本发明涉及观赏植物培育技术领域，具体涉及一种木芙蓉花药培养愈伤组织诱导方法。
背景技术：
木芙蓉（hibiscusmutabilisl.）又名三变花、木莲、拒霜花、七星花、霜降花等，属锦葵科木槿属落叶灌木或小乔木，原产我国四川、云南、贵州等省，黄河流域以南各省区均有栽培，其中尤以成都最盛。木芙蓉花朵硕大，雍容端庄，艳丽卓绝，繁花满树，且变化有序，中国自古以来多在庭园栽植，可孤植、丛植于墙边、路旁、厅前等处。木芙蓉耐水湿，有“照水芙蓉”的美称，宜栽种在河、江等水边，盛花时花影绰约，斑驳树姿，分外娇艳。木芙蓉喜温暖、湿润的环境，不耐干旱和寒冷，耐水湿，抗逆性强，栽培易成活，瘠薄地也能生长。木芙蓉拥有盘根错节的根系，能够防止水土流失；其叶片、叶柄、花萼等密被星状毛和短柔毛，能够吸附空气中的小颗粒，净化空气，是一种非常好的园林观花树种。此外，木芙蓉还具有一定的药用价值，其花、叶和根可入药，有清热解毒，消肿祛脓，凉血止血之效。
花药培养是自60年代开始发展起来的一项新型生物技术，是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工配置的培养基上，通过人为添加诱导激素，控制培养条件从而改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织—愈伤组织，或者分化成为胚状体，然后还可以通过控制培养条件使愈伤组织分化成完整的植株。花药培养的意义在于：一是可以避免使用受外界环境因素影响多的传统育种方法来获得基因纯合材料，从而进行单倍体育种，以利用杂种优势，提高育种效率，缩短育种年限；二是用获得的基因纯合材料进行植物遗传规律研究，为遗传育种不断提供理论依据，使育种的针对性更强；三是克服远缘杂种的不育性，例如玉米和小麦杂交，获得具有两亲本优良性状的可育的远缘杂种；四是利用在远缘杂交f1代花药培养过程中出现的混倍体及大量的染色体变异材料进行植物细胞遗传、分子遗传等基础性研究。
自1964年从由毛叶曼陀罗的离体花药中成功诱导出单倍体植株后，很多国家都相继进行了这个方面的研究，促进了植物花药单倍体育种技术的发展。目前，利用花药培养产生单倍体的技术被广泛的应用在多种植物上。中国的科技人员首次在小麦、玉米、水稻、橡胶、杨树等植物的花粉再生植株的培育上获得成功。在20世纪70年代中国科学家陆续开展了观赏植物的花药培养单倍体的研究，也从四季海棠、芍药等的花粉或花药获得单倍体植株或单倍体愈伤组织。影响观赏植物花药培养的因素包括植株的基因型、供体植株的年龄和生理状况、小孢子的发育时期、预处理、基本培养基及附加成分、培养条件等，只有选择合适的外植体、培养基以及适当的培养条件，花药培养才能得成功完成。
目前木芙蓉的研究主要集中在引种栽培、化学成分以及药理作用等方面。对于木芙蓉这样观赏性强且对恶劣环境具有一定抗性的优良景观植物，快速培育更好更多的优良品种极具开发前景，而传统的培育方法已经很难满足这一需求。通过现代生物技术的应用利用植物花药培养技术可以很好的解决这些问题，但是目前有关木芙蓉乃至锦葵科植物花药培养方面的报道却几乎没有。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明以木芙蓉花药作为外植体进行花药培养，并考察其最佳的预处理方法、诱导培养基成分以及诱导培养条件等，最终提供了一种木芙蓉花药培养诱导愈伤组织的方法。
本发明提供的技术方案是：
一种木芙蓉花药培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）花蕾采集和预处理：采集尚未开放的木芙蓉花蕾，镜检小孢子鉴定发育时期，筛选出单核靠边期所对应的花蕾，将其置于4℃冰箱中进行低温预处理；
（2）花蕾的消毒：用自来水冲洗低温预处理后的花蕾，用4%的次氯酸钠浸泡20min，将浸泡完的花蕾在超净工作台中用无菌水冲洗干净，再用75%酒精冲洗20~30s，然后用无菌水反复冲洗干净，最后用无菌滤纸吸干多余的水分；
（3）花药预处理：用无菌镊子剥开花蕾取出花药，去除花丝，放入浓度为30%的富氢水中预处理24h，期间第12h更换一次新鲜的富氢水；
（4）愈伤组织的诱导：将上述花药接种于诱导培养基上，轻压花药使其与培养基充分接触，用封口膜封好，置于人工气候室中进行暗培养，诱导愈伤组织形成。
