一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法与流程

本发明涉及植物生物
技术领域：
，尤其涉及一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法。
背景技术：
：乌桕(SapiumsebiferumRoxb)，大戟科乌桕属落叶乔木，是一种集观赏、药用和油用于一体的多功能树种。乌桕适应性强，分布广，种子含油率高达55％，是制造蜡烛、肥皂、金属皂、润滑脂、合成洗涤剂，软化剂和制取软脂酸、硬脂酸、玻璃钢、高级喷漆的原料。近年来乌桕种子也成为制取生物柴油的重要原料，同时也是制备巧克力、化妆品的重要原料。此外，乌桕因其叶色多变，在秋季呈现出红、橙、黄、绿、紫和褐等颜色，又是一种具有发展潜力的景观植物，具有广泛应用前景。由于乌桕为多年生木本植物，且高度杂合，通过传统的杂交育种方式很难满足育种需求，而单倍体育种可以大大缩短育种年限，加快育种进程，在植物遗传育种理论和实践研究中具有广泛的应用前景。植物花药培养技术是最常用的获得单倍体植株的方法，通过花药培养可快速有效地获得纯合双单倍体，避免了通过传统育种手段需要多代自交才可以获得纯合稳定的品系。此外，通过花药培养获得的单倍体可以直接用于遗传图谱的构建、培育新品种或作为优良亲本用于品种改良。因此，本发明以乌桕花药为材料，建立了一套适合乌桕的简单、快速、稳定的花药离体再生体系，为乌桕的单倍体育种、遗传图谱的构建及后期种质资源的创建等提供技术支撑；同时，对乌桕的遗传改良和新品种的选育都具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适合乌桕的简单、快速、稳定的通过花药培养获得乌桕再生植株的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择选取生长至适宜时期的乌桕花序用于后续培养；(2)外植体的低温预处理将花序装于自封塑料袋内置于冰箱进行低温预处理；(3)外植体的表面消毒将经过低温预处理后的花序经流水冲洗后置于无菌操作台中进行表面消毒；(4)愈伤组织诱导培养滤纸吸干步骤(3)中消毒后花序表面的水分，剥取花药，接种于愈伤组织诱导培养基中，再经过3-4周的光照培养，获取愈伤组织；(5)愈伤组织的增殖培养将步骤(4)中获得的愈伤组织转接于增殖培养基中进行增殖培养；(6)愈伤组织的分化将步骤(5)中增殖后的愈伤组织切成切块，转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化培养；(7)不定芽的伸长将步骤(6)中已分化出丛生芽的愈伤组织，转接于不定芽伸长培养基中进行不定芽的伸长培养并获取相应乌桕幼苗；(8)不定芽的生根将步骤(7)中伸长的乌桕幼苗转接于生根培养基中进行生根培养，最终获得乌桕再生植株。优选地，所述步骤(1)中生长至适宜时期的乌桕花序为经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期或单核靠边期的乌桕花序。优选地，所述步骤(2)中低温预处理的方法为：将花序置于3-5℃冰箱处理6-24h。优选地，所述步骤(3)中外植体的表面消毒的具体方法为：将花序经流水冲洗20-30min后，于无菌操作台中用无菌水冲洗3-5遍；再采用70％-75％的乙醇消毒15-20s,无菌水冲洗3-5遍，重复1次；接着，再用添加有0.5-1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60-120s，最后用无菌水再冲洗5-8遍。优选地，所述步骤(4)中花药的剥取于无菌操作台中借助尖头镊子进行。优选地，所述步骤(4)中愈伤组织诱导培养基为添加有0.6-3.0mg/LTDZ和0.6-3.0mg/LIAA的DKW培养基。优选地，所述步骤(5)中增殖培养基为添加有0.1-0.5mg/LTDZ和1.0-2.0mg/LIAA的DKW培养基。优选地，所述步骤(6)中分化培养基为添加有0.2-0.5mg/LTDZ和0.1-0.5mg/LZT的DKW培养基。优选地，所述步骤(7)中不定芽伸长培养基为添加有0.05-0.2mg/LZT的1/2DKW培养基。优选地，所述步骤(8)中生根培养基为添加有0.1-2.0mg/L亚精胺的1/2DKW培养基。