专利名称：利用ppar核受体的表达调节系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域。具体地，本发明涉及基因表达调节领域，更具体地，本发明描述研制和发展药理学调节转基因表达的新系统。本发明特别基于使用人源构建体激活转基因转录。因此，本发明描述例如在肌肉细胞中，在试管中、在活体外或在活体内能有效调节核酸表达的新组合物、构建体和方法。源于本发明的应用场合多种多样，例如见诸实验、临床、治疗或诊断方面。
控制转基因表达水平与时间对于许多应用都是必不可少的。于是，在基因治疗方面，成功的治疗可能要求特定剂量由转基因合成的蛋白。同样地，使用例如能够分开生长期和生产期的诱导型表达系统时，可改善在活体外重组蛋白的生产。构建转基因动物、研究基因作用或蛋白的生物利用率等都是属于适当控制遗传表达并带来许多改善的情况。
现有技术已设想出不同的人工转录调节基因，它们被与转基因转录启动子序列连接的异生素分子激活。
通过大肠杆菌Lac抑制子与单纯疱疹病毒(HSV)的VP16反式激活域融合构建首先说明的这些调节基因。这些调节基因有两个版本，一个可以用异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)激活，另一个被IPTG失活(Baim S.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，88，(1991)5072-5076；Labow M.及其同事，《Mol.Cell.Biol.》，10(1990)3343-3356)。
通过大肠杆菌Tet抑制子与HSV的VP16反式激活域融合构建另一个系统。这些调节基因也有两个版本，一个可用四环素或其衍生物激活，另一个可被这些同样分子失活(Gossen M.和Bujard H.，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，89，(1992)5547-5551；Gossen M.及其同事，《科学》，268(1995)1766-1769)。
S.cerevisiae的GAL4蛋白DNA的链区与黄体酮上人受体配体链区和HSV的VP16反式激活域融合构建另一个系统，这个版本可用如RU486黄体酮类似物激活(Wang Y.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，91，(1994)8180-8184)。还描述过果蝇蜕皮激素受体与HSV的VP16反式激活域融合，用蜕皮激素和这种甾类激素类似物激活(No D.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，93，(1996)3346-3351)。另一个系统利用促进某些细胞蛋白群聚的某些免疫抑制分子(环孢霉素A，纳巴霉素及其衍生物)的本领。这时，转录调节基因由两种蛋白亚单位构成，第一种可由嵌合DNA链区与FKBP人蛋白的三个复制品融合而成，第二种由FRAP人蛋白的纳巴霉素链区与人NFkB的p65亚单位反式激活域融合而成。这种转录调节基因可用有可能将两种亚单位二聚化的纳巴霉素激活(Rivera V及其同事，《Nat.Med》，2(1996)1028-1032)。
虽然这些系统在某些组织中能够达到令人满意的调节水平，但它们仍然有某些制约其使用条件的不足。因此，这些转录调节基因在人体中是异体蛋白。它们事实上是由来自细菌、病毒、酵母或昆虫的蛋白片段构成，或蛋白区是人源的时，它们由人的外部序列产生接合。这些蛋白区因此可以诱导细胞毒素的免疫反应，于是使得在异体转录调节基因控制下表达目标基因的细胞受到破坏，这样停止了转基因表达。这种情况可迫使采取重复施用治疗基因，这样构成在涉及创伤外科行为时尤为严重的缺陷，这种治疗不总是有效的，特别是在治疗基因的载体是第一次注射引起免疫反应的病毒时。另外，用现有技术的调节系统所观察到的表达水平不总是令人满意的。
因此，需要一种得到改善的表达调节系统，这种系统与在活体内使用是相容的，还可在不同组织中使用，并且还保证在激活状态下具有很高的表达水平。本发明针对这些问题提出一种解决方案。
本发明事实上涉及使用人源激活子的调节系统。这种系统应能够避免反复施用治疗基因。
本发明特别地描述一种使用PPAR核受体(激活过氧化物酶体增生子的受体)作为转录调节基因的改善诱导型表达系统。在申请WO 98/21349中曾描述过在肝特效表达系统中使用PPRE。现在，本发明的改善系统能够产生转录调节基因(人源PPAR蛋白，因此在人体中属于基本上非异体蛋白)，控制转基因表达的诱导启动子由最小启动子和对PPAR(PPRE)反应的成分组成。本发明的系统，无论在活体外还是在活体内，特别是在肌肉中，都可用PPAR特效配体激活。此外，在激活后达到的转基因表达水平与诸如hCMV-IE启动子之类强启动子表达水平相似。
本发明的系统因此在大量诱导、耐性(特别对于在活体内使用)、力和利用条件方面都具有许多优点。
因此，本发明描述了用于实施和使用这种系统的新构建体，特别是启动子区，表达盒和质粒。本发明还描述能改善基因表达控制的新的PPAR构建体以及这些不同构建体的组合。本发明还表明这些方法和组合物能在活体外和在活体内大量控制和调节表达。本发明还涉及例如包含本发明构建体的细胞，以及PPAR配体化合物的筛选方法。
更具体地，本发明第一个目的在于组合物，该组合物包含a)第一个成分，它包含在诱导启动子控制下的目的核酸，该诱导启动子包含对PPAR反应的成分和最小转录启动子，以及b)第二个成分，它包含在转录启动子控制下编码PPAR的核酸，以便同时地、分别地或以一定时间间隔地使用它们。
在更特别的方式中，本发明组合物还包括(c)PPAR配体，也是为了同时，分别地或以一定时间间隔地使用它们。
有利地，这些组合物还包含成分(d)，它包含在转录启动子控制下编码X类视黄醛衍生物受体(RXR)的核酸。
其目的在于同时地、分别地或以一定时间间隔地使用的表达表明可以分别地制备、分别地调节和相继使用成分(a)、(b)、必要时(c)和/或(d)，以便能控制目的核酸的表达。典型地，制备成分(a)和(b)以及任选的(d)并且将其包装在一起，而化合物(c)则被分开包装，并与(a)和(b)以及任选的(d)以一定时间间隔被使用，这些不同成分在细胞、组织、器官等中组合得到所要求的表达调节效果。
对此，在本发明组合物的特定实施方式中，通过不同的遗传构建体加入成分(a)和(b)和任选的(d)。
在本发明组合物的另一个特定和优选的实施方式中，成分(a)和(b)以及任选的(d)集合在同一个遗传构建体中。于是，本发明描述了能表达目的产品和PPAR的复合遗传构建体。这些构建体是特别有利的，因为，它们独自包含了在调节表达目的核酸所需的全部遗传成分。
一种或多种遗传构建体可以是天然的和/或各种不同来源的，特别是质粒附加体、染色体、病毒、噬菌体等。优选地，遗传构建体是质粒或病毒载体。
为了说明分别地带有成分(a)或(b)的质粒，例如可以列举JxnS-TK-pGL3、JxnAS-TK-pGL3、DR1xnS-TK-pGL3、DR1xnAS-TK-pGL3、JxnAS-CMV-pGL3、pSG5-hPPARg2g2或Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒，这些将在后面详细描述。
为了说明其中已集合成分(a)和(b)的质粒，例如可以列举Jx5AS-TK-Luc-bPPARg2、SV-g2-J10-C-pGL3、hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3或hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒，这些将在后面详细描述。
作为病毒载体实例，特别可以列举重组腺病毒，重组反录病毒，AAV，疱疹病毒，疫苗病毒等，其制备可以按照本领域技术人员已知方法进行。
在本文下面将更详细地描述遗传构建体的配置与结构。
对此，如前面所指出的，成分(a)包含可诱导启动子，它包含至少-对PPAR反应的成分，以及-最小转录启动子。
对PPAR反应的成分(PPRE，“过氧化物酶体增生子反应成分”)是能够固定PPAR的核酸区，PPAR链然后可以向附近核酸区传递信号。对PPAR反应的成分因此是能够连接PPAR的核酸区。为了实施本发明，对PPAR反应的成分更特别地包含一个或多个PPAR链的位点。在现有技术中曾描述过这样一些链位点，例如像在不同人的启动子中(例如AII载脂蛋白基因)。这样一些位点还可以是人工构建的，并且试验过它们的PPRE性质，如下所述。
在一种特定实施方式中，对PPAR反应的成分包含一个或多个TCAACCTTTACCCTGGTAG序列(SEQ ID NO1)位点，或这种序列的功能性变体。SEQID NO1序列相应于人apoAII启动子的J区(核苷酸-734位至-716位)。
在另一种特定实施方式中，对PPAR反应的成分包含一个或多个AGGTCAAAGGTCA序列(SEQ ID NO5)位点，或这种序列的功能性变体。SEQ ID NO5序列相应于DR1共有区。
术语功能性变体是指保持上述PPRE性质，即特别是连接PPAR的能力的所有修饰序列。这些修饰可以包括在所研究序列中一个或多个核苷酸的添加、突变、缺失和/或取代。可以采用分子生物学的常规方法，特别地例如通过定向突变发生或更实际地通过在合成器中人共合成序列加入这些修饰。一般地，变体保留至少50％标出起始序列的残留序列。更优选地，这些变体具有对所研究序列中少于5个核苷酸产生影响的修饰。这样得到的变体然后进行它们的PPRE活性试验。这些性质可采用不同方式加以证实，特别地(i)让试验序列与PPAR和X类视黄醛衍生物受体(RXR)接触，优选地在非细胞的试验中进行接触，以及(例如通过在凝胶上迁移的滞后)检测复合物形成；(ii)在包含最小启动子和报道基因的表达盒中插入试验序列，将这种盒加入细胞中，以及在存在下或不存在PPAR和PPAR配体的条件下，检测报道基因表达(如果需要测定剂量)；(iii)采用本领域技术人员已知的任何其他技术，这些技术使得可能证明例如核酸与蛋白之间的相互作用。
例如上述(ii)中测量的活性优选地至少等于用SEQ ID NO1或5序列位点测量的活性50％，更优选地至少等于75％时，变体可被认为是本发明意义的功能变体。本发明意义上的PPAR链位点的功能变体例如在下述文献中描述过Juge-Aubry等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，272(1997)25252和Nakshatri等人，《NAR》26(1998)2491，这些文献作为参考文献引用于本文。
用三个RXRα、RXRβ和RXRγ基因编码X类视黄醛衍生物受体(RXR)，其分离与序列曾得到描述(Mangelsdorf DJ等人(1990)《自然》345，224-229；Mangelsdorf DJ等人(1992)，《基因发展》6，329-344)。优选地，成分(d)编码人的RXRα。
关于PPAR/RXR异源二聚化作用，可以讨论两个考查结果Mangelsdorf DJ和Evans RM(1995)，《细胞》83，841-850和Wilson TM和Wahli W(1997)，《化学生物学中的通用观点》(Current Opinion in Chemical Biology)，1，235-241。Schulman IG等人(1998)，在《分子与细胞生物学》(Molecular andCellular Biology)，18，3483-3494中的文章描述了通过PPARγ/RXRα异源二聚体的反式激活作用。
