从多个大麦品种中筛选磷高效率利用品种的方法与流程

本发明属于大麦栽培与育种技术领域，涉及一种从多个大麦品种中筛选磷高效率利用品种的方法。

背景技术：

大麦是世界上最古老的农作物之一，距今已有数千年的栽培历史，是种植面积最大的粮食作物之一。全世界大麦播种面积在1970年代末约9600万公顷（24600万），年产量近18000万公吨，其播种面积和总产量仅次于小麦，水稻，玉米，居谷类作物第4位，主要作饲料，粮食，啤酒工业及医药工业原料和保健食品。大麦也是我国主要种植物之一，我国大麦的分布在栽培作物中最广泛，但主要产区相对集中，主要分布在长江流域，黄河流域和青藏高原。近年来，随着我国啤酒工业的迅猛发展，对啤酒大麦的需求越来越大。由于磷是植物生长必需的营养元素，也是植物体内重要化合物的组成成分，又以多种方式参加植物体内的各种生理和代谢过程，为了保证作物高产和稳产，就必须大量施用磷肥。但磷肥是一种不可再生资源，在大麦的生产过程中为了提高产量而提高磷肥的施用量，不仅浪费资源，又会带来很多环境问题。因此，筛选和培育耐低磷、磷高效率大麦新品种将是解决这些问题的理想途径。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种从多个大麦品种中筛选磷高效率利用品种的方法，通过全生育期砂培和苗期水培的结合，建立大麦可靠、简便的磷利用效率高的品种的筛选方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种从多个大麦品种中筛选磷高效率利用品种的方法，该筛选方法具体按以下步骤进行：

a）挑选饱满、籽粒大小一致的需要进行筛选的大麦品种，分别摆放在铺有滤纸的培养皿中，在光照培养箱中萌发至生根的幼苗；

b）砂培初筛：从步骤a）的每个大麦品种幼苗中挑选出2n株生长一致的幼苗，并将每个品种的幼苗分为两组，用两种不同磷浓度的营养液分别浇灌两组幼苗，直至大麦成熟；

c）分别测定每个品种的两组砂培苗的株高、穗粒数和千粒重，然后按相对性状值=低磷处理的测定值÷正常磷处理的测定值，计算每个品种的相对株高、相对穗粒数和相对千粒重；将计算得到每个大麦品种的相对性状进行排序，综合各相对性状值排名最终筛选出相对株高、相对穗粒数和相对千粒重三个指标数值综合最高的2-4个大麦品种为磷高效率利用品种，筛选出相对株高、相对穗粒数和相对千粒重三个指标数值综合最低的2-4个品种为磷利用效率较低的品种作为对照；

d）将步骤c）筛选出的磷高效率利用品种和磷低效率利用品种按步骤a）的方法萌发至生根的复筛幼苗，选取长势一致的2n株复筛幼苗，将每个品种的复筛幼苗分为两组，用两种不同磷浓度的营养液分别对两组复筛幼苗进行水培，培养三周后分别测定每个品种两组水培苗的干物质重、磷含量、叶绿素含量，然后按相对性状值=低磷处理的测定值÷正常磷处理的测定值，计算每个品种的相对干物质重、相对磷含量、相对叶绿素含量；

e）根据计算得出的多个大麦品种的相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量进行排序，综合各相对性状值排名最终筛选出相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量三个指标综合最高的1个大麦品种为磷利用效率相对最高的品种。

所述步骤b）中砂培试验容器采用29cm×19cm塑料盆，栽培基质由体积比1︰1的沙子和蛭石组成。

所述步骤b）中一组幼苗浇灌低磷水平的营养液，另一组幼苗浇灌正常磷水平的营养液；每隔一周用营养液浇灌一次，每次每盆浇灌营养液500mL，营养液浇后三天浇水一次，每次每盆浇水500mL。

所述步骤d）中的水培的方法为，用涂有防锈漆的铁丝将育苗盘底部朝上固定在周转箱上，移栽复筛幼苗置于育苗盘孔中，加水至与育苗盘底部相平；其中一组复筛幼苗浇灌低磷水平的营养液，另一组复筛幼苗浇灌正常磷水平的营养液，光照时间白天12h，夜间12h，白天最高温度32℃，夜间最低温度27℃；培养期间每天用浓度为1mol/L 的盐酸或1mol/L的氢氧化钠溶液调节培养液pH值至6.5，每两天更换一次营养液。

