接种后，16_20°C下避光萌发8-15天，进行划菌，再光照 转色1-3天，温度提高到20-23°C，转色正常后在塑料膜上用工具点6-18个孔，利于空气交 换，湿度保持65-85%，总培养时间控制在50-70天。
[0028] 通过子囊孢子进行单孢菌配对杂交，既能保证出草率又能使菌种纯度高，本发明 从子囊孢子配对杂交入手通过有性繁殖能够为生产提供稳定的菌种来源。
【具体实施方式】
[0029] 以下，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0030] 本发明的子囊座膨大虫草素含量高的北虫草菌株选育方法的具体过程为：
[0031] 步骤a，优良单孢子菌株选育；
[0032] 将成熟子实体倒悬于PDA培养基上方，自然弹射，18-22°C避光培养2-3天，可见星 芒状萌发点，选取单个萌发点，挑取多于100株于PDA斜面培养基上；20-23°C避光培养15 天后，光照3天，选择30株在PDA斜面培养基上萌发快、长势旺，菌丝粗壮，见光转色快，色 浓的菌株，转接至培养皿，20-23°C避光培养。挑选20株准备子实体培养。
[0033] 步骤b，制备液体菌种；
[0034] 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液体培养基，接种约0. 5cm2斜面菌种，置摇床 16-23°C避光培养，100r?mirT1震荡培养4天。观察液体是否浑浊，若浑浊则剔除。
[0035] 液体培养基：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖1-3%、蛋白胨0. 1-3%、磷酸二氢 钾 0? 05-0. 5%、硫酸镁 0? 01-0. 05%、水 89-96. 9%。121°C灭菌 30min。
[0036] 步骤c，出草实验；
[0037] 将所得的液体菌种通过一定比例配对转接于瓶装小麦培养基上，于18-20°C 避光培养7-15天，菌丝长满培养基后，培养温度调制20-23 °C，见光培养，光照强度 5001X-20001x，持续光照1-3天，转色后在膜上打孔通风，光照改为每天12小时，湿度控制 在65-85%，培养40天后，选择子囊座膨大显著采收并测定虫草素含量。
[0038] 固体培养基：小麦1000g、豆柏10-100g、葡萄糖10_50g、蛋白胨10-50g、磷酸二氢 钾1-58、硫酸镁0.1-0.58、￥82-片、￥86-片、含水量 55-65%。1211：灭菌30111111。
[0039] 步骤d，选择子囊膨大状菌株；
[0040] 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著且虫草素含量高的菌株， 从子囊座组织分离得到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草 试验。若上述20株菌株未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验， 筛选子囊座膨大虫草素含量高菌株。
[0041] 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著的菌株，从子囊座组织分 离得到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草试验。若上述20 株菌株未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验，筛选子囊座膨大 虫草素含量高菌株。
[0042] 下述表1为本实施例中的亲本对照菌株与选育菌株子实体在采用上述选育步骤 的情况下的子囊座直径与虫草素含量的对比表。
[0043] 根据实验结果可知，本实施例中的育种方法的子囊座直径和虫草素含量明显高于 亲本对照菌株。
[0044] 表1亲本对照菌株与选育菌株子实体和虫草素的差异
[0045]
【主权项】
1. 一种高虫草素含量的北虫草菌株选育方法，其特征在于，该具体过程为： 步骤a，优良单孢子菌株选育； 将成熟子实体倒悬于PDA培养基上方，自然弹射，18-22?避光培养2-3天，可见星芒状 萌发点，选取单个萌发点，挑取多于100株于PDA斜面培养基上；20-23°C避光培养15天后， 光照3天，选择30株在PDA斜面培养基上萌发快、长势旺，菌丝粗壮，见光转色快，色浓的菌 株，转接至培养皿，20-23°C避光培养，挑选20株准备子实体培养； 步骤b，制备液体菌种； 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液体培养基，接种约0. 