所述步骤（4）中，诱导培养基成分为：nh4no31360-1550mg/l，kno31780-2000mg/l，kh2po4180-200mg/l，cacl2·2h2o510-530mg/l，mgso4·7h2o205-225mg/l，mnso4·4h2o10.3-13.5mg/l，znso4·7h2o7.2-9.0mg/l，h3bo35.6-7.4mg/l，ki0.7-0.8mg/l，na2moo4·2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.02mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.03mg/l，乳酸亚铁26.5-29.5mg/l，肌醇90-110mg/l，甘氨酸2.0-3.0mg/l，脯氨酸25-35mg/l，水解酪蛋白200-250mg/l，维生素b13.5-4.5mg/l，维生素b60.6-0.8mg/l，烟酰胺1.1-1.5mg/l，d-生物素0.03-0.05mg/l，tdz0.04-0.06mg/l，6-ba0.9-1.1mg/l，2，4-d1.8-2.2mg/l，亚硝基胍2.5-3.5mg/l，秋葵热浸液30-70ml/l，na2seo32.0-3.0mg/l，蔗糖45-55g/l，琼脂6-8g/l，ph值为5.6-6.0。
所述步骤（1）中，镜检小孢子的方法：将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴加醋酸洋红染色液，用镊子捣碎花药，挤出其中的小孢子后，去除残渣，然后盖上载玻片置于显微镜下观察小孢子的发育时期。
所述步骤（1）中，低温预处理的时间为24~48h。
所述步骤（3）中，富氢水的制备方法为：由氢气发生器制备纯度达99.99%（v/v）的氢气，并以150~200ml/min的速率持续通入1l蒸馏水中鼓泡30min，制备出饱和的富氢水，之后立即用蒸馏水稀释到所需浓度。
所述步骤（4）中，培养温度为：白天26±1℃，晚上23±1℃。
所述诱导培养基成分中秋葵热浸液的制备方法为：称取新鲜秋葵200g，加入600ml蒸馏水加热煮沸，冷却后用双层纱布过滤，取滤液备用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明中将木芙蓉花药放入浓度为30%的富氢水中预处理，能够显著提高愈伤组织的诱导能力。
2、本发明设计了一种木芙蓉花药培养的诱导培养基，对大量元素、微量元素的浓度进行调整，以乳酸亚铁为铁盐，以tdz、6-ba和2，4-d为激素组合，还添加适宜浓度的脯氨酸、水解酪蛋白、烟酰胺、亚硝基胍、秋葵热浸液、na2seo3，有效提高了愈伤组织的诱导率，为建立高效的木芙蓉花药培养体系以及开展木芙蓉单倍体育种研究奠定了基础。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
木芙蓉的植物材料取自连云港市振兴花卉园内，品种分别是‘牡丹红’和‘醉芙蓉’。所用材料均生长正常，无病、虫害。
一种木芙蓉花药培养愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：
（1）花蕾采集和预处理：采集尚未开放的木芙蓉花蕾，镜检小孢子鉴定发育时期，方法为：将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴加醋酸洋红染色液，用镊子捣碎花药，挤出其中的小孢子后，去除残渣，然后盖上载玻片置于显微镜下观察，筛选出单核靠边期所对应的花蕾，将其置于4℃冰箱中进行低温预处理36h。
（2）花蕾的消毒：用自来水冲洗低温预处理后的花蕾，用4%的次氯酸钠浸泡20min，将浸泡完的花蕾在超净工作台中用无菌水冲洗干净，再用75%酒精冲洗20~30s，然后用无菌水反复冲洗干净，最后用无菌滤纸吸干多余的水分。
（3）花药预处理：用无菌镊子剥开花蕾取出花药，去除花丝，放入浓度为30%的富氢水中预处理24h，期间第12h更换一次新鲜的富氢水；富氢水的制备方法为：由氢气发生器制备纯度达99.99%（v/v）的氢气，并以150~200ml/min的速率持续通入1l蒸馏水中鼓泡30min，制备出饱和的富氢水，之后立即用蒸馏水稀释到所需浓度。