所述营养液的磷源为KH₂PO₄，用去离子水配制而成；每升低磷水平营养液中的氮含量为27mg，每升正常磷水平营养液中的氮含量为544mg/L，该两种水平营养液中的其它成分及含量均相同。每升营养液中含NH₄NO₃为2.50mmol/L、K₂SO₄为2.50mmol/L、CaCl₂为2.00mmol/L 、MgSO₄·7H₂O为1.50mmol/L；该营养液中的微量元素采用Arnon营养液配方：其中Fe²⁺ 2.8mg/L，以Fe-EDTA配入。

本发明筛选方法操作简便易行，能基本上客观地反映吸收磷肥的真实状况，筛选出优异的种质。该筛选方法具有以下优点：

1）是目前较为系统的针对大麦磷肥吸收真实状况的筛选方法，即通过三个形态指标和三个生理指标筛选大麦磷利用效率高的品种，且该方法与田间实际生产条件相近，操作简便易行，可以对尽可能多的大麦品种进行磷高效率利用品种的筛选，从而筛选出磷利用效率最高的大麦品种。

2）首次针对大麦磷高效率利用研究工作基础薄弱，研究大麦不同磷水平下的生理指标，为后续的研究大麦磷高效率吸收机理及品种改良提供了最基本的实验依据和实验方法。

3）优选不同磷利用资源的研究和利用：大麦磷吸收利用效率遗传背景差异十分明显，初步筛选的磷利用效率高的品种为大麦抗性育种提供了优良种质资源。

附图说明

图1是本发明实施例中砂培初筛得出的六个品种的筛选指标柱形图。

图2是本发明实施例中复筛出的两个品种的筛选指标的柱形图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

针对目前大麦磷高效率利用研究工作基础薄弱这一现状，本发明提供了一种从多个大麦品种中筛选磷利用效率相对最高的品种的方法，具体按以下步骤进行：

a）获取植物幼苗：挑选饱满、籽粒大小一致的需要进行筛选的大麦品种，分别摆放在铺有滤纸的培养皿中，放置在光照培养箱中萌发至生根的幼苗；

b）砂培初筛：从步骤a）的每个大麦品种幼苗中挑选出2n（n≥1）株生长一致的幼苗，并将每个品种的幼苗分为两组（n株/组），分别进行砂培，砂培试验容器采用29cm×19cm塑料盆，栽培基质由体积比1︰1的沙子和蛭石组成，采用浇灌法用不同氮浓度的营养液分别浇灌两组幼苗，不同氮浓度的营养液分别为低磷水平的营养液和正常磷水平的营养液，即其中一组浇灌低磷水平的营养液（低磷处理），另一组浇灌正常磷水平的营养液（正常磷处理）；每隔一周用营养液浇灌一次，每次每盆浇灌营养液500mL，营养液浇后三天浇水一次，每次每盆浇水500mL，直至大麦成熟；

c）分别测定每个品种的两组砂培苗的株高、穗粒数和千粒重，然后按相对性状值=低磷处理的测定值÷正常磷处理的测定值，计算每个品种的相对株高、相对穗粒数和相对千粒重（请确定这段话是否正确）；将计算得到每个大麦品种的相对性状进行排序，综合各相对性状值排名最终筛选出相对株高、相对穗粒数和相对千粒重三个指标数值综合最高的2-4个大麦品种为磷高效率利用品种，筛选出相对株高、相对穗粒数和相对千粒重三个指标数值综合最低的2-4个品种为磷利用效率较低的品种作为对照；

d）水培复筛：将步骤c）筛选出的磷高效率利用品种和磷低效率利用品种按步骤a）的方法萌发至生根的复筛幼苗，选取长势一致的2n（n≥1）株复筛幼苗，将每个品种的复筛幼苗分为两组（n株/组），将两组复筛幼苗分别在塑料周转箱中进行水培，周转箱外径为510×390×150mm，用涂有防锈漆的铁丝将育苗盘底部朝上固定在周转箱上，移栽幼苗置于育苗盘孔中，加水至与育苗盘底部相平。其中一组浇灌低磷水平的营养液（低磷处理），另一组浇灌正常磷水平的营养液（正常磷处理），光照时间白天12h，夜间12h，白天最高温度32℃，夜间最低温度27℃。培养期间每天用浓度为1mol/L 的盐酸或1mol/L的氢氧化钠溶液调节培养液pH值至6.5，每两天更换一次营养液；营养液培养三周后分别测定每个品种两组水培苗的干物质重、磷含量、叶绿素含量，然后按相对性状值=低磷处理的测定值÷正常磷处理的测定值，计算每个品种的相对干物质重、相对磷含量、相对叶绿素含量；

e）根据计算得出的多个大麦品种的相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量进行排序，综合各相对性状值排名最终筛选出相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量三个指标综合最高的1个大麦品种为磷利用效率相对最高的品种。

