制备高纯去铁胺甲磺酸盐的多步法的制作方法

专利名称：制备高纯去铁胺甲磺酸盐的多步法的制作方法
相关申请根据35 U.S.C.§119，本申请要求1999年12月1日提出的匈牙利专利申请P 99 04454的优先权。
有人指出，去铁胺B可用于处理由于输血性贫血引起的急性铁中毒和慢性铁过载。它能促进重复输血引起中等铁过载的病人的铁排泄，并可以用于处理一些慢性贫血，如地中海贫血症。长期治疗可减慢肝脏铁的积聚和阻止或消除肝脏纤维化的进展。参见Physicians DeskReference 2010(第54版，1999)。去铁胺B不能很好地经口吸收；它必须不经肠道给药。
用于制备去铁胺B的大规模发酵方法是在一种缺铁培养介质中使用链霉菌属pilosus细菌菌株，它能制备各种各样的多异羟肟酸盐化合物，但主要是去铁胺B。参见比利时专利619,532。通常，去铁胺B从发酵液中以盐酸盐的形式分离出来。该盐酸盐不是药学上接受的用于对人体实行肠胃外投药的盐。因此，必须将它转化为一种药学上可接受的盐。甲磺酸盐盐是FDA批准的去铁胺盐。U.S.Pharmacopeia &National Formulary指出，药品级去铁胺B甲磺酸盐含有不超过120ppm的氯化物。参见，USP/NF 24/19，499-500页(1999)。业已证明，这是需要满足的一个富有挑战性的标准，需要有一种改进的方法将由发酵生产的去铁胺B转化成可施药于病人的药学上可接受的纯甲磺酸盐。
比利时专利619,532公开了使用吸附色谱法纯化经发酵获得的去铁胺B的方法。活性碳、活化硅藻土(例如漂白土)或离子交换树脂(Asmit)被推荐为吸附剂。据称供选择的吸附剂包括氧化铝、硅酸镁、硅胶、石膏和离子交换树脂。根据比利时专利619,532，可以使用甲醇-水、吡啶-水或乙酸-甲醇流动相洗脱去铁胺B。
国际公开WO 93/09088和欧洲专利EP 347163描述了硅胶色谱法作为纯化由合成方式，而不是微生物方式生产的去铁胺B的方法。
国际公开WO 93/03045描述了使用聚苯乙烯吸附树脂纯化去铁胺B的铁螯合物配合物和在结构上相关的化合物的方法。
U.S.专利3,153,621和3,118,823公开了使用离子交换树脂分离纯化去铁胺B的方法。人们相信这些专利的教导会产生由链霉菌属pilosus菌株生产的含有其它多异羟肟酸盐的去铁胺B。
比利时专利616,139公开了可以通过使去铁胺盐酸盐水溶液经由Dowex-1、X-16阴离子交换树脂(呈OH-形式)，然后在得到的去铁胺碱水溶液中加入等当量的甲磺酸，之后蒸发除去水，最后通过重结晶从含水酒精或水-甲醇-丙酮混合物中提纯去铁胺甲磺酸盐而从去铁胺B盐酸盐中获得去铁胺B甲磺酸盐。
U.S.专利5,374,771描述了通过离子交换色谱和多次重结晶而纯化粗去铁胺B的方法。所述甲磺酸盐可以通过将纯化的去铁胺B盐酸盐与含有甲磺酸盐反离子的阴离子交换树脂接触而直接进行制备。通过冷冻干燥从水溶液中获得去铁胺B甲磺酸盐。
Bickel H.等人在Helvetica Chimica Acta，1385-1389(1963)中描述了通过多次重结晶从水和酒精混合液中提纯去铁胺B碱。通过阴离子交换、蒸发干燥和多次重结晶制备去铁胺B碱。然后将去铁胺B碱悬浮在水与甲醇混合液中并制备一种无机酸盐。随后蒸发去铁胺B溶液，并从水与甲醇混合液中重结晶残余物。