使用成分(d)能对成分(b)的活性产生协同作用。
正如前面所指出的，在本发明组合物中，对PPAR反应的成分可以包含多个PPAR链位点。可以涉及相同位点的重复或不同位点的组合，相同位点重复是优选的。更优选地，反应成分包含多达30个链位点，优选地3-20个链位点，更优选地5-15个链位点。本发明的优选实施方式是一种包含10-15链位点的构建体，实施例中列出的结果事实上表明这样一些构建体特别是在肌肉细胞中在诱导和表达水平方面的有利性质。
为了根据本发明组合物中成分(a)制造诱导启动子，对PPAR反应的成分与最小的转录启动子结合。最小启动子是基础活性低或没有基础活性并且其基础活性在转录激活子存在(激活的PPAR与PPRE成分相互作用)下能增加的转录启动子。因此，最小启动子可以是在哺乳动物细胞中自然地弱型启动子，即对于获得显著生物作用产生无毒性表达和/或不充分表达的启动子。有利地，最小启动子是使用天然的启动子通过一种或多种具有转录活性的非必需区的缺失所制备的构建体。因此，优选地涉及一种基本上包含TATA盒的启动子，其盒的尺寸一般小于160个核苷酸，并以转录的起始密码子为中心。最小启动子还可以用强或弱细胞病毒启动子例如像疱疹病毒的胸苷激酶(TK)基因的启动子、CMV的立即启动子、PGK启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)基因启动子、骨骼肌肌动蛋白不同同种型基因的启动子、结蛋白基因的启动子、波形蛋白基因的启动子、肌球蛋白的轻链或重链基因的启动子等制备。最小启动子的特定实例例如可用CMV的-54至+48位核苷酸或TK启动子的-105至+56位核苷酸表示。应当理解，本领域技术人员可以构建由其他启动子得到这些启动子或类似构建体的所有变体，并且可用于本发明范围内。
最小启动子(Pmin)，对PPAR反应的成分(PPRE)和目的核酸(AN)功能性地配置在成分(a)中，也就是说以便使最小启动子控制目的核酸的表达，其活性由PPRE成分调节。一般地，这些区因此按照下述顺序配置，在5’->3’方向PPRE-Pmin-AN。然而，本领域技术人员可以在不背离本发明的条件下考虑任何其他的功能性配置。
另外，上述不同的功能区彼此可以直接连接或者被对成分(a)启动子的调节特性不产生明显的不利影响的核苷酸分开。这样一些核苷酸可以是在功能方面是中性残基，例如由克隆步骤得到的中性残基(PCR端，限制位点等)。这些核苷酸还可能具有生物学性质，能够赋予本发明系统以改善的特性或性能(管理基因扩增子，特异组织扩增子，沉默子，内含子，剪接位点等)。对此，在本发明的特定实施方式中，诱导启动子还包含扩增区。这样一个区有利地能够提高目的核酸表达水平。根据下述示意图(5’->3’)PPRE-Pmin-AN，这样一个扩增区(E)优选地定位在处于最小启动子与目的核酸之间的该启动子3’位。
另一方面，在本发明的构建体中，最小启动子和对PPAR反应的成分可以同样方向(即以转录方向)，或以相反方向(即与通过Pmin启动子进行的转录相比，对PPAR反应的成分处于反方向)存在。正如实施例中说明的，这两种实施方式能够如在活体内一样在活体外有效控制表达调节。
如上所述，本发明组合物的成分(b)至少包括-编码PPAR的核酸，-在第二转录启动子控制下。
PPAR属于核激素受体的超家族，并归并成三个不同的组，PPARα、PPARδ(还被称作NCU-1或PPARβ)和PPARγ。在文献中曾描述过许多人PPAR的分离和序列(具体参见Sher T.及其同事，《生物化学》，32(1993)5598-5604；Mukher jee R.及其同事，《J.Steroid Biochem.Molec.Biol.》，51(1994)157-166；Fajas L.及其同事，《生物化学杂志》，272(1997)18779-18789；Mukher jee R.及其同事，《生物化学杂志》，272(1997)8071-8076；Schmidt A.及其同事，《Mol.Endocrinol.》6(1992)1634-1641)。如专利申请WO99/05161所描述的，近来还曾克隆PPARγ启动子。
在本发明的优选方式中，编码PPAR的核酸编码了人的PPAR，具体地是PPARα或PPARγ。这些实施例中列出的结果事实上表明，使用这些分子可保证本发明系统高调节水平和高表达水平，特别是在肌肉细胞中。
根据第一个实施方式，涉及其自然形态的PPARα或PPARγ，即与自然分子相比，没有修饰原始结构。
根据另一种实施方式，涉及修饰的PPAR，它包含多个配体链位点。
对此，本发明描述并且同时涉及所有任何修饰的PPAR，它包含多个配体链位点。更特别地，涉及PPARα或PPARγ，还更优选地涉及PPARγ。优选地，本发明修饰的PPAR包含2-5个配体链位点，更优选地2-4个链位点。更特别地涉及PPAR，它包含在配体链E和F区的2-5个复制品。PPAR蛋白包含不同的区包含非依赖配体的反式激活区的A/B N-端区，作为DNA(DBD)链区的C区，作为铰链接头区的D区，以及E/F区，它包含依赖配体的反式激活区。E/F区还称之配体链区(LBD)(具体参见Schoon jans K.及其同事，《生物化学与生物物理学报》(Biochim.Biophys.Acta)，1302(1996)93-109)。E/F区的限从一个PPAR改变到另一个PPAR。作为实例，对于所使用人的PPARγ2的同种型，E/F区从284位氨基酸扩展到505位氨基酸。本发明现在表明有可能构建包含多个重复E和F区的修饰PPAR，并且这些修饰的PPAR是功能性的，具有通过PPAR配体改善的诱导性。这样一些构建体因此代表一种实施方式和本发明的特定目的。
根据本发明修饰的典型PPAR实例是包含2个配体链位点(即两个E和F区)的PPARγ。SEQ ID NO24中列出PPARγ2γ2蛋白序列。
SEQ ID NO24MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY本发明还涉及保持PPAR模式活性的SEQ ID NO24序列的所有变体(激活能力，在如BRL49653的PPAR配体存在下，包含PPRE序列的启动子)。这些变体可以被理解为所有突变体，缺失体和/或包含一个或多个互补残基的多肽。优选地，一种变体保持至少80％ ID NO24序列残基。
另外，本发明还涉及编码这样一种修饰PPAR的所有核酸。可以涉及DNA(特别是cDNA或合成的或半合成的DNA)或RNA。这个DNA可以根据本领域技术人员已知的分子生物学常规方法构建(合成，连接，库筛选等)。有利地涉及包含编码SEQ ID NO24序列多肽的序列，或与编码SEQ ID NO24多肽的序列杂化，以及编码具有PPAR模式活性多肽的所有核酸。另外，这种DNA可以包含例如启动子和/或转录终止子。
控制编码PPAR的核酸表达的第二转录启动子，可以是在哺乳动物细胞中，特别是在人的细胞中的任何强或弱的、普遍存在或选择性的、构成的或调节的功能性启动子。可以涉及家畜细胞启动子(即哺乳动物基因启动子，特别是人的基因启动子)，天然或合成的，简单或复杂的病毒、细菌、昆虫、植物启动子等。适用于这种成分(b)的启动子实例特别是病毒启动子(SV40病毒的直接启动子，CMV病毒直接启动子，反录病毒的长末端重复顺序，疱疹病毒TK启动子)或细胞的启动子(PGK启动子，白蛋白，EF1α，或在肌肉中强表达的基因，如肌的肌酸激酶(MCK)基因启动子，骨骼肌肌动蛋白的不同同种型基因的启动子，结蛋白基因的启动子，波形蛋白基因启动子，肌球蛋白的轻链或重链基因的启动子)。另外，启动子可通过加入一种或多种增强子区进行修饰，如β球蛋白基因的2基因内区的增强子区，CMV病毒的非常早期基因的增强子EF1α的增强子，一种或多种沉默子，赋予组织特效性(例如由特效组织启动子分离的区，如肌的肌酸激酶(MCK)基因启动子，骨骼肌肌动蛋白的不同异构重整体基因的启动子，结蛋白基因的启动子，波形蛋白基因启动子，肌球蛋白的轻链或重链基因的启动子)或可调节特性的区，或例如通过具有活性的非必需区的缺失进行修饰。这样一些启动子可用于表达在成分(d)中包含的RXR。
第二启动子的优选实例是病毒启动子，特别是SV40病毒早期启动子和CMV直接启动子或它们的衍生物。
另外，在特定的实施方式中，当成分(a)和(b)以及任选的(d)集合在同一遗传构建体中时，(成分(b)的)第二转录启动子和成分(a)的诱导启动子，以及任选的成分(d)的启动子可以集合以便只生成共同的启动子区，特别是双向的共同启动子区，如在下文将详细解释的那样。
对此，本发明另一个目的在于包含如前面定义的成分(a)和(b)以及任选的(d)的载体。
根据本发明的第一个实施方案，成分(a)和(b)，以及任选的(d)在载体中取相同的方向。例如用SV-g2-J10-C-pGL3质粒说明这样一种实施方案(图17)。
根据本发明的另一个实施方案，成分(a)和(b)，以及任选的(d)在载体中相反取向。例如用图16、18和19中表示的质粒说明这样一种实施方案。更优选地，在这种实施方案中，成分(a)的诱导启动子和成分(b)的转录启动子集合在载体中以便形成可调节的双向启动子。例如用图18和19中表示的质粒说明这样一种实施方式。
对此，本发明的特定目的在于一种载体，其特征在于它在5’->3’方向包含第一个编码PPAR的核酸，控制所述第一个核酸表达的第一个最小转录启动子，一个或多个对PPAR反应的成分，第二个最小转录启动子和处在所述第二个最小转录启动子控制下编码目的产物的第二个核酸。
这种构建模式是有利的，因为它允许在同一质粒中共-表达两个核酸、并且通过PPAR及其配体调节两个核酸而扩增这种表达。
一般地，在PPAR配体(成分(c))存在下，本发明组合物中目的核酸的表达被激活。对此，根据使用的PPAR，可以使用不同类型配体，天然的或合成的配体。
因此，PPARα的激活子配体例如是纤维酸盐(fibrate)，例如纤维酸及其类似物。作为纤维酸类似物，特别可以列举吉非贝齐(《动脉粥样硬化》，114(1)(1995)61)，苯扎贝特(《肝脏病学》，21(1995)1025)，环丙贝特(《BCE& M》，9(4)(1995)825)，安妥明(《药物安全》(Drug Safety)，11(1994)301)，非诺贝特(非诺贝特专论，牛津大学临床通讯，1995)，克利贝特(KidneyInternational，44(6)(1993)1352)，pirinixique酸(Wy-14643)或5，8，11，14-二十烷四酸(ETYA)。这些不同的化合物在活体外或在活体内与生物使用和/或药理学使用是相容的。
PPARγ的激活子配体可以选自天然或合成配体。作为天然配体，可以提及脂肪酸和eicosanoides(例如亚油酸，亚麻酸，9-HODE，5-HODE)，作为合成配体，可以列举噻唑烷二酮，具体如rosiglitazone(BRL49653)，pioglitazone或troglitazone(例如参见Krey G.及其同事，《Mol.Endocrinol.》11(1997)779-791或Kliewer S.和Willson T.《(Curr.Opin.IN Gen.Dev.》8(1998)576-581)或化合物RG12525。