筛选出相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量三个指标综合最低的1个大麦品种为磷利用效率相对最低的品种作为对照。筛选出的磷利用效率相对最高的品种和磷利用效率相对最低的品种可进行随后的生理机制试验和分子机制试验。

本发明筛选方法中营养液的磷源为KH₂PO₄，用去离子水配制而成。每升低磷水平营养液中的磷含量为27mg，每升正常磷水平营养液中的氮含量为544mg；该两种水平营养液中的其它成分及含量均相同。

营养液中氮、钾、钙、镁的浓度采用改良的休伊特营养液培养，见表1，pH 6.5。

表1 改良的休伊特营养液配方

营养液中的微量元素采用Arnon营养液配方，见表2，其中Fe²⁺ 2.8mg/L，以Fe-EDTA配入。

表2 Arnon微量元素营养液配方

本发明方法中筛选指标的测定：

筛选指标即比较品种间的相对值：相对株高、相对穗粒数、相对千粒重、相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量。相对株高、相对穗粒数和相对千粒重综合用于砂培初筛测定指标，相对干物质重、相对磷含量和相对叶绿素含量综合用于水培复筛，结合两次筛选结果来判断大麦品种磷利用效率的高低。

株高测定：大麦成熟后，随机选取各品种不同磷浓度处理的6株植株，用直尺测量大麦根茎基部到顶部之间的距离，计算其平均值。

穗粒数测定：收获后，随机选取各品种不同磷浓度处理的穗子6个，计数后求其平均值。

千粒重测定：脱粒后，随机选取各品种不同磷浓度处理的1000粒种子，电子天平称重后求其平均值。

植株干重测定：先将鲜样在105℃杀青30min，然后降温至80℃，逐尽水分，最后称重。

叶绿素含量测定：取新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀；称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂、碳酸钙粉及2-3mL质量百分比浓度为95%乙醇，研成匀浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3-5min；取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇润湿，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25mL，摇匀；把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。

全磷测定：将植株样品烘干磨细后，用钒钼黄比色法测定各样品的地上部全磷的含量。

本发明中关于磷利用效率高的品种的筛选指标，目前尚无既定标准。本发明基于植株在成熟后的相对株高、相对穗粒数、相对千粒重进行初筛，而后对于其在苗期的相对干物质重、相对磷含量、相对叶绿素含量进行复筛，通过全生育期砂培和苗期水培的结合，客观地反映大麦吸收磷肥的真实状况，建立大麦可靠、简便的磷利用效率高的品种的筛选方法，筛选出优异的种质。

本发明筛选方法的原理：作物在缺磷条件下的表现症状之一就是生长缓慢，生物量有所降低。高效率品种具有较大的生物积累量，低效率品种则因为磷供应不充分，生物积累量很小。不同品种大麦苗期地上部干物质重的差异在一定程度上能反应它对养分的吸收、转运和利用效率的差异。而且，磷对植株的分蘖、分枝以及根系生长都有重要作用，并且促进碳水化合物的合成、转化和运输，对种子的生长有利。植物缺磷时，会影响细胞生长和分裂，使分蘖分枝减少，幼叶生长停滞，植物体内蛋白质合成下降。并且缺磷会导致糖运转受阻，营养器官中糖的含量相对提高，促进了花青素的形成从而使植物的叶呈不正常的暗绿色或紫红色。植物磷吸收总量，即植物吸磷量，是表示植株吸磷能力大小的指标。在低磷胁迫下，不同基因型植株磷吸收总量均有下降。但高效率品种在较低的磷水平下仍能吸收较多的磷来满足其生长发育的需要，所以相对比值更高。