从去铁胺B水溶液中去除氯离子是上述从发酵液中纯化去铁胺B的每一种方法中的一个步骤。在所有情况下，均使用阴离子交换树脂除去氯离子。但是，单独使用离子交换树脂对于分离不含氯离子的去铁胺B甲磺酸盐并不是有效的，比如为了获得药学上可接受的纯度时所要求的去铁胺B甲磺酸盐。
使用硅胶或氧化铝作为吸附剂的上述提纯方法效率低、费时又费钱。其它常规的代用品--活性炭、硅藻土、硅酸镁、和石膏--对于去铁胺是一种差的吸附剂。为此，在本领域中需要一种快速、有效和廉价的从发酵液中获得不含氯离子、或至少氯阴离子含量不大于120ppm的去铁胺B甲磺酸盐的方法。
此外，上述方法不能有效地除去在结构上与去铁胺B相关的发酵产品，其必须在去铁胺B用于药剂之前被除去。通常，来自于生产去铁胺的发酵液的提取物含有，相对于去铁胺B的含量大约为6-20摩尔％的在结构上与去铁胺B相关的多异羟肟酸盐化合物，这种化合物包括其它去铁胺，如去铁胺A、C、D1、D2、E、F和G。因为去铁胺B和其它的去铁胺具有类似的化学性质，所以还没有已知的净化方法或其结合能将杂质的量降低到约2.5％以下。
除了它们不确定的治疗效果和可能的毒性效果之外，为了准确确定溶液，如灭菌注射液中去铁胺B的浓度而除去这些杂质是很重要的。USP/NF明确说明了去铁胺B注射液中含有90.0-110％的标称浓度。见USP/NF 24/19，500页(1999)。用于确定USP/NF中所述浓度的试验是在485nm处测定铁配合物的光度学吸收率强度。同样，在结构上相关的杂质也能形成在485nm范围内产生吸收的配合物，从而导致会过高估计去铁胺B含量。我们已经发现，根据本领域已知的方法通过发酵获得的去铁胺B甲磺酸盐溶液的光度学的试验会将去铁胺B的浓度过高估计约3％。由此，在本领域中需要一种快速、有效和廉价的方法用来从发酵液获得不含由链霉菌属(例如pilosus或101/87)代谢过程形成的其它多异羟肟酸盐以及氯离子的去铁胺B甲磺酸盐。
因此，我们已经发现，为了有效地除去氯化物和多异羟肟酸盐杂质，将分解产物的形成减到最少，和将它们分离到其形成不可避免的程度上，应该连续地应用吸附树脂色谱法、从水和水溶性的有机溶剂的混合物中沉淀去铁胺B游离碱、形成去铁胺甲磺酸盐和从水和甲磺酸盐反溶剂的混合物或甲醇和甲磺酸盐反溶剂的混合物中将盐结晶出来。
该方法生产的去铁胺B甲磺酸盐含有低于2.5摩尔％的其它多异羟肟酸盐杂质和90ppm以下的氯离子。发明的详细说明本发明提供一种用于从含有微生物方法生产的去铁胺B的原材料中生产高纯去铁胺B甲磺酸盐的纯化方法。该纯化方法可大规模实施，与其它已知的纯化方法相比，经济效益高。
用于生产去铁胺B的微生物方法在本领域中是已知的、如描述于U.S.专利3,158,552中方法，其整体在此引入作为参考。如该552专利所描述，链霉菌属pilosus培养在一种铁含量低的浸没介质中以促进去铁胺的生产，微生物使用去铁胺从环境中提取铁。在发酵结束时，通过加入有竞争力的铁螯合剂，8-羟基喹啉而解脱去铁胺B与培养介质中的Fe3+络合。然后，将发酵液过滤以除去细胞团块，得到含有去铁胺B的水溶液。在另外加工之后，呈现与其它去铁胺混合物形式的去铁胺B盐酸盐从水溶液中沉淀出来。
本发明的方法可以应用于从发酵液中获得的在进行加工，如552专利描写的浓缩或萃取或如U.S.专利5,374,771描写的加工后得到的原材料。同样，含有去铁胺B的蒸发的发酵液提取物可以以含水或者有机溶剂的形式进行处理并用作获得去铁胺B的原材料。优选，去铁胺B的原材料是去铁胺B浓度为约5-约70g/L-1，更优选约10-约30g/L-1的水溶液。纯化方法还被描述为它适用于这样一种去铁胺B水溶液(下文称粗去铁胺B溶液)。