本发明的优点在于：本发明所提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法，具体涉及一种以木本能源植物乌桕的花药为外植体，通过愈伤组织的诱导、增殖和分化，最终获得乌桕完整植株的方法；本发明建立了一套适合乌桕的简单、快速、稳定的花药离体再生体系，为乌桕的单倍体育种、遗传图谱的构建及后期种质资源的创建等提供技术支撑，同时，对乌桕的遗传改良和新品种的选育具有重要意义。附图说明图1是本发明实施例1-3提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的流程图；图2是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的小孢子处于单核靠边期的花药图；图3是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的小孢子处于单核靠边期的花药所对应的花序大小图；图4是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的花药愈伤组织的诱导图；图5是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的愈伤组织的增殖图；图6是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的愈伤组织的分化图；图7是本发明实施例1提供的一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法的不定芽的生根图。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：(1)外植体的选择经显微镜镜检，选取小孢子处于单核靠边期的乌桕花药所对应的花序用于后续培养，其中，小孢子处于单核靠边期的花药及花药所对应的花序大小图分别如图2、图3所示；(2)外植体的低温预处理将花序装于自封塑料袋内置于3℃冰箱进行低温预处理6h；(3)外植体的表面消毒将经过低温预处理后的花序经流水冲洗20min后置于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍；再采用70％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗3遍，重复1次；接着，再用添加有0.5％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60s，最后用无菌水再冲洗5遍；(4)愈伤组织诱导培养滤纸吸干步骤(3)中消毒后花序表面的水分，于无菌操作台中借助尖头镊子剥取花药，接种于愈伤组织诱导培养基中，放置于光照周期为8/16(光照/黑暗)，光照强度(2000-2500lx)，温度为(24±1)℃的恒温培养室，经过3周的培养，获得如图4所示的淡绿色的花药愈伤组织，愈伤组织的诱导率高达100％；其中愈伤组织的诱导培养基为添加有0.6mg/LTDZ和0.6mg/LIAA的DKW培养基；(5)愈伤组织的增殖培养将步骤(4)中将诱导出的直径为4mm的花药愈伤组织转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，培养5周后愈伤组织的增殖效率最高达6.8，其中增殖培养基为添加有0.1mg/LTDZ和1.0mg/LIAA的DKW培养基；(6)愈伤组织的分化将如图5所示的增殖后的愈伤组织切成切块，转接于分化培养基上，于光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度(2500-3000lx)，温度为(26±1)℃的恒温培养室中，进行愈伤组织的分化；经过3周的光照培养，93.2％的愈伤组织分化出如图6所示的不定芽点，其中分化培养基为添加有0.2mg/LTDZ和0.1mg/LZT的DKW培养基；(7)不定芽的伸长待不定芽长至0.5cm后，将带有不定芽丛的愈伤组织转接于不定芽伸长培养基中进行不定芽的伸长培养并获取相应乌桕幼苗，其中不定芽伸长培养基为添加有0.05mg/LZT的1/2DKW培养基；(8)不定芽的生根光照培养2周后，将伸长的乌桕不定芽转接于生根培养基中进行生根培养，1个月后获得如图7所示的根系健壮的乌桕再生植株，其中生根培养基为添加有0.1mg/L亚精胺的1/2DKW培养基。