本发明涉及果类作物组织培养技术领域，具体是一种沙棘叶片组织培养方法。
背景技术：
沙棘(hippophaerhamnoidesl.)为胡颓子科(elaeagnaceae)沙棘属(hippophael.)植物，是一种适应性很强的树种，具有广泛的生态效益和社会效益。其繁殖方式很多，常规林木繁育方法都能采用，但在规模化生产且要保证品质的前提下只能选择特定的繁育方法。前人以带腋芽的茎段、节间、茎尖等对沙棘快速繁殖进行初步研究，已有很多成功的报到。但是尚未出现以沙棘叶片作为材料进行快速繁殖的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以沙棘叶片作为材料的沙棘叶片组织培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种沙棘叶片组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、初代培养：取40日龄的试管苗叶片，剪成2.5-3.0cm2的小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶10-15片叶；培养温度25℃左右，湿度50%-70%，光照强度2000-3000lx，光照时间13-16h/d；
所述愈伤组织诱导培养基的配方为1/2b5+6-ba0.5mg/l+iaa0.3mg/l+琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤二、继代增殖：取初代培养的无根苗剪切成茎尖、带腋芽的茎段分别接种到增殖培养基上；
所述增殖培养基的配方为1/2b5+6-ba0.3琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤三、生根培养：取继代增殖的无根苗，接种到生根培养基上；
所述生根培养基的配方为1/2b5+iba0.3+琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤四、移栽：当长根的试管苗高度约5.0cm时，整瓶移出培养室，置于室温阴凉处4-5天，揭开瓶盖，在放置4-5d，将试管苗取出，用自来水轻轻洗去根部的琼脂，移栽到事先经高温灭过菌的基质中，将移栽后的试管苗浇透，用透明的膜盖在上方，保持湿度，逐渐通风透光；成活的幼苗用1/2b5大量元素母液浇透；
所述基质由草炭土和珍珠岩1:1混合而成。
作为本发明进一步的方案：步骤四中移栽后的最初的一周内湿度基本控制在95%以上，逐渐延长通风和光照时间，15d左右完全揭开帘子；白天温度应控制在25℃，夜间15-18℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以沙棘无菌苗叶片为材料，选择各个培养阶段的适宜的培养基配方和适宜的移栽基质，实现较高的幼苗成活率，为其工厂化生产提供依据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种沙棘叶片组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一、初代培养：取40日龄的试管苗叶片，剪成2.5-3.0cm2的小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶10-15片叶；培养温度25℃左右，湿度50%-70%，光照强度2000-3000lx，光照时间13-16h/d；每隔3-5d观察记录一次；
所述愈伤组织诱导培养基的配方为1/2b5+6-ba0.5mg/l+iaa0.3mg/l+琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤二、继代增殖：取初代培养的无根苗剪切成茎尖、带腋芽的茎段分别接种到增殖培养基上；
所述增殖培养基的配方为1/2b5+6-ba0.3琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤三、生根培养：取继代增殖的无根苗，接种到生根培养基上，每隔3-5d观察根的诱导和生长情况；
所述生根培养基的配方为1/2b5+iba0.3+琼脂0.6%+蔗糖3%；
步骤四、移栽：当长根的试管苗高度约5.0cm时，整瓶移出培养室，置于室温阴凉处4-5天，揭开瓶盖，在放置4-5d，将试管苗取出，用自来水轻轻洗去根部的琼脂，移栽到事先经高温灭过菌的基质中，将移栽后的试管苗浇透，用透明的膜盖在上方，保持湿度，逐渐通风透光；成活的幼苗用1/2b5大量元素母液浇透；
所述基质由草炭土和珍珠岩1:1混合而成。
上述，步骤四中移栽后的最初的一周内湿度基本控制在95%以上，逐渐延长通风和光照时间，15d左右完全揭开帘子；白天温度应控制在25℃，夜间15-18℃。
本发明的实验过程：
1材料与方法
1.1供试材料
沙棘的试管苗由阿勒泰地区小浆果研究中心实验室提供。品种为2016年选育出的大果沙棘新品种“qx-01-04”，红果、软刺，2017拟大力推广的品种。
1.2方法
1.2.1培养基设计
初代培养以1/2b5为基本培养基，添加不同浓度的细胞分裂素6-ba和生长素iaa、naa。将初代分化出的芽接种到继代培养基中，继代增殖培养基以1/2b5为基本培养基，添加不同浓度的细胞分裂素6-ba和生长素iaa。以上培养基ph值均为5.8，琼脂0.6%，蔗糖3%。
1.2.2初代培养