本发明的纯化方法包括三个阶段。第一，与去铁胺B在化学上不相关的杂质和极性显著不同的相关物质通过吸附树脂色谱法除去。第二，通过将去铁胺B以游离碱形式沉淀出来而将去铁胺B与氨阴离子及其他多异羟肟酸盐分离开来。第三阶段，呈游离碱形式的去铁胺B被悬浮在一种混合溶剂中，用甲磺酸处理以溶解游离碱并使其以甲磺酸盐的形式结晶出来。杂质的色谱分离在本发明的第一阶段，通过将去铁胺B原材料与吸附树脂床接触并收集作为所述床流出的洗脱液形式的去铁胺B溶液而分离与去铁胺B化学上不相似的化合物和极性显著不同的相关物质。优选的吸附树脂是未被取代的和取代的芳香族型树脂、具有疏水基的芳香族树脂、丙烯酸和甲基丙烯酸树脂。尤其优选的吸附树脂包括FP、HP、SP和HPMG系列的Diaion树脂(Mitsubishi Chemical Corp.)和XAD系列的Amberlite(Rohm & Haas)、最优选的是DiaionSP 207和AmberliteXAD 1180。用水和水溶性有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈和四氢呋喃的混合物可以从树脂上将去铁胺B洗脱出来。
优选的色谱分离程序使用一个预分离柱和一个含有吸附树脂分离床的主分离柱。根据该优选的程序，粗去铁胺B溶液首先通过含有少量吸附树脂，即粗去铁胺B溶液体积的约2-6％的预分离柱洗脱。预分离柱可以安装在主柱的顶上，并且可使粗去铁胺B溶液在不用溶剂洗脱的情况下通过预分离柱，因为只有少量的去铁胺B吸附在预分离柱上。选择性地，预分离柱可以用溶剂进行洗脱。洗脱液可以是如上所述的水和水溶性有机溶剂的混合物，但是为了将去铁胺B保留在主柱上，优选洗脱溶剂是如下所述的盐水，如果使用的话。预分离柱可能会使本方法最终去铁胺B甲磺酸盐的产率略微降低，但是使用它的优点在于最终纯度较高，主柱吸附树脂更容易再生，后者在经济上具有一定的优势。
在任选将粗去铁胺B溶液通过预分离柱之后，所述溶液优选用无机盐处理以增强去铁胺B在主柱上的吸附。氯化物和硫酸盐是优选的无机盐，最优选的是氯化铵和硫酸铵。无机盐应该以2-15g/L-1的溶液加入，更优选为约5-10g/L-1。然后将粗去铁胺B溶液装载到含有吸收树脂床的主柱上，吸收树脂的体积为粗去铁胺B溶液量的约二十分之一到与粗去铁胺B溶液的体积几乎相同。优选，吸收树脂床的体积为粗去铁胺B溶液量的约1/4到3/4。更高浓度的粗去铁胺B通常比处理更稀溶液所需的树脂更少。去铁胺B吸附到树脂上，脱去去铁胺B的水溶液或者从床层渐渐排出，或者用无机盐溶液将其从床中赶出。然后用水和水溶性有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃，最优选乙腈洗脱吸附树脂以回收部分纯化的去铁胺B。通常，混合物中有机溶剂部分应该为约1％-约70％(v/v)，优选为1％-约50％(v/v)，这取决于所述树脂。特别是，对于从AmberliteXAD 1180树脂上洗脱去铁胺B来说，88∶12∶3的水∶乙腈∶甲醇混合物是很好的溶剂混合物。