实施例2一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：(1)外植体的选择经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期的乌桕花药所对应的花序用于后续培养；(2)外植体的低温预处理将花序装于自封塑料袋内置于5℃冰箱进行低温预处理24h；(3)外植体的表面消毒将经过低温预处理后的花序经流水冲洗30min后置于无菌操作台中用无菌水冲洗5遍；再采用75％的乙醇消毒20s，无菌水冲洗5遍，重复1次；接着，再用添加有1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒120s，最后用无菌水再冲洗8遍；(4)愈伤组织诱导培养滤纸吸干步骤(3)中消毒后花序表面的水分，于无菌操作台中借助尖头镊子剥取花药，接种于愈伤组织诱导培养基中，放置于光照周期为8/16(光照/黑暗),光照强度(2000-2500lx)，温度为(24±1)℃的恒温培养室，经过4周的培养，获得淡绿色的花药愈伤组织，愈伤组织的诱导率高达100％；其中愈伤组织的诱导培养基为添加有3.0mg/LTDZ和3.0mg/LIAA的DKW培养基；(5)愈伤组织的增殖培养将步骤(4)中将诱导出的直径为6mm的花药愈伤组织转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，培养5周后愈伤组织的增殖效率最高达6.8，其中增殖培养基为添加有0.5mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培养基；(6)愈伤组织的分化将增殖后的愈伤组织切成切块，转接于分化培养基上，于光照周期为16/8(光照/黑暗)，光照强度(2500-3000lx)，温度为(26±1)℃的恒温培养室中，进行愈伤组织的分化；经过3周的光照培养，93.2％的愈伤组织分化出不定芽点，其中分化培养基为添加有0.5mg/LTDZ和0.5mg/LZT的DKW培养基；(7)不定芽的伸长待不定芽长至1.0cm后，将带有不定芽丛的愈伤组织转接于不定芽伸长培养基中进行不定芽的伸长培养并获取相应乌桕幼苗，其中不定芽伸长培养基为添加有0.2mg/LZT的1/2DKW培养基；(8)不定芽的生根光照培养2周后，将伸长的乌桕不定芽转接于生根培养基中进行生根培养，1个月后获得根系健壮的乌桕再生植株，其中生根培养基为添加有2.0mg/L亚精胺的1/2DKW培养基。实施例3一种通过花药培养获得乌桕再生植株的方法，如图1所示，包括如下步骤：(1)外植体的选择经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期的乌桕花药所对应的花序用于后续培养；(2)外植体的低温预处理将花序装于自封塑料袋内置于4℃冰箱进行低温预处理12h；(3)外植体的表面消毒将经过低温预处理后的花序经流水冲洗25min后置于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍；再采用73％的乙醇消毒18s，无菌水冲洗4遍，重复1次；接着，再用添加有0.8％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒100s，最后用无菌水再冲洗6遍；(4)愈伤组织诱导培养滤纸吸干步骤(3)中消毒后花序表面的水分，于无菌操作台中借助尖头镊子剥取花药，接种于愈伤组织诱导培养基中，其中愈伤组织的诱导培养基为添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培养基；(5)愈伤组织的增殖培养将步骤(4)中将诱导出的花药愈伤组织转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，其中增殖培养基为添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的DKW培养基；(6)愈伤组织的分化将增殖后的愈伤组织切成切块，转接于分化培养基上，其中分化培养基为添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT的DKW培养基；(7)不定芽的伸长待不定芽长至0.7cm后，将带有不定芽丛的愈伤组织转接于不定芽伸长培养基中进行不定芽的伸长培养并获取相应乌桕幼苗，其中不定芽伸长培养基为添加有0.1mg/LZT的1/2DKW培养基；(8)不定芽的生根光照培养1.5周后，将伸长的乌桕不定芽转接于生根培养基中进行生根培养，1个月后获得根系健壮的乌桕再生植株，其中生根培养基为添加有1.0mg/L亚精胺的1/2DKW培养基。