另外，本发明的组合物可以包含几种配合的PPAR的激活子，特别是与视黄醛衍生物配合的纤维酸盐或纤维酸盐类似物。
本发明还有一个目的是使用如前面定义的组合物或载体，表达在活体外或试管内细胞中的目的核酸。
对此，核酸可以是编码目的产物(RNA、蛋白、多肽、肽等)的任何核酸(DNA，RNA)。可以涉及农业食品、治疗、疫苗、标记物等的目的产物。
本发明还涉及上述组合物或载体在制备用于表达在活体内细胞中目的核酸的产品方面的应用。
本发明还涉及调节表达细胞中核酸的方法，该方法包括让所述细胞与前面定义的组合物或载体接触。
对于在试管或在活体外应用，根据不同的方案，细胞可以与本发明的组合物或载体进行接触。因此，培养物中的细胞可以与本发明的成分(a)、(b)和(c)以及任选的(d)一起，例如与包含成分(a)和(b)的载体并且在配体(c)存在下直接培养。作为可供选择替代的方案，细胞首先可以与成分(a)和(b)，以及任选的(d)一起培养(具体地集合在同一个载体中)，然后，其次(在培养与任选地选择修饰细胞后)，可以加入成分(c)。这后一种方案例如能够将培养期(或细胞扩展期)与核酸表达期分开。这些试验可以在任何设备和适当介质中进行，优选地在板、盒、瓶中在灭菌条件下进行。本领域技术人员根据实施例中提供的信息及其常识很容易确定细胞、载体和配体的量。
对于活体内应用，细胞(或器官，组织等)以同时，分开或以一定时间间隔的方式加入成分(a)、(b)和(c)，以及任选的(d)进行接触。为此，一般地通过肠胃外、特别地采用肌内、静脉内、皮下、皮内、肿瘤内或立体定位途径任选地以唯一遗传构建体形式加入成分(a)和(b)以及任选的(d)。可以由所考虑的应用，靶组织和/或被转基因编码的目的产物类型指导用药方式的选择。对于这种用药，本发明组合物可以包含任何有利于细胞转染的试剂(阳离子聚合物，脂类等)。在特定方式中，采用肌内方法给药该组合物，以“null露”核酸形式，即在无添加的转染剂存在下使用遗传构建体。
同样地，在采用病毒载体加入成分(a)和(b)以及任选的(d)时，无需任何补充的转染剂。
正如实施例中所描述的，配体(c)可以在成分(a)和(b)以及任选的(d)之前、与其同时或之后加入。
对此，例如可以采用口服、肛门、静脉内、腹膜内或肌内途径给药配体。
本领域技术人员根据文献中公开的在活体内的数据可调整使用的剂量。因此，例如对于在水中不溶的形式，如BRL49653配体典型剂量是5-50毫克/千克，例如30毫克/千克，这样的剂量至少能够达到质粒浓度接近大约15微克/毫升。对于其生物利用率较大的配体的水溶性形式(例如BRL49653马来酸盐)，典型剂量较低，一般低于5毫克/千克，例如0.01-1毫克/千克。本领域技术人员显然可以根据使用的构建体、使用的配体以及所寻求的应用与效果，可调整这些剂量。一般地，实施例中列出的结果有利地表明，本发明组合物以配体剂量低于通常使用的剂量能够达到在活体内强而可调节的表达。另外，尽管可以反复给药配体，但列出的结果还表明，仅一次给药配体后表达就很强。
一般地，根据所寻求的应用，使用的载体剂量可以是0.01-1000微克或更多。
本发明可以用于在试管中，在活体外或在活体内表达不同类型细胞、组织或器官中的基因。特别地，可以涉及哺乳动物，优选地人的细胞、组织或器官。说明性地，可以列举肌细胞(或肌肉)，肝细胞(或肝脏)，心脏细胞(或心脏，动脉壁或血管壁)，神经细胞(或脑，骨髓等)或肿瘤细胞(或肿瘤)。
优选地，本发明的构建体、组合物和方法用于在试管中、在活体外或在活体内调节表达肌细胞(或肌肉)中的核酸。实施例中列出的结果更特别地说明了在活体内或在试管中在这类细胞中本发明所呈现的优点。
本发明还涉及通过与上述组合物或载体接触所修饰的任何细胞。
本发明还涉及上述组合物、载体或细胞的应用，其中目的核酸是用于在试管中，在活体外或在活体内(特别在肌细胞或肌肉中)筛选PPAR配体的报道基因(例如分泌的荧光素酶或碱性磷酸酶)。对此，本发明还描述了PPAR配体鉴定方法，该方法包括使上述细胞与试验分子(或组合物)接触并且证明目的核酸的表达(它优选地是报道基因)。为了评价试验化合物的活性，还可以将这种表达与没有试验化合物或有参比配体时所观察的表达进行比较。
本发明还涉及如前面定义的组合物或载体在构建转基因动物，特别是非人哺乳动物方面的应用，这些转基因动物对于潜伏期研究或生物利用率、标记等研究是很有效的。
通过下述实施例更详细地描述本发明，这些实施例被认为是说明性的，而不是限制性的。
图1图示法说明FTKpGL3质粒。
图2图示法说明Jx3S-TK-pGL3质粒。
图3图示法说明Jx3AS-TK-pGL3质粒。
图4图示法说明DR1x3S-TK-pGL3质粒。
图5图示法说明DR1x3AS-TK-pGL3质粒。
图6鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克FTKpGL3质粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3质粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3质粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3质粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3质粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARg2质粒，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图7鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克FTKpGL3质粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3质粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3质粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3质粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3质粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARa(Koz)质粒，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图8图示法说明Jx5AS-CMV-pGL3质粒。
图9鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克Jx5AS-TK-pGL3质粒(a)，或Jx5AS-CMV-pGL3质粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2质粒，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图10鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克JxnAS-TK-pGL3质粒；②10纳克pSG5-hPPARg2质粒，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图11鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克JxnAS-CMV-pGL3质粒；②10纳克pSG5-hPPARg2质粒(a)或50纳克pSG5-hPPARg2质粒(b)，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图12图示法说明pSG5-hPPARg2g2质粒。
图13hPPARg2和hPPARg2g2转录调节基因的比较。鼠的成肌细胞(C2C12)用①10纳克Jx10AS-CMV-pGL3质粒；②增加量的pSG5-hPPARg2质粒(a)或pSG5-hPPARg2g2质粒(b)，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。诱导启动子的活性表示了用Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinuspyralis的荧光素酶活性用pSG5-hPPARg2质粒或pSG5-hPPARg2g2质粒得到的BRL49653的诱导因子。通过用DMSO存在下的活性除以在BRL49653存在下的活性，可计算出这个诱导因子。
图14图示法说明Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒。
图15鼠的成肌细胞(C2C12)在试管中瞬时转染时所评价的诱导启动子的活性。这些细胞用①10纳克Jx10AS-CMV-pGL3质粒(a)，或Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2g2质粒，以及③20纳克pRL-null质粒进行共转染。每个诱导启动子的活性表示通过Renilla reniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图16图示法说明Jx5AS-TK-luc-hPPARg2质粒。
图17图示法说明SV-g2-J10-C-pGL3质粒。
图18图示法说明hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3质粒。
图19图示法说明hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒。
图20在试管中不同诱导系统版本的比较。每个系统版本，使用相同摩尔数的诱导表达盒转染鼠的成肌细胞(C2C12)。以通过使用pCMV-前导TK质粒得到的hCMV-IE启动子活性百分数表示这些结果。通过用有DMSO存在时的活性除以有BRL49653存在时的活性，可计算出BRL49653诱导因子。1＝pSG5-hPPARg2+Jx5AS-TK-pGL3；2＝Jx5AS-TK-luc-hPPARg2；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；5＝SV-g2-J10-C-pGL3；6＝hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3；7＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3；8＝hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3；9＝hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3。
图21BRL49653和RG12525配体在试管中的比较。鼠的成肌细胞(C2C12)用①10纳克其表达盒存在于(a)的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒；和②10纳克pRL-null质粒(b)进行转染。诱导启动子的活性表示通过Renillareniformis的荧光素酶活性标准化的Photinus pyralis的荧光素酶活性。