也可以有利地使用梯度洗脱来从任何适合的树脂上洗脱去铁胺B。这种通常可适用的梯度方法之一包括首先用盐水洗脱，然后用含有有机洗脱溶剂的水洗脱。首先用水洗脱，然后用水-乙腈或水-甲醇混合液洗脱，任选随后用水-乙醇或者水-丙酮洗脱可以得到优良的结果。用于从AmberliteXAD 1180树脂上洗脱去铁胺B的一个特别优选的梯度法是首先用盐水洗脱，然后用90∶10的水-乙腈混合物洗脱，然后逐渐增加乙腈用量直到使用80∶20的水-乙腈混合物。
不论是否使用梯度或非梯度洗脱，去铁胺B将被从溶于含有一种或多种洗脱液物流馏份的含水有机洗脱液的主柱上收集。含有去铁胺B的洗脱液可以任选地被脱色，如通过用活性碳或类似于AmberliteIRC50、DuoliteC467 and LewatitCNP 80的阳离子交换树脂根据所述领域已知的方法进行处理。如果去铁胺B在三种或更多馏份-一种早期洗脱馏份、一种或多种中间洗脱馏份、和一种晚期洗脱馏份-中收集，那么含有去铁胺B的中间馏分通常将是无色的。只有早期洗脱和晚期洗脱的馏份可能有颜色。因此，是否需要脱色处理将取决于怎样截取馏份。如果早期洗脱和晚期洗脱的馏份均被收集并且与中间馏分合并，则使用活性碳和阳离子交换树脂进行脱色是所希望的，因为早期洗脱和晚期洗脱的馏份对于不同的脱色方法响应不同。去铁胺B游离碱的沉淀在本发明方法的第二阶段，去铁胺B游离碱从来自于吸附树脂的洗脱液中沉淀析出。尽管洗脱液中去铁胺B的浓度可能根据用于从树脂上洗脱去铁胺B的溶剂混合物而发生很大的变化，但是为了形成适当的浓度和用于沉淀所述碱的溶剂组合物不必将洗脱液蒸发到干燥。实际上，将洗脱液蒸发到干燥是不利的，因为去铁胺B的异羟肟酸基对于高溶液浓度和所施用的热是不稳定的。更合适地，通过下面的程序可以制备用于高产率和高纯度沉淀游离碱的洗脱液。
如果洗脱液中去铁胺B的浓度低于约50g/L-1，应该在温和条件下将洗脱液蒸发到去铁胺B浓度为约50g/L-1约150g/L-1，优选约80g/L-1-约100g/L-1，最优选约90g/L-1。上面所列出的优选的有机洗脱溶剂是沸点低于水沸点的溶剂，有时候是带有少量水的共沸物，因此溶剂混合物中水的比例会随浓度而增加。然后浓缩的洗脱液用乙腈稀释，其用量是浓缩的洗脱液体积的约0.5-约1.5倍。我们发现，在该阶段加入乙腈会防止去铁胺B盐酸盐(或硫酸盐、视情况而定依赖于所使用的无机盐)的沉淀。
然后，将浓度已得到调节的含有去铁胺B的处于水和乙腈(和任选其它有机洗脱溶剂)中的洗脱液的pH调节到约8.6-10.5，更优选约9.4-10.0。可以使用碱性离子交换树脂或通过加入碱性水溶液或两者都使用来调节pH。适合的碱性离子交换树脂包括IRA系列的Amberlite树脂，WK系列的Diaion树脂，最优选OH形式的AmberliteIRA 67。适合的碱性溶液是NaOH，KOH、氨水或胺溶液，最优选浓缩氨水。
在一个特别优选的pH调节技术中，首先测试浓度已经调节的洗脱液的pH。如果pH低于8.0，用碱性离子交换树脂，如OH形式的AmberliteIRA 67将pH调节到约8.0-9.3。然后分离树脂，加入氨水直到浓度已得调节的洗脱液的pH为约9.4-10.0。
在调节pH之后，通过加入去铁胺B游离碱反溶剂，如乙腈、乙醇、甲醇或丙酮进行去铁胺B游离碱的结晶。优选的去铁胺B游离碱反溶剂是乙腈和乙腈-丙酮混合物。这里使用的术语″反溶剂″意思是在其中化合物溶解性差的液体。因此，术语反溶剂涉及到特定化合物在那些液体中的溶解度。本发明使用两种类型的反溶剂去铁胺B游离碱反溶剂和去铁胺B甲磺酸盐反溶剂。
