移栽：将D步骤出瓶的块茎取出，按常规洗净块茎上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至质量比为红土：腐叶土=1︰1的营养基质中，需40%~45%的遮阴度，按常规进行浇水、施肥管理，生长40~60d后发芽出苗，即可得到嘉兰百合种苗。
实施例3
A．外植体的选择与灭菌：选取生长健壮且未形成花芽的茎尖和腋芽为外植体，剥去外层叶片，切成1.5~2.0cm的小段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗后，在质量浓度为0.1%的升汞溶液中消毒10min，再在质量浓度为0.3%的次氯酸钠溶液中消毒3min，然后用无菌水漂洗3次，每次2min，然后用无菌滤纸吸干，备用；
B、不定芽诱导培养：在无菌条件下，将经过A步骤消毒灭菌后的小段接种于下列诱导培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 8.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.05mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为12h/d的条件下，诱导培养20d直至外植体萌发分化出0.5~1.5cm不定芽；
C、不定芽继代增殖培养：将B步骤的不定芽在无菌条件下切下置于下列增殖培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)5.0mg/L+萘乙酸（NAA）0.1mg/L+琼脂6.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，继代周期为20d，继代5代，获得大量的带有茎盘的不定芽；
D、块茎培养：将C步骤获得的带有茎盘的不定芽在无菌条件下切成不定芽和茎盘两部分，切下的不定芽返回接种至C步骤的增殖培养基中，再次进行继代培养；而切下的茎盘去除根、茎、叶后，将其分割成2~4块（每块粒径为0.3~0.5cm大小）接种至下列块茎培养基中：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L+琼脂6.8 g/L+蔗糖60g/L，pH=5.8，在培养温度为27℃，光照强度为2000～3000lx，日光照时间为12h/d的条件下进行块茎培养50d，待块茎长至直径约1.0cm即可出瓶下地种植。
E、移栽：将D步骤出瓶的块茎取出，按常规洗净块茎上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至质量比为红土：腐叶土=1︰1的营养基质中，需40%~45%的遮阴度，按常规进行浇水、施肥管理，生长40~60d后发芽出苗，即可得到嘉兰百合种苗。
对比试验：
1. 供试材料：嘉兰百合品种‘山里红’；
2. 试验方法：同实施例1；
3. 试验结果：
3.1 不同激素配比对不定芽诱导的影响
在供试的8个培养基配比中，诱导率差异大，6-BA浓度高时不定芽诱导效果较好。从表1可见，处理，当6-BA为8.0mg/L、NAA为0.01mg/L时诱导率最高，为92.1%；其次是处理，为85.0%。
表1 不同激素配比对不定芽诱导的影响
3.2 不同激素配比对不定芽增殖的影响
不定芽在不同激素浓度培养基中的生长情况见表2。6-BA浓度过高，不定芽生长细弱，玻璃化严重；当6-BA浓度在4.0~5.0mg/L时，不定芽增殖倍数高，植株生长正常。
表2 不同激素配比对不定芽增殖的影响
3.3 不同蔗糖浓度对块茎形成的影响
蔗糖浓度影响块茎的形成。蔗糖浓度低，块茎的形成率也低。从表3可见，当蔗糖浓度达60g/L时，块茎的形成率最高，达84%；
表3 不同蔗糖浓度对块茎形成的影响
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。