图22在活体中不同诱导系统版本的比较。在C57Bl/6鼠(每组6只鼠)颅侧胫骨两侧注射对于每个系统版本而言相同摩尔数的诱导表达盒。在每块肌肉上施加电转移。处理的动物每天采用强饲法接受30毫克/千克BRL49653。在注射DNA后四天，动物经宰杀后，取下肌肉测量荧光素酶活性。1＝pCMV-前导TK；2＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3。
图23在活体内不同BRL49653诱导方案的比较。在C57Bl/6鼠(每组6只鼠)颅侧胫侧骨两侧注射10微克包含1微克其表达盒存在于(a)中的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒的DNA。用不同诱导方案得到的活性汇集在部分(b)中。
图24图示法说明pRDA02质粒。
图25在活体内用诱导系统得到的诱导动力学。(A)在十只C57Bl/6鼠颅侧胫侧骨两侧注射包含3毫克pRDA02质粒和3毫克pSG5-hPPARg2质粒的DNA混合物。这时在每块肌肉上施加电转移。在注射DNA后第四天，然后第39天，采用强饲法用30毫克/千克BRL49653处理动物。在不同时间抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix，PE Biosystem，Foster City，CA)，测量质粒中分泌的碱性磷酸酶的酶活性。(B)在C57Bl/6鼠(两组各十只)颅侧胫侧骨两侧注射包含3毫克pRDA02质粒和3毫克pSG5-hPPARg2质粒的DNA混合物。这时在每块肌肉上施加电转移。在注射DNA后四天，采用强饲法，动物或者仅一次接受剂量30毫克/千克BRL49653，或者5天内每天接受一次剂量(30毫克/千克)。在不同时间取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，测量血浆中hSeAP的酶活性。列出的结果(诱导因子)相应于在有意义那天测量的hSeAP活性与第四天得到的活性的比。
图26在活体内比较不同PPARg配体并且研究其中一种配体的剂量效果。在C57Bl/6鼠(每组五只)颅侧胫骨两侧注射包含5毫克pRDA02质粒和5毫克pSG5-hPPARg2质粒的DNA混合物。这时在每块肌肉上施加电转移。在注射DNA后六天(A)或十天(B)，采用强饲法，动物或者用不同的PPARg配体(A；BRL49653，ActosTM(Takeda Phamaceuticals)和AvandiaTM(SmithKline Beecham))，或者用不同剂量BRL49653(B)处理。在不同时间抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，测量血浆中hSeAP的酶活性。列出的结果(诱导因子)相应于在有意义那天测量的hSeAP活性与第六天(A)或第十天(B)得到的活性的比。
图27图示法说明Jx10AS-CMV-VEGFA165质粒。
材料与方法分子生物学中通常使用的方法，例如质粒DNA制备提取法，质粒DNA的氯化铯梯度离心法，琼脂糖凝胶电泳法，DNA片段电洗脱纯化法，在盐介质中采用乙醇或异丙醇完成的质粒DNA沉淀法，在大肠杆菌中转化法，都是本领域技术人员熟知内容并且在文献中作过大量描述(Sambrook及其同事，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
被用于克隆不同启动子区的pGL3-Basic质粒以及pRL-null质粒都是商业来源的质粒(Promega Corportion)，pSG5(Stratagene)，pBluescript IISK+(Stratagene)和pSL301(Invitrogen Corportion)质粒也是商业来源的质粒。前面描述过构建pSG5-hPPARg2表达质粒(Fajas及其同事，《生物化学杂志》272，(1997)18779-18789)和pSG5-hPPARa(Koz)(Gervois P.及其同事，《Mol.Endocrinol.》13(1999)400-409)。
在25/09/98的法国专利申请FR98/120000和美国专利申请US SN 60/123298(临时申请)中也描述过构建pCMV-前导TK质粒。
需要注意的是这种质粒以下述方式构建。Tanaka及其同事描述过的pCGN表达载体(《细胞》，60(1990)375-386)包含CMV启动子(-522/+72)，在编码血凝素抗原决定簇的序列上游，该启动子与HSV的tk基因(+51/+101)的《顶枝》融合。pGCN质粒(10纳克)被用作ACP扩增的基质。曾使用的引物如下
-6718引物(5’CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG3’)(SEQ ID NO26)，这种引物与-522位的CMV启动子(在pGCN的EcoRI位点下游8个核苷酸)杂化。
-6719引物(5’GGGACGCGCTTCACAAGGCGCTGGCCGAA3’)(SEQ ID NO27)，这种引物发生杂化直到tk《前导区》的101位为止。如下面所解释的，采用粗体字标记的第一核苷酸G用于修复pGL3-Basic的Ncol位点。
如此得到的ACP片段经纯化后，再用T4噬菌体的多核苷酸激酶进行磷酸化(New Englands Biolabs)。同时，pGL3-Basic载体(Promega)用Ncol线性化，纯化，然后用Klenow DNA聚合酶(Boehringer Manheim)处理，以便填平Ncol位点。这种载体然后用碱性磷酸酶(Boehringer Manheim)进行去磷酸化，再用于插入磷酸化ACP片段。于是，只有当用在pGL3-Basic的HindIII位点下游的5’部分(6718引物，CMV的-522位)使CMV-前导区tk片段定向，并且其3’端(6719引物，前导区tk)与pGL3-Basic的Ncol位点(荧光素酶的第一个ATG)连接时，6719引物的鸟苷(G)能够修复Ncol位点。得到的质粒命名为pCMV-前导TK。
根据生产者的推荐，通过使用DNA热循环器TM(Perkin Elmer Cetus)，可以借助ACP(通过聚合酶扩增链)技术进行DNA片段酶扩增。
根据生产者的推荐，使用电穿孔仪在大肠杆菌细胞中进行质粒DNA的电穿孔。
采用Sanger及其同事研制的方法(《Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.》74，(1977)5463-5467)，根据生产者推荐，使用由应用生物系统提供的试剂盒，确认核苷酸序列。
在补充10％胎牛血清(SVF)的DMEMTM介质(Life Technologies Inc.)中培养C2C12鼠的成肌细胞。在37℃烘箱中，在潮湿气氛与5％CO2分压下进行培养。
在24孔板中进行转染，每个转染进行三次。在转染前二十四小时，每个孔接种在DMEMTM介质中的3×104个细胞。对于每个孔，500纳克质粒DNA(目的质粒和pBluescript II SK+，以补充到500纳克)与RPR120535 B阳离子脂类(WO97/18185)，按照每微克DNA 6纳摩尔脂类，在包含150毫摩尔NaCl和50毫摩尔碳酸氢盐的DMEMTM介质(最后20微升)中混合。在室温下20分钟后，在没有SVF的情况下，20微升DNA/脂类混合物与这些细胞接触2小时。培养介质这时补加SVF和ULTROSERTM(BioSepra Inc.)，以便最后浓度分别达到10％或2％。与SVF或ULTROSERTM同时，将溶于DMSO中的PPAR配体加入培养介质中。在转染后四十八小时，取出培养介质，用PBS(Life Technologies Inc.)清洗细胞两次。这时根据供应商的推荐，使用Dual-Luciferase Reporter AssaySystemTM(Promega)，测定Renilla pyralis的荧光素酶活性和Renillarenifomis的荧光素酶活性。
用6周龄C57BI/6雌鼠在活体内进行基因转移试验。这些动物用250微升氯胺酮(Rhne Mérieux，最后为10毫克/毫升)/甲苯噻嗪(Bayer Pharma，最后为0.3毫克/毫升)的混合物，通过腹膜内方式进行麻醉。这时，在每个颅侧胫骨肌中注射总量为10微克DNA。然后，每个爪被施加电场(频率1Hz；在250伏/厘米下4个脉冲，每个脉冲为20毫秒)。在整个试验期，在每天早晨采用强饲法，让这些动物接受30毫克/千克BRL49653(SmithKline Beecham)在1％(重量/体积)羧基纤维素中的溶液，或者只是接受1％羧基纤维素。在转移基因后四天，宰杀这些动物，在Lysing MatrixTM管(BIO 101，Inc.)的PLBTM细胞溶解缓冲液(Promega Corporation)中取下肌肉。使用FastPrepTM(BIO 101，Inc.)以6.5米/秒磨碎肌肉25秒，这样能够提取荧光素酶。根据供应商推荐，这时使用Luciferase Assay SystemTM盒(Promega Corporation)测定Photinuspyralis的荧光素酶活性。
实施例实施例1用PPAR构建诱导启动子和构建包含这些启动子的表达质粒1.1 FTKpGL3质粒使用pBLCAT2质粒(Luckow B.和Schutz G.，《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)，15(1987)5490)作为基质并且利用5’CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGCCCA GCG 3’(SEQ ID NO28)和5’TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3’(SEQID NO2)寡核苷酸作为引物借助ACP扩增相应于一部分1型单纯疱疹病毒TK基因启动子的DNA片段，与转录起始位点相比，该片段位-105位至+56位之间。这个片段用BaIII和HindIII消化，然后在预先用BaIII和HindIII消化的pGL3-Basic质粒中进行克隆，以便得到FTKpGL3质粒。这个质粒的示意图说明于图1中。
1.2 JxnS-TK-pGL3质粒使用J3TK-pGL3质粒(Vu-Dac N.及其同事，《J.Clin.Invest.》96(1995)741-750)作为基质并且利用3RDA37(5’ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTAGAG GAT CTC TAC CAG G3’；SEQ ID NO3’)和4RDA48(5’CGA TGG TAC CCT CGAGCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3’；SEQ ID NO4)寡核苷酸作为引物，借助ACP使包含一个或多个(n)人ApoA-II基因的启动子J位点的DNA片段扩增。这个片段用Xhol和Spel消化，然后在预先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3质粒中，沿TK(S)最小启动子转录方向进行克隆，以便根据存在的J位点数得到Jx1S-TK-pGL3、Jx2S-TK-pGL3和Jx3S-TK-pGL3质粒。Jx3S-TK-pGL3质粒的示意图如图2所示。