取40日龄的试管苗叶片，剪成2.5-3.0cm2的小块，接种到初代不同组合的培养基上，每瓶10-15片叶。培养温度25℃左右，湿度50%-70%，光照强度2000-3000lx，光照时间13-16h/d。每隔3-5d观察记录一次。
1.2.3继代增殖与生根培养
取初代培养的无根苗剪切成茎尖、带腋芽的茎段分别接种到不同植物生长调节剂组合的增殖培养基上，每隔7d观察1次，记载芽苗的生长和增殖情况。无菌苗切下的叶片原接种到初代筛选出的适宜培养基中。取继代增殖的无根苗，接种到生根培养基上，每隔3-5d观察根的诱导和生长情况。
1.2.4试管苗移栽
当长根的试管苗高度约5.0cm时，整瓶移出培养室，置于室温阴凉处4-5天，揭开瓶盖，在放置4-5d，将试管苗取出，用自来水轻轻洗去根部的琼脂，移栽到事先经高温灭过菌的基质中，基质为草炭土：珍珠岩=1:1。将移栽后的苗浇透，用透明的膜盖在移栽苗上方，保持湿度，逐渐通风透光；15d后统计苗成活率。成活的幼苗用1/2b5大量元素母液浇透，以保证芽苗的健壮生长。
2结果与分析
2.1不同生长调节剂配比对沙棘叶片初代培养影响
将初代无菌苗剪切下的叶片插入愈伤组织诱导培养基，7d左右，可见叶片基部膨大，有淡绿色愈伤组织生成，继续培养20d，该愈伤组织出现绿色芽点，继续培养，40d后大部分的愈伤组织开始分化出0.2-0.5cm的不定芽。不同浓度的激素配比，叶片愈伤组织芽的增值效果及生长情况也不同，筛选出适宜沙棘叶片愈伤组织诱导培养基为1/2b5+6-ba0.5+iaa0.3（表1）；
表1不同植物生长调节剂配比对沙棘不定芽诱导的影响
表1为接种50d后的统计结果。由表1可以得知，6-ba与iaa配合使用叶片诱导产生不定芽效果优于6-ba与naa组合。当6-ba浓度在1.0mg/l时，分化出的不定芽形态明显异常，芽弱小，不饱满，叶片扭曲畸形。当6-ba浓度在0.5mg/l时诱导的芽效果较好，iaa在0.5mg/l时诱导芽玻璃化明显增多。综合分析认为沙棘叶片诱导最佳初代培养基为1/2b5+6-ba0.5+iaa0.3。
2.2不同生长调节剂配比对沙棘叶片继代培养影响
将初代培养分化出的芽切下转接入继代增殖培养基中，沙棘叶片诱导最佳初代培养基为1/2b5+6-ba0.5+iaa0.3基础上，添加不同含量的iaa，研究其对芽苗继代增殖的影响（表2）。
表2不同生长调节剂对沙棘不定芽诱导的影响
由表2可以看出仅添加6-ba的情况下不定芽增殖效果较好，当6-ba浓度超过1.0mg/l时，增值苗基本为玻璃化苗，低于0.2mg/l时，苗生长缓慢，瘦弱。当添加一定浓度的iaa后，苗前期生长较快，15d后茎尖停止生长，部分苗开始变黄，叶腋处的芽长出，部分挨着培养基的叶片也开始分化芽点。总体比较分析最适宜的茎尖、茎段增殖培养基为1/2b5+6-ba0.3。
2.3不同生长调节剂配比对沙棘叶片生根培养影响
将继代增值的无根苗切下，转入以1/2b5为基本培养基的生根培养基中。添加不同含量的iba和naa，研究其对芽苗生根的影响（表3）。
表3不同生长调节剂对沙棘苗生根的影响
由表3可以看出iba对沙棘无根苗生根影响较大，1/2b5培养基，在仅添加iba生长素时，可以得到较好的生根苗，无根苗基部基本无愈伤，苗多为皮层生根，有明显的主根，移栽成活率高，在添加了6-ba后，苗生根量降低，但所生的根根系较多，移栽易成活。添加naa的，仅长愈伤组织，后期秒枯死，均无生根苗生成。综合分析，沙棘适宜生根配方为1/2b5+6-ba0.3。
2.4生根苗的炼苗和移栽
试管苗移栽20d后左右，成活率可达96%。移苗成功的关键在于最初的一周内湿度的控制，湿度基本控制在95%以上，逐渐延长通风和光照时间，15d左右才能完全揭开帘子。同时要控制好温度，白天温度应控制在25℃，夜间15-18℃。沙棘的根系在移栽的过程中，容易受到损伤，其损伤程度往往会影响苗的成活率。因此，在移栽沙棘苗木的过程中，应尽量保持根系的完整，减少过多根系的损伤。
3结果与讨论
以沙棘无菌苗叶片为外植体诱导不定芽产生，进而培养成植株，使组培材料的取材范围更宽，减少了沙棘组培苗在转接继代过程中的浪费，更利于新引进的优良品种快速推广。在本实验条件下，以沙棘无菌苗叶片为外植体，直接诱导不定芽产生，最适宜的培养基为：叶片愈伤组织诱导培养基为1/2b5+6-ba0.5+iaa0.3，不定芽继代增殖培养基为1/2b5+6-ba0.3，生根培养基为1/2b5+iba0.3。
叶片在诱导分化不定芽过程中可通过叶缘切口处直接分化成芽，也可经过瘤状愈伤组织再分化不定芽，但以前者分化速度快，所成芽比例大。
褐化是沙棘组织培养中常见的问题，其创伤分泌出的酚类物质一旦接触空气便被氧化成醌类有毒物质，这些有毒物质积累在培养基中，而使培养材料死亡。在木本植物的培养过程中，褐变受培养温度、外植体、激素浓度、光照等因素影响。在本试验过程中，无菌苗叶片褐化严重，部分叶片接种3天后基部就有褐色的物质渗出，叶片逐渐死亡。叶片形成的愈伤组织褐化也较严重，后期基部基本都呈黑色，影响了不定芽的分化。为减轻叶片褐化，选取生长健壮肥厚的叶片，并进行一定时间的暗培养，增加琼脂用量等以减轻褐化程度。
玻璃化苗很难移栽成活，给离体快繁带来了极大地损失。研究认为，试管苗的玻璃化，主要是由于培养基中的细胞分裂素水平太高，碳源、琼脂含量太低，容器过分密闭等原因造成的。从本实验就过看，激素配比对试管苗玻璃化影响较大，高浓度的6-ba和iaa、naa均会产生大量的玻璃花苗，所以降低激素用量会有效的降低沙棘玻璃化苗的产生。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。