在已调节pH的洗脱液中加入去铁胺B游离碱反溶剂的速率不是关键的，但是加入速率越慢，越倾向于生产大和纯的晶体去铁胺B游离碱。在工业生产规模上，加入的实际速率大约为已调节pH的洗脱液体积数的0.5-2倍每小时，虽然加入速率减慢，得到的结晶粒度增加、纯度提高。去铁胺B游离碱反溶剂的加入总量优选为已调节pH的洗脱液体积的约1.5-10倍，更优选为约2-8倍，最优选为约2.5-5倍。无论在任何地方，在结晶期间，溶液温度可以保持在约-20℃到约40℃，虽然优选将温度保持在约0℃-20℃。
在结晶完成之后，可以通过任何传统方法，如过滤或滗析分离去铁胺B游离碱晶体。任选地，还可以通过重结晶纯化游离碱晶体。乙腈-水混合物也是用于重结晶的良好溶剂体系。去铁胺B甲磺酸盐的结晶在本发明方法的第三阶段中，将结晶的游离碱悬浮在一种混合溶剂中。然后将甲磺酸加入到悬浮液中，使得去铁胺B游离碱溶解。在去铁胺B游离碱溶解完成之后，继续加入甲磺酸直到溶液的pH达到约3-约6，更优选约3.5-4.5。然后使得去铁胺B甲磺酸盐沉淀。
用于悬浮去铁胺B游离碱的适合的混合溶剂是去铁胺B甲磺酸盐溶剂、或者水或者甲醇和去铁胺B甲磺酸盐反溶剂的混合物。去铁胺B甲磺酸盐反溶剂包括C1-C7脂族醇、丙酮、甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、甲苯、四氢呋喃和乙腈。混合溶剂的极性溶剂组分，即甲醇或水，优选以约1∶1-约1∶10的比例与反溶剂组分混合，更优选比例为约1∶5。优选的混合溶剂是水-乙醇混合物、水-乙腈混合物、甲醇-乙醇混合物和甲醇-乙腈混合物，最优选的是1∶5的水-乙醇混合物和1∶3的甲醇-乙醇混合物。用于悬浮游离碱的混合溶剂的体积应该为约5-约20L每千克去铁胺B游离碱，更优选约7-约15L每千克去铁胺B游离碱。
在形成悬浮液之后，将甲磺酸加入到悬浮液中。需要的甲磺酸的量可以通过计算为碱提供一当量酸所需的量而进行估计。选择性地，提供一当量所必需的甲磺酸的量可以通过观察加入酸过程中残留悬浮的不溶游离碱的量而准确计量。为此，应该慢慢加入甲磺酸，因为悬浮碱可以与酸反应的速率是由晶体表面面积限制的速率。在所有的去铁胺B游离碱溶解之后，应该监测溶液的pH，同时加入另外的甲磺酸使得溶液的pH为约3-约6，优选约3.5-4.5。在达到希望的pH之后，使去铁胺B甲磺酸盐晶体沉淀。
为加速沉淀，可以将溶液冷却到约-20-约10℃。另外，可以通过将更多的去铁胺B甲磺酸盐反溶剂加入到混合物中加速沉淀，即通过加入C1-C7脂族醇、丙酮、甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯，己烷，甲苯、四氢呋喃或乙腈。沉淀完成后，通过传统方法，如过滤或滗析分离去铁胺B甲磺酸盐。
上面已参考其优选实施方案描述了本发明的方法，现在将通过下面的实施例更进一步举例说明所述发明。
将脱色后的洗脱液蒸发使得去铁胺B的浓度为90gL-1。然后加入与浓缩洗脱液相等体积的乙腈，通过加入OH-形式的AmberliteIRA 67(Rohm and Haas)将碱度调节到pH为8.0-9.3。在用阴离子交换树脂调节pH之后，用氨水将其pH调节到9.4-10.0。然后在溶液中加入两倍量的乙腈并将其冷却到-5℃使去铁胺游离碱沉淀。几小时后结晶完成。通过过滤分离去铁胺游离碱晶体，然后将其悬浮在1∶1的乙腈-水中，再次过滤，用乙腈洗涤，干燥得到3.81千克去铁胺游离碱。HPLC色谱表明，游离碱的纯度为97％。遵循USP测定氯化物含量的化学试验<221>，发现沉淀的去铁胺B游离碱的氯化物含量低于60ppm。参见USP/NF 24/19，1857-1858页(1999)。