通过使用J3TKpGL3质粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作为引物被ACP扩增的、用Xhol和Spel消化的DNA片段，也在预先用Xhol和Nhel消化的Jx3S-TK-pGL3质粒中克隆，以便根据存在的J位点数得到Jx4S-TK-pGL3、Jx5S-TK-pGL3和Jx6S-TK-pGL3质粒。
1.3 JxnAS-TK-pGL3质粒A JxnAS-TK-pGL3质粒在存在于诱导启动子中的J位点定向方面与JxnS-TK-pGL3质粒不同。通过使用J3TKpGL3质粒作为基质，3RDA37和4RDA48寡核苷酸作为引物借助ACP扩增包含一个或多个人ApoA-II基因的启动子J位点的DNA片段。这个片段用Sall和Nhel消化，然后在用Xhol和Nhel预先消化的FTXpGL3质粒中，沿TK(AS)最小启动子转录相反方向进行克隆，以便根据存在的J位点数得到Jx1AS-TK-pGL3、Jx2AS-TK-pGL3和Jx3AS-TK-pGL3质粒。Jx3AS-TK-pGL3质粒的示意图如图3所示。
通过使用J3TKpGL3质粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作为引物被ACP扩增的、用Kpnl和Spel消化的DNA片段，也在预先用Kpnl和Nhel消化的Jx3AS-TK-pGL3质粒中，沿反方向(AS)进行克隆，以便根据存在的J位点数得到Jx4AS-TK-pGL3和Jx5AS-TK-pGL3质粒。
1.4 DR1xnS-TK-pGL3质粒这些质粒包含被称作共有DR1的共有序列(AGGTCA A AGGTCA，SEQ ID NO5)作为对PPAR反应的成分(PPRE)。通过使用1RDA69(5’ACG TGT CGA CAC TAGTCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AACTAG3’；SEQ ID NO6)和2RDA64(5’CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCGTGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3’；SEQ ID NO7)寡核苷酸作为引物借助ACP扩增包含一个或多个共有DR1位点的DNA片段。这个片段用Xhol和Spel消化，然后在预先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3质粒中，沿取向方向进行克隆，以便根据存在的共有DR1位点数得到DR1x2S-TK-pGL3和DR1x3S-TK-pGL3质粒。DR1x3S-TK-pGL3质粒的示意图如图4所示。
通过使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作为引物时借助ACP扩增的用Xhol和Spel消化的DNA片段，还在用Xhol和Nhel预先消化的DR1x3S-TK-pGL3质粒中进行克隆，以便根据存在的共有DR1位点数得到DR1x5S-TK-pGL3、DR1x6S-TK-pGL3和DR1x7S-TK-pGL3质粒。
1.5 DR1xnAS-TK-pGL3质粒DR1xnAS-TK-pGL3质粒与DR1xnS-TK-pGL3质粒在存在于诱导启动子中的共有DR1位点的定向方面不同。通过使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作为引物借助ACP扩增包含一个或多个共有DR1序列的DNA片段。这个片段用Sall和Nhel消化，然后在预先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3质粒中，沿反方向进行克隆，以便根据存在的共有DR1位点数得到DR1x2AS-TK-pGL3和DR1x3AS-TK-pGL3质粒。DR1x3AS-TK-pGL3质粒的示意图如图5所示。
通过使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作为引物借助ACP扩增的Kpnl和Spel消化的DNA片段，还在预先用Kpnl和Nhel消化的DR1x3AS-TK-pGL3质粒中进行克隆，以便根据存在的共有DR1位点数得到DR1x5AS-TK-pGL3和DR1x6AS-TK-pGL3质粒。
实施例2PPAR对不同反应成分的特效性2.1.使用hPPARg2的系统在鼠的成肌细胞瞬时转染中(图6)，曾评价过使用hPPARg2作为转录调节基因时诱导启动子的活性。这些结果表明，根据使用的反应成分(PPRE)，使用hPPARg2(BRL49653)的配体的诱导作用与激活后最后的活性都随之改变。使用J位点作为PPRE时得到最佳结果。另外，PPRE方向也很重要。在J位点的情况下，AS方向更为有利(部分c)。
2.2.使用hPPARa的系统使用hPPARa作为转录调节基因所得到的结果汇集于图7。与hPPARg2相反，对于hPPARg2，共有DR1才是最佳PPRE(部分d和e)。
因此，这些结果表明(1)本发明质粒的泛函性和(2)根据选自诱导系统的PPAR，重要的是选择对转录调节基因最合适的PPRE。由于配体存在，这种选择可能影响诱导因子，但也影响诱导后所达到的活性水平。不言而喻，其他PPRE也可以用于本发明系统。
实施例3用PPAR构建诱导启动子，它们包含除HSV1-TK启动子外的最小启动子，例如像hCMV-IE最小启动子3.1.构建包含hCMV-IE最小启动子的质粒通过使用pCMVβ质粒(Clontech)作为基质并且利用5RDA32(5’ACG TAGATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3’；SEQ ID NO8)和6RDA29(5’ACG TAAGCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3’；SEQ ID NO9)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增包含hCMV-IE最小启动子(相对于转录起始位点从-54位到+48位)的DNA片段。这个片段用HindIII和BqIII消化，然后在用HindIII和BqIII预先消化的FTKpGL3质粒中进行克隆，以便得到FCMVpGL3质粒。
用BgIII和Nhel消化Jx5AS-TK-pGL3质粒，以便分离包含5个J位点复制品的179pb BgIII-Nhel片段。这个片段被插入用BgIII和Nhel预先消化的FCMVpGL3质粒以便得到Jx5AS-CMV-pGL3质粒。Jx5AS-CMV-pGL3质粒示意图如图8所示。
用Sphl和Nhel消化Jx5AS-CMV-pGL3质粒，分离出包含5个J位点复制品，hCMV-IE最小启动子和编码荧光素酶的基因5’部分的982pb Sphl-Nhel片段。这个片段被插入用Sphl和Spel预先消化的Jx5AS-CMV-pGL3质粒中以便得到Jx10AS-CMV-pGL3质粒。根据同样的构想，可得到Jx15AS-CMV-pGL3和Jx20AS-CMV-pGL3质粒3.2.包含hCMV-IE最小启动子的质粒活性在瞬时转染时，对可被用于诱导系统中的最小启动子进行过比较。汇集于图9中的结果表明，根据最小启动子，诱导后的最后活性可以增大或减少一倍。这些结果特别地表明，在试验条件下，CMV启动子似乎给出较高的活性。当然，其他的最小启动子，如不包含TATA盒的启动子，也可以使用。
实施例4在诱导启动子中存在的反应成分数的重要性在瞬时转染时，对存在于诱导启动子中的PPRE数的最优化进行研究。在图10中列出的结果表明，PPRE复制品数量越大，配体的诱导因子和诱导活性就越高。相反地，如果这个数太大，诱导因子和诱导活性同时随之降低，不管试验中存在的hPPAPRg2量如何都是如此(图11)。最佳PPRE数似乎是10-15。
实施例5用PPAR的配体构建强诱导的转录调节基因5.1.构建包含两个配体链区复制品的转录调节基因。构建pSG5-hPPARg2g2质粒通过使用pSG5-hPPARg2质粒作为基质并且利用20RDA21(5’GGT TTG CTGAAT GTG AAG CCC 3’；SEQ ID NO10)和21RDA42(5’AGT CTC TAG AGC TAC GCGTAC AAG TCC TTG TAG ATC TCC TGC3’；SEQ ID NO11)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增被标记为A的DNA片段，该片段包含编码F区C-端部的hPPARg2的互补DNA区。通过使用pSG5-hPPARg2质粒作为基质并且利用22RDA32(5’AGTCAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3’；SEQ ID NO12)和23RDA21(5’GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3’；SEQ ID NO13)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增被标记为B的DNA片段，该片段包含编码E和F区的hPPARg2互补DNA区。用Sacl和Mlul消化的A片段与用Mlul和Xbal消化的B片段一起，在用Sacl和Xbal预先消化的pSG5-hPPARg2质粒中进行克隆，得到pSG5-hPPARg2g2质粒。其示意图如图8所示的这个质粒包含编码转录调节基因(记为hPPARg2g2)的互补DNA，而该调节基因包含两个E和F区复制品，即两个配体链区。
下面列出PPARγ2γ2的完全序列(SEQ ID NO24)MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY
包含E和F区的PPARγ2γ2的C-端部分的序列是下述SEQ ID NO25序列MMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY5.2.pSG5-hPPARg2g2质粒的活性图13中列出的结果表明，如果使用hPPARg2g2作为转录调节基因时，诱导活性比较低(图13a和b)，则使用这种调节基因时，配体的诱导因子(图13c)明显地较高。两种转录调节基因之间的差别可用下述事实解释对于hPPARg2g2，没有配体存在时系统的基底噪声是低的，尽管存在一定量的调节基因，但仍然保持低水平。另一方面，hPPARg2g2量增加越大，诱导活性也越强，使用看来饱和的hPPARg2的系统就不是这种情况。
因此，第二个配体链区(hPPARg2g2)的存在通过配体赋予转录调节基因以更大的诱导性。