此外，上述花药培养过程中采用的培养基种类以及相应额外添加的植物生长调节剂的种类和浓度均经过一定的实验研究探究，其主要研究过程及结果如下：(1)不同浓度TDZ、IAA及培养基类型对乌桕花药愈伤组织诱导和增殖的影响将经表面消毒后的外植体接种于添加有不同浓度TDZ和IAA的培养基中进行愈伤组织的诱导和增殖，培养条件为：温度(24±1℃)，光照强度2000lx,光照时间为8h/d；培养30d后，统计愈伤组织的诱导率及愈伤组织的长势(表1)；表1TDZ与IAA结合使用对乌桕花药愈伤组织诱导的影响从表1可知，不同浓度TDZ和IAA组合使用对乌桕花药愈伤组织诱导率和长势具有显著的影响；将花药接种于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培养基上，愈伤组织的诱导率高达100％，且愈伤组织为绿色，质地疏松，利于后期的增殖和分化研究；(2)不同种类基本培养基类型对乌桕花药愈伤组织诱导分化的影响在上述愈伤组织诱导的基础上，进一步测试不同种类基本培养基类型对乌桕花药愈伤组织诱导的影响，即将上述消毒后的花药接种于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的不同类型基本培养基(MS、WPM、DKW和B5)上进行愈伤组织的诱导；表2培养基类型对乌桕花药愈伤组织诱导的影响研究发现(表2)，培养基类型对乌桕花药愈伤组织的诱导分化具有显著影响，在所测试的4种类型培养基中，DKW基本培养基最有利于乌桕花药愈伤组织的诱导，B5最不利于愈伤组织的诱导；(3)不同浓度TDZ和IAA对愈伤组织增殖的影响在愈伤组织诱导分化的基础上，进一步测试TDZ和IAA浓度对愈伤组织增殖的影响，研究发现(表3)，通过调整TDZ和IAA的浓度，对愈伤组织的增殖系数及长势同样具有明显的影响；将诱导出愈伤组织的花药转接于添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的培养基上进行继代培养，愈伤组织质地疏松，颜色脆绿，利于后期的分化，且愈伤组织的增殖系数高达6.8；表3不同浓度TDZ和IAA结合使用对花药愈伤组织增殖的影响(4)不同浓度TDZ和ZT对乌桕花药愈伤组织分化的影响将增殖后的愈伤组织切成0.1cm2大小的切块，接种于添加有不同浓度TDZ和ZT的培养基中进行愈伤组织的分化研究；培养条件为：温度(26±1℃)，光照强度3000lx，光照时间为16h/d；培养30d后，统计愈伤组织的分化率(表4)；表4不同浓度TDZ和ZT对乌桕花药愈伤组织分化的影响研究结果表明，TDZ和ZT对乌桕花药愈伤组织的分化具有明显的影响；低浓度的TDZ和ZT更有利于愈伤组织的分化，添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT时，愈伤组织的分化率最高达到93.2％；(5)不同浓度ZT对乌桕花药愈伤组织分化形成的不定芽伸长的影响将分化出不定芽点的愈伤组织转接于添加有不同浓度ZT的培养基中进行不定芽的伸长研究；培养条件为：温度(26±1℃)，光照强度3000lx,光照时间为16h/d。培养30d后，统计不定芽的伸长情况(表5)；表5不同浓度ZT对乌桕花药不定芽伸长的影响ZT(mg/L)芽伸长率(％)平均芽长(cm)0.0536.81.80.191.73.30.251.10.9研究结果表明，低浓度的ZT对乌桕花药不定芽的伸长率及平均芽长具有重要的影响，培养基中添加有0.1mg/LZT时，不定芽伸长率高达91.7％，平均芽长为3.3cm；(6)不同浓度亚精胺对乌桕花药不定芽生根的影响光照培养2周后，将伸长的不定芽转接于添加有不同浓度亚精胺的1/2DKW培养基中进行不定芽的生根研究；培养条件为：温度(26±1℃)，光照强度3000lx,光照时间为16h/d。培养30d后，统计不定芽的伸长情况(表6)；表6不同浓度亚精胺对乌桕花药不定芽生根的影响研究结果表明，培养基中添加亚精胺有利于提高乌桕花药不定芽的生根率和缩短不定根的形成时间；当培养基中添加1.0mg/L亚精胺时，不定芽生根率高达100％，平均每个外植体产生5.9个不定根，且平均根长为2.9cm，根粗壮有利于后期的移栽。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3