（4）愈伤组织的诱导：将上述花药接种于诱导培养基上，轻压花药使其与培养基充分接触，用封口膜封好，置于人工气候室中进行暗培养，培养温度为：白天26℃，晚上23℃，诱导愈伤组织形成；培养40d时，统计肉眼可见的愈伤组织数，计算愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率（%）＝（产生愈伤组织的花药个数／接种花药个数）×100%。
诱导培养基成分：nh4no31060mg/l，kno31890mg/l，kh2po4190mg/l，cacl2·2h2o520mg/l，mgso4·7h2o215mg/l，mnso4·4h2o11.9mg/l，znso4·7h2o8.1mg/l，h3bo36.5mg/l，ki0.75mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.015mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，乳酸亚铁28.0mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2.5mg/l，脯氨酸30mg/l，水解酪蛋白225mg/l，维生素b14.0mg/l，维生素b60.7mg/l，烟酰胺1.3mg/l，d-生物素0.04mg/l，tdz0.05mg/l，6-ba1.0mg/l，2，4-d2.0mg/l，亚硝基胍2.0mg/l，秋葵热浸液50ml/l，na2seo32.5mg/l，蔗糖50g/l，琼脂7g/l，ph值为5.8。
秋葵热浸液的制备方法为：称取新鲜秋葵200g，加入600ml蒸馏水加热煮沸，冷却后用双层纱布过滤，取滤液备用。
实施例2富氢水预处理对木芙蓉花药培养的影响
以‘牡丹红’、‘醉芙蓉’为材料，将其花药放入不同浓度的富氢水中预处理24h，期间第12h更换一次新鲜的富氢水，然后将花药接种于诱导培养基上培养，比较不同浓度富氢水预处理对供试木芙蓉材料花药培养愈伤组织诱导的影响。富氢水浓度设计为0（对照）、5%、10%、30%、50%共5个浓度，每个浓度3次重复。
从表1可以看出，与对照相比，将花药置于试验浓度的富氢水中预处理后，2份材料的愈伤组织诱导率均有所提高，并且当富氢水浓度为30%时，2份材料的愈伤组织诱导率明显高于其它处理，此浓度下‘牡丹红’的愈伤组织诱导率为25.1%，是对照的2.2倍，‘醉芙蓉’的愈伤组织诱导率为18.6%，是对照的2.8倍。因此用30%的富氢水进行预处理，对愈伤组织诱导效果最好。
实施例3诱导培养基中附加成分对木芙蓉花药培养的影响
1.不同浓度na2seo3对木芙蓉花药愈伤组织诱导率的影响
‘以牡丹红’和‘醉芙蓉’为材料，将花药接种于添加不同浓度na2seo3的诱导培养基上培养，比较不同浓度na2seo3对供试木芙蓉材料花药培养愈伤组织诱导的影响。na2seo3浓度设计为0mg/l、1.0mg/l、2.5mg/l、5.0mg/l、10.0mg/l共5个浓度，每个浓度3次重复。
从表2可以看出，在不同的接种密度条件下愈伤组织诱导率有所不同，na2seo3浓度由0mg/l增加到2.5mg/l，‘牡丹红’的愈伤组织诱导率从16.3%提高至25.5%，‘醉芙蓉’的愈伤组织诱导率从8.91%提高至17.8%，但当na2seo3浓度超过2.5mg/l后，2份材料的愈伤组织诱导率均逐渐下降。因此na2seo3浓度为2.5mg/l最有利于木芙蓉花药愈伤组织的诱导。
2.不同浓度亚硝基胍对木芙蓉花药愈伤组织诱导率的影响
‘以牡丹红’和‘醉芙蓉’为材料，将花药接种于添加不同浓度亚硝基胍的诱导培养基上培养，比较不同浓度亚硝基胍对供试木芙蓉材料花药培养愈伤组织诱导的影响。亚硝基胍浓度设计为0mg/l、1.5mg/l、3.0mg/l、4.5mg/l、6.0mg/l共5个浓度，每个浓度3次重复。
从表3可以看出，在亚硝基胍试验浓度范围内，2份材料的愈伤组织诱导率比对照组均有提高，并且当亚硝基胍浓度为3.0mg/l时，2份材料的愈伤组织诱导率达到最高水平，‘牡丹红’的愈伤组织诱导率为26.2%，‘醉芙蓉’的愈伤组织诱导率为17.5%，与其它浓度下的诱导率差异显著。因此亚硝基胍的最佳浓度为3.0mg/l。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。