实施例6提高诱导启动子的最后活性6.1.构建包含hEF1a基因内区的诱导表达盒。构建Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒通过使用25RDA35(5’AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG3’；SEQ ID NO14)和26RDA36(5’AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTCACG ACC 3’；SEQ ID NO15)寡核苷酸作为引物借助ACP扩增包含编码hEF1a的基因的第一个基因内区的DNA片段(相对于转录起始位点从+16位到+984位；进入Genbank的编号E02627)。这个片段用HindIII和NcoI消化，然后在用HindIII和NcoI预先消化的Jx10AS-CMV-pGL3质粒中进行克隆，得到Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒。Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒示意图如图14所示。
6.2.Jx10AS-CMV-EF-pGL3质粒的活性为了提高系统的最后活性，在诱导启动子附近克隆位于hEF1a基因的第一个基因内区中的增强子序列。图15中列出的结果表明，增强子区的存在提高了系统的诱导活性，无论转录调节基因使用量为多少仍然如此。
实施例7构建同时包含转录调节基因表达盒和诱导表达盒的质粒7.1.Jx5AS-TK-luc-hPPARg2质粒用Mlul和Scal消化pSG5-hPPARa(Koz)质粒，以便分离包含hPPARa互补DNA的3’区的1229pb Mlul-Scal片段。这个片段插入用Mlul和Smal预先消化的pSL-301质粒中，得到pSL-3’hPPARa质粒。
用Sall和Mlul消化pSG5-hPPARa(Koz)质粒，以便分离包含SV40病毒早期启动子和hPPARa互补DNA的5’区的1406pb Mlul-Scal片段。这个片段插入用Xhol和Mlul预先消化的pSL-3’hPPARa质粒，得到pSL-hPPARa质粒。
用Spel和Sall消化pSL-hPPARa质粒，以便分离包含SV40病毒早期启动子和hPPARa互补DNA的2664pb Spel-Sall片段。这个片段插入用Spel和Sall预先消化的pBluescript II SK+质粒中，得到pBS-hPPARa质粒。
用Avrll和Sacl消化pSG5-hPPARg2质粒，以便分离包含hPPARg2互补DNA的5’区的2070pb Avrll-Sacl片段(标记为C)。通过使用pSG5-hPPARg2质粒作为基质并且利用10RDA21(5’CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3’；SEQ ID NO16)和11RDA40(5’TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTGC3’；SEQ ID NO17)寡核苷酸作为引物；借助ACP扩增包含hPPARg2互补DNA的3’区的DNA片段(标记为D)。在用Avrll和Sall预先消化的pBS-hPPARa质粒中，使采用Sacl和Sall消化的片段C和片段D一起进行克隆，得到pBS-hPPARg2质粒。
使用Kpnl和Sall消化Jx5AS-TK-pGL3质粒，以便分离在诱导启动子控制下包含luc+基因的2324pb Kpnl-Sall片段。这个片段插入用Kpnl和Sall预先消化的pBS-hPPARg2质粒中，得到Jx5AS-TK-luc-hPPARg2质粒。Jx5AS-TK-luc-hPPARg2质粒示意图如图16所示。
7.2.SV-g2-J10-C-pGL3质粒用Notl和Sall消化pBS-hPPARg2质粒，以便分离在SV40早期启动子控制下包含hPPARg2互补DNA的2622pb Notl-Sall片段(标记为E)。通过使用FTK-pGL3质粒作为基质并且利用18RDA31(5’AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACATGA TAA G 3’；SEQ ID NO18)和19RDA35(5’AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTTATC GAT TTT ACC AC 3’；SEQ ID NO19)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增包含SV40病毒的多腺苷酸化位点的DNA片段(标记为F)。在用Notl和Nhel预先消化的Jx10AS-CMV-pGL3质粒中，使采用Sall和Nhel消化的片段E和片段F一起进行克隆，得到SV-g2-J10-C-pGL3质粒。SV-g2-J10-C-pGL3质粒示意图如图17所示。
7.3.hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3质粒通过使用Jx5AS-TK-luc-hPPARg2质粒作为基质并且利用12RDA50(5’GTCAGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3’；SEQID NO20)和13RDA42(5’TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGAGTT TGG 3’；SEQ ID NO21)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增包含hPPARg2互补DNA的DNA片段(标记为G)。通过使用pCMVβ质粒作为基质并且利用14RDA33(5’GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3’；SEQ ID NO22)和15RDA33(5’TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GCG 3’；SEQID NO23)寡核苷酸作为引物，采用ACP扩增包含hCMV-IE最小启动子(相对于转录启动位点，从-54位到+48位)的DNA片段(标记为H)。在用Kpnl和Nhel预先消化的Jx5AS-TK-pGL3质粒中，采用Kpn和Xhol消化的片段G和采用Xhol和Nhel消化的片段H一起进行克隆，得到hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3质粒。hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3质粒示意图如图18所示。
7.4.hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3质粒用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3质粒，以便分离在诱导启动子控制下包含luc+基因5’区的982pb Nhel-Sphl片段。这个片段插入用Spel和Sphl预先消化的hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3质粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒。hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒示意图如图19所示。
用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3质粒，以便分离在诱导启动子控制下包含luc+基因5’区的982pb Nhel-Sphl片段。这个片段插入用Spel和Sphl预先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3质粒。
用Nhel和Sphl消化Jx10AS-CMV-pGL3质粒，以便分离在诱导启动子控制下包含luc+基因5’区的1151pb Nhel-Sphl片段。这个片段插入用Spel和Sphl预先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3质粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3质粒。
实施例8在活体外不同诱导系统版本的比较图20汇集了在活体外用多种诱导系统版本得到的结果。这些结果表明，与仅具有一个质粒的系统(图20，曲线2和5-9)一样，使用两个质粒的系统(图20，曲线1、3和4)是功能性的也就是说PPARg(在此为BRL49653)配体的存在明显增强了置于诱导启动子控制下的基因表达。还应该指出，对于某些系统(图20，曲线3和7-9)，配体诱导因子高于30，而对于图20曲线4所示系统，诱导后的活性等于强启动子的活性，如hCMV-IE启动子活性。
实施例9不同的PPAR配体能够激活诱导系统9.1.使用hPPARg2的系统图21中的结果表明除BRL49653外的hPPARg配体，在此为RG12525(hPPARg的RPR配体)，可以用于激活诱导系统。在100微摩尔浓度下，用RG12525处理甚至得到与采用BRL49653得到的诱导作用相比更强的诱导作用。hPPARg的所有其它配体因此可以用作系统的诱导剂。
9.2.使用hPPARa的系统与使用hPPARg的系统一样，使用hPPARa作为转录调节基因的系统可以用例如纤维酸盐或WY-14643或hPPARa的任何其它配体激活。
实施例10在活体内在肌肉中可以激活诱导系统图22汇集了使用不同版本的诱导系统在活体肌肉中所得到的结果。这些结果表明，对于三种试验的版本(图22，曲线2-4)，采用强饲法用hPPARg配体处理能够在肌肉中明显提高诱导启动子的活性。诱导因子是，图22曲线2版本为×14，图22曲线3版本为×8，图22曲线4版本为×24。此外，对于其中一个版本(图22曲线2)，在被BRL49653处理的动物体内所达到的活性与诸如hCMV-IE启动子之类强启动子的活性处于同一数量级。
在图23中列出的结果还表明，仅一次施用配体就可以诱导该系统，并且这种施用可在基因转移前或后进行。这个试验还表明比常用剂量小两倍的剂量就能够达到同样的诱导因子。
使用PPAR核受体作为转录调节基因的系统，因此在活体内是功能性的，通过口服PPAR配体可以诱导该系统。
实施例11构建能够诱导表达分泌产物的基因的质粒11.1.构建pRDA02质粒用HindIII和Mlul消化Jx10AS-CMV-pGL3质粒，以便分离459pbHindIII-Mlul片段。这种片段插入用HindIII和Mlul预先消化的pXL3010质粒中(Bettan M.及其同事，《Anal.Biochem.》，271(1999)187-189)，得到pRDA02质粒。这种质粒包含编码人胎盘碱性磷酸酶分泌形式(hSeAP)的基因的互补DNA，其磷酸酶表达通过利用PPAR作为转录调节基因的系统处在诱导的启动子控制下。pRDA02质粒示意图说明于图24中。
实施例12诱导系统能够在活体内调节分泌蛋白中的质粒浓度图25中列出的结果表明，使用诱导系统时，可以随时调节由肌肉分泌的蛋白中的质粒浓度，这一点可以通过仅口服一次PPAR配体来实现。在施用配体后两天，增加hSeAP质粒浓度的17倍(图25A)，一星期后恢复到其基础水平。在第21天至第39天之间，观察到对人源的hSeAP免疫反应，并表现为这种蛋白质粒浓度降低。尽管存在这种免疫反应，仍然可能进行第二个诱导周期(图25A)。