5cm2斜面菌种，置摇床16-23°C 避光培养，IOOr · miiT1震荡培养4天；观察液体是否浑浊，若浑浊则剔除； 步骤c，出草实验； 将所得的液体菌种通过一定比例配对转接于瓶装小麦培养基上，于18-20°C避光培养 7-15天，菌丝长满培养基后，培养温度调至20-23°C，见光培养，光照强度5001X-20001x，持 续光照1-3天，转色后在膜上打孔通风，光照改为每天12小时，湿度控制在65-85%，培养 40天后，选择子囊座膨大显著采收并测定虫草素含量； 步骤d，选择子囊膨大状菌株； 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著且虫草素含量高的菌株，从子 囊座组织分离得到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草试验； 若上述20株菌株未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验，筛选 子囊座膨大虫草素含量高菌株； 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著的菌株，从子囊座组织分离得 到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草试验；若上述20株菌株 未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验，筛选子囊座膨大虫草素 含量高菌株。
2. 根据权利要求1所述的高虫草素含量的北虫草菌株选育方法，其特征在于，上述步 骤b中的液体培养基为：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖1-3%、蛋白胨0. 1-3%、磷酸二 氢钾 0· 05-0. 5%、硫酸镁 0· 01-0. 05%、水 89-96. 9%，121°C灭菌 30min。
3. 根据权利要求2所述的高虫草素含量的北虫草菌株选育方法，其特征在于，上述步 骤c中的小麦的固体培养基：小麦1000g、豆柏10-100g、葡萄糖10-50g、蛋白胨10-50g、磷 酸二氢钾 l_5g、硫酸镁 0. 1-0. 5g、VB2 -片、VB6 -片、含水量 55-65%，121°C灭菌 30min。
4. 一种高虫草素含量的北虫草菌株的生产工艺，其特征在于，该具体过程为： 步骤al，制作培养基，其配方为：小麦1千克，豆柏0. 05千克，虫草专用促生剂35克， 水1. 5千克； 步骤a2,配制方法：将虫草专用促生剂放入水中，搅至完全溶解即成营养液；每盒小麦 按450克、水0. 7升分装入塑料盒；分装完后用耐高温塑料膜将每个塑料盒盖严并用耐高温 松紧绳扎一道； 步骤a3,灭菌：灭菌锅内加适量水，把培养料盒放入灭菌锅，升温至100°C _121°C，保持 1-8小时；取出，冷却后移入接种室；用优质气雾消毒剂或常规方法密闭消毒30分钟，即可 穿戴消毒衣服进入接种室接种； 步骤a4,接种：进入接种室应迅速关好门；接种工具、菌种外壁、操作人员双手，用75% 酒精擦拭或浸沾消毒；采用液体菌种；在无菌条件下，打开封口材料，用接种枪将液体种喷 匀即可；接种量视容器大小而定，或在液体菌种中加入一定比例的无菌水或无菌营养液再 接种的； 步骤a5,管理：萌发室内最初将温度保持16-20°C遮光萌发8-15天；当菌丝生长至培 养基1/2-2/3时，将温度升至20°C并进行划菌；将盒从萌发室转入培养室，每天24小时光 照转色1-3天，当培养基转为橘红和出现菌丝突起时，给予10_15°C的温差刺激，温度提高 到20-23 °C;对培养室消毒30分钟，然后在塑料膜上用工具点6-18个孔，湿度保持65-85 %， 室内适量通气为子座生长提供足够氧气； 步骤a6,采收：子座呈橘红色或橘黄色球状不再生长时，总培养时间控制在50-70天； 打开盆口用小刀或剪刀将其从基部采下，放入洁净器具内及时烘干或晾干，勿暴晒以免褪 色，干燥后存放。
【专利摘要】本发明涉及一种高虫草素含量的北虫草菌株选育方法及生产工艺，通过菌种选育获得一株子囊座膨大且虫草素含量高的北虫草菌株，外形似蝌蚪，具有很好的市场前景；由于菌种的特殊性，工业化生产要求接种后，16-20℃下避光萌发8-15天，进行划菌，再光照转色1-3天，温度提高到20-23℃，转色正常后在塑料膜上用工具点6-18个孔，利于空气交换，湿度保持65-85％，总培养时间控制在50-70天。通过子囊孢子进行单孢菌配对杂交，既能保证出草率又能使菌种纯度高，本发明从子囊孢子配对杂交入手通过有性繁殖能够为生产提供稳定的菌种来源。
【IPC分类】A01G1-04
【公开号】CN104663252
【申请号】CN201510119613
【发明人】张东海, 赵军
【申请人】张东海, 赵军
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月19日