实施例

1、获取植物幼苗

从需要进行筛选的16个大麦品种（见表3）中挑选饱满、籽粒大小一致的大麦品种分别摆放在铺有滤纸的培养皿中，放置在光照培养箱中萌发至生根的幼苗，5天后选取长势一致的幼苗作为试验处理材料。光照时间为白天12h，夜间12h，白天最高温度为32℃，夜间最低温度为27℃。

表3 不同大麦品种编号

2、砂培初筛

从每个品种的植物幼苗中挑出12株长势一致的幼苗进行砂培试验。砂培试验容器采用29×19cm塑料盆，栽培基质由体积比为1︰1的沙子和蛭石组成。用去离子水和KH₂PO₄配制磷含量为27mg/L低磷水平的营养液，用去离子水和KH₂PO₄配制磷含量为544mg/L的正常磷水平的营养液。该两种水平营养液的pH值均为 6.5；该两种水平营养液中氮、钾、钙、镁的浓度均相同，即NH₄NO₃为2.50mmol/L、K₂SO₄为2.50mmol/L、CaCl₂为2.00mmol/L 、MgSO₄·7H₂O为1.50mmol/L；营养液中其它微量元素采用Arnon营养液配方，即H₃BO₃为2.86g/L、MnCl₂·4H₂O为1.81g/L、ZnSO₄·7H₂O为0.22g/L、CuSO₄·5H₂O为0.08g/L、H₂MoO₄·4H₂O为0.02g/L。营养液中Fe²⁺ 2.8mg/L，以Fe-EDTA配入。

将每个品种的幼苗分为两组（6株/组），一组用磷含量544mg/L的营养液每隔一周浇灌一次，另一组用磷含量27mg/L的营养液每隔一周浇灌一次，每次每盆浇灌营养液500mL，营养液浇后三天浇水一次，每次每盆浇水500mL，直至大麦成熟。每个品种，分别测定低磷处理组中6株大麦中每株大麦的株高、穗粒数、千粒重，然后分别计算其平均株高、平均穗粒数、平均千粒重作为低磷处理的测定值；采用同样方法得出正常磷处理组的平均株高、平均穗粒数、平均千粒重作为正常磷处理的测定值。然后按相对性状=低磷处理的测定值÷正常磷处理的测定值，计算每个品种的筛选指标：相对株高、相对穗粒数和相对千粒重。每个品种所得的筛选指标见表4。

表4为砂培初筛所得的16个大麦品种的筛选指标

从所得出的多个大麦品种的筛选指标进行综合对比，相对株高：5#、15#、8#数值最低，7#、2#、11#数值最高；相对穗粒数：5#、15#、8#数值最低，7#、3#、11#数值最高；相对千粒重：5#、15#、8#数值最低，7#、2#、11#数值最高。综合各项指标，筛选出三个指标综合数值最高的3个品种7#、2#、11#为磷利用效率相对较高的品种，筛选出的三个指标综合数值最低的3个品种5#、15#、8#为磷利用效率较低的品种作为对照，筛选出的该6个品种的筛选指标的柱形图，如图1所示，从图中可以看出磷利用效率高的品种在相对株高，相对穗粒数和相对千粒重上均高于磷利用效率低的品种。

将经过砂培初筛所选的3个磷利用效率较高的品种（7#、2#、11#）和磷利用效率较低的3个品种（5#、15#、8#）重复进行水培获取水培苗，将每个品种的植物幼苗分两组进行营养液培养，其中一组用低磷水平的营养液（低磷处理），另一组用正常磷水平的营养液培养（正常磷处理）；营养液培养容器为塑料周转箱。培养期间每天用浓度为1mol/L的盐酸或1mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH值至6.5，每两天更换一次营养液。大麦在温室中生长3周后测定其各项指标。其中所用的营养液的配方及筛选指标的测定方法如前所述。分别测定每个品种的筛选指标，将所得出的大麦品种的筛选指标进行综合对比，筛选出三个指标综合数值最高的1个品种为在16个大麦品种中磷利用效率最高的品种（7#），筛选出三个指标综合数值最低的1个品种为在16个大麦品种中磷利用效率最低的品种（5#）作为对照。图2为营养液培养复筛中筛选出磷高效率利用品种7#和磷低效率利用品种5#筛选指标的柱形图。从图2可以看出磷高效率利用品种在三个指标上明显优于磷低效率利用品种。

筛选出的磷高效利用品种7#和磷低效利用品种5#进行下一步试验（生理机理和分子机理）。