正如图25B所表明的，每天多次服用配体，在与处理时间相同的时间内，诱导系统也能够使hSeAP质粒浓度保持高水平。
实施例13不同的PPAR配体可以激活在活体内的诱导系统，并以依赖剂量的方式激活诱导系统呈现用于治疗II型糖尿病的销售形式的BRL49653(AvandiaTM，SmithKlineBeecham)和用于这种同样治疗的呈销售形式的pioglitazone(ActosTMTakedaPharmaceuticals)也可以激活诱导系统(图26A)。图26B还表明，诱导因子与使用的配体剂量直接相关。
使用PPAR核受体作为转录调节基因的系统因此能够非常精确地控制分泌蛋白的质粒含量。此外，使用不同的PPAR配体时，可以达到这种调节。
实施例14构建能诱导表达其产物是血管生成因子的基因的质粒
14.1.构建Jx10AS-CMV-VEGFA165质粒由人胎盘总RNA通过反转录和PCR克隆人VEGF165阅读区(Clontech)(Houck等人，《Mol.Endocrinol.》12(1991)1806-1814)，然后插入包含-522位至+72位的CMV E/P启动子和SV40的缓步类polyA的pBluescript质粒(Stratagene)，以便得到pXL3218质粒。这个质粒然后用HindIII和BsrGI消化，以便分离482pb HindIII-BsrGI片段A。pXL3218质粒还可用BsrGI和BamHI消化，以便分离390pb BsrGI-BamHI片段B。A和B片段插入预先用HindIII和BamHI消化的Jx10AS-CMV-pGL3质粒中，以便得到Jx10AS-CMV-VFGFA165质粒。这个质粒包含编码VEGFA165的基因互补DNA，通过使用PPAR作为转录调节基因的系统，在诱导启动子控制下表达VEGFA165。Jx10AS-CMV-VEGFA质粒示意图如图27所示。
这个质粒例如能用于以治疗目的随时控制VEGF的血管生成活性。
序列表<110>阿文蒂斯药物股份有限公司<120>使用PPAR核受体及其配体的药理学调节表达系统<130>序列<140><141><160>28<170>在2.1版本中专利<210>1<211>19<212>ADN<213>智人<400>1tcaaccttta ccctggtag 19<210>2<211>27<212>ADN<213>智人<400>2tcgccaagct tctcgtgatc tgcggca 27<210>3<211>37<212>ADN<213>智人<400>3acgtgtcgac actagtggct agaggatctc taccagg 37<210>4<211>48<212>ADN<213>智人<400>4cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagcga gatccttcaa cctttacc 48<210>5<211>13<212>ADN<213>智人<400>5aggtcaaagg tca 13<210>6<211>69<212>ADN<213>智人<400>6acgtgtcgac actagtcaaa actaggtcaa aggtcacgga aaactaggtc aaaggtcacg 60gaaaactag 69<210>7<211>64<212>ADN<213>智人<400>7cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagccg tgacctttga cctagttttc cgtgaccttt 60gacc64<210>8<211>32<212>ADN<213>智人<400>8acgtagatct cggtaggcgt gtacggtggg ag 32<210>9<211>29<212>ADN<213>智人<400>9acgtaagctt ctatggaggt caaaacagc 29<210>10<211>21<212>ADN<213>智人<400>10ggtttgctga atgtgaagcc c 21<210>11<211>42<212>ADN<213>智人<400>11agtctctaga gctacgcgta caagtccttg tagatctcct gc42<210>12<211>32<212>ADN<213>智人<400>12agtcacgcgt gggcgatctt gacaggaaag ac 32<210>13<211>21<212>ADN<213>智人<400>13gcctttgagt gagctgatac c 21<210>14<211>35<212>ADN<213>智人<400>14agtcactagt aagctttttg ccgccagaac acagg35<210>15<211>36<212>ADN<213>智人<400>15agtcactagt ccatggctgc ccagtgcctc acgacc 36<210>16<211>21<212>ADN<213>智人<400>16caggtttgct gaatgtgaag c 21<210>17<211>40<212>ADN<213>智人<400>17tgacgtgtcg acctagtaca agtccttgta gatctcctgc 40<210>18<211>31<212>ADN<213>智人<400>18agtcgtcgac gcttcgagca gacatgataa g31<210>19<211>35<212>ADN<213>智人<400>19agtcgctagc gacggatcct tatcgatttt accac35<210>20<211>50<212>ADN<213>智人<400>20gtcagctagc ctactcgagc caccatgggt gaaactctgg gagattctcc50<210>21<211>42<212>ADN<213>智人<400>21tacggggtac ccagacatga taagatacat tgatgagttt gg42<210>22<211>33<212>ADN<213>智人<400>22gtcagctagc cggtaggcgt gtacggtggg agg 33<210>23<211>33<212>ADN<213>智人<400>23tacgctcgag cttctatgga ggtcaaaaca gcg33<210>24<211>750<212>PRT<213>智人<400>24Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser1 5 10 15Phe Thr AsD Thr Leu Ser Ala Asn Ile Ser Gln Glu Met Thr Met Val20 25 30Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val35 40 45Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro50 55 60Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp65 70 75 80Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp85 90 95Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser100 105 110Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu115 120 125Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp130 135 140Lys Ala Ser G1y Phe His Tyr G1y Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys145 150 155 160Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys165 170 175Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr180 185 190Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile195 200 205Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu210 215 220Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg225 230 235 240Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu245 250 255Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys260 265 270Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp275 280 285Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu290 295 300Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala305 310 315 320Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn325 330 335Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu340 345 350Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu355 360 365Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu370 375 380Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val385 390 395 400Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile405 410 415Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys420 425 430Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln435 440 445Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu450 455 460Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu465 470 475 480Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu485 490 495Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly
500 505 510Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu515 520 525Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln530 535 540Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe545 550 555 560Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile565 570 575Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys580 585 590Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn595 600 605Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu610 615 620Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys625 630 635 640Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp645 650 655Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly660 665 670Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln675 680 685Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu690 695 700Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr705 710 715 720Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met725 730 735Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr740 745750<210>25<211>467<212>PRT<213>智人<400>25Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln1 5 10 15Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe20 25 30Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile35 40 45Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys50 55 60Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn65 70 75 80Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu85 90 95Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys100 105 110Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp115 120 125Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly130 135 140Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln145 150 155 160Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu165 170 175Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr180 185 190Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met195 200 205Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp210 215 220Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr225 230 235 240Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His245 250255Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe260 265 270Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu275 280 285Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln
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权利要求
1.组合物，其中包含(a)第一个成分，它包含处在诱导启动子控制下的目的核酸，该诱导启动子包含对PPAR反应的成分和最小转录启动子，(b)第二个成分，它包含在诱导启动子控制下编码PPAR的核酸，以便它们同时地、分别地或以一定时间间隔使用。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于它还包含(c)PPAR配体以便同时地、分别地或以一定时间间隔使用。
3.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于不同的遗传构建体带有所述成分(a)和(b)。
4.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于所述成分(a)和(b)集合在同一的遗传构建体中。
5.根据权利要求3或4的组合物，其特征在于所述遗传构建体是质粒或病毒载体。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其特征在于对PPAR反应的成分包含一个或多个PPAR链的位点。
7.根据权利要求6的组合物，其特征在于所述对PPAR反应的成分包含SEQID NO1序列或这个序列的功能性变体的一个或多个位点。
8.根据权利要求6的组合物，其特征在于所述对PPAR反应的成分包含SEQID NO5序列或这个序列的功能性变体的一个或多个位点。
9.权利要求6-8中任一项的组合物，其特征在于所述反应成分包含多达30个链位点，优选地3-20个链位点，更优选地5-15个链位点。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其特征在于所述最小启动子是缺失一个或多个具有转录活性的非必需区的细胞基因或病毒基因启动子。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其特征在于所述诱导启动子还包含扩增区。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其特征在于所述最小启动子和对PPAR反应成分的方向相同。
13.权利要求1-11中任一项的组合物，其特征在于最小启动子和对PPAR反应成分的方向相反。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其特征在于编码PPAR的核酸可编码PPARα或PPARγ。
15.权利要求1-14中任一项的组合物，其特征在于编码PPAR的核酸可编码包含多个配体链位点的修饰PPAR。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其特征在于它还包含成分(d)，该成分包含在转录启动子控制下编码RXR的核酸。
17.包含权利要求所述的成分(a)和成分(b)的载体。
18.根据权利要求17的载体，其特征在于所述成分(a)和成分(b)的方向相反。
19.根据权利要求17或18的载体，其特征在于所述成分(a)的诱导启动子和成分(b)的转录启动子集合在载体中，以便生成可调节双向启动子。
20.根据权利要求19的载体，其特征在于在5’->3’方向，它包含编码PPAR的第一个核酸，控制所述第一个核酸表达的第一个最小转录启动子，一种或多种对PPAR反应成分，第二个最小转录启动子，以及在所述第二个最小转录启动子控制下编码目的产品的第二个核酸。
21.根据权利要求17-20中任一项的载体，其特征在于它还包含 16的成分(d)。
22.权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-21中任一项的载体在活体外或试管内的细胞中表达目的核酸的应用。
23.权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-21中任一项的载体在制备用于活体内的细胞中表达目的核酸的产品中的应用。
24.在活体外或或试管内的细胞中调节表达核酸的方法，该方法包括所述细胞与权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-21中任一项的载体进行接触。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于该方法涉及哺乳动物细胞，优选地人细胞。
26.根据权利要求25的方法，其特征在于该方法涉及肌肉细胞。
27.通过与权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-21中任一项的载体接触修饰的细胞。
28.修饰的PPAR，它包含多个配体链位点。
29.编码权利要求28的PPAR的核酸。
30.PPAR配体的鉴定方法，该方法包括使权利要求27的细胞与试验分子接触，再证明目的核酸的表达。
全文摘要
本发明涉及用于药理学调节转基因表达的新方法与组合物。本发明特别涉及组合物,它包含:(a)第一个成分,它包含在诱导启动子控制下的目的核酸,该诱导启动子包含对PPAR反应的成分和最小转录启动子,(b)第二个成分,它包含在诱导启动子控制下编码PPAR的核酸,以便它们同时地、分别地或以一定时间间隔地使用。本发明涉及这些组合物和方法在实验、临床、治疗或诊断方面的应用。
文档编号C12N5/10GK1370240SQ00811928
公开日2002年9月18日 申请日期2000年6月22日 优先权日1999年6月22日
发明者R·达特尔, J·克鲁泽塔, B·斯塔尔斯, A·马赫方蒂 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司