将去铁胺游离碱悬浮在14∶3的乙醇-水混合物中(42.5L)。慢慢地把稀甲磺酸加入到悬浮液中直到游离碱溶解，溶液的pH达到3.7-5。把乙醇(200L)加入到溶液中以沉淀甲磺酸盐，将所得悬浮液冷却-10℃，并在-10℃维持几小时。通过过滤分离所得晶体，用乙醇(50L)洗涤，在真空下干燥，得到3.4千克去铁胺甲磺酸盐。HPLC色谱表明甲磺酸盐含有1.84重量％的杂质。Karl-Fischer分析测定水分含量为0.2mol％。参见USP/NF 24/19，2003-2004页(1999)。根据欧洲药典颜色等级标准测定，其颜色比Y5好。
然后加入等量的乙腈。之后加入浓缩的氨水直到溶液的pH达到9.8。加入4倍的乙腈以将去铁胺B游离碱沉淀出来。所得悬浮液冷却到-4℃，并在降低的温度下维持24小时，随后通过过滤分离晶体。通过重复悬浮于1∶1的水-乙腈中三次而洗涤分离后的晶体，并将其过滤。然后在40℃，环境压力下干燥晶体得到去铁胺B游离碱(341克)，用HPLC测定其纯度为95.2％(w/w)，氯化物含量低于60ppm。
然后将去铁胺B碱悬浮在乙醇(3.1L)和水(0.46L)混合物中。慢慢地加入甲磺酸直到去铁胺B碱溶解和溶液的pH达到3.5。在溶液中加入另外30L乙醇以沉淀去铁胺B甲磺酸盐。所得悬浮液冷却到-5℃-0℃之间，并在降低的温度下保持24h。通过过滤分离晶体，用乙醇洗涤，在真空下干燥得到去铁胺B甲磺酸盐(299克)，HPLC分析其纯度为98％(w/w)。实施例3含有530g去铁胺B的粗去铁胺B盐酸盐(760克)在40℃下溶于1∶1的乙腈-水(14L)中。然后过滤所得溶液，通过加入浓氨水将pH调节到9.9。加入乙腈(49L)以沉淀去铁胺B游离碱。将所得悬浮液冷却到17℃并在降低的温度下维持4小时。过滤分离沉淀，用乙腈洗涤，并在减压下干燥，得到去铁胺B游离碱(403克)。然后将碱悬浮在水(20L)中，慢慢地加入盐酸直到碱溶解和所得溶液的pH达到5.0-5.5。
将溶液装载到装于色谱柱中的AmberliteXAD 1180吸附树脂(7.2L)床上，并用25％乙腈-水洗脱。得到单个级份去铁胺B(320克)。用活性炭(10克)将含有去铁胺B的洗脱液脱色。过滤后，将含有305克去铁胺B的脱色后的洗脱液浓缩到约110gL-1。然后将等量的乙腈加入到溶液中。之后通过加入OH-形式的AmberliteIRA 67阴离子交换树脂而将溶液的pH调节到8.6-9.0。在溶液中加入氨水以沉淀去铁胺B游离碱。继续加入直到悬浮液的pH达到9.8。之后将悬浮液冷却到-4℃并且在降低的温度下维持几小时。然后通过过滤分离晶体并且将其悬浮在1∶1的乙腈-水混合物中，再次过滤并在减压下干燥。之后，在按实施例1最后一段所描述的方法制备甲磺酸盐之前，将干燥的去铁胺B游离碱粉碎。HPLC分析粉末游离碱的纯度为97.8％(w/w)。使用该物质得到的甲磺酸盐含有0.96％的杂质(w/w)(用HPLC分析)，其氯化物含量低于60ppm。
遵循实施例1的程序，但是用丙醇，丁醇，戊醇，己醇和庚醇替代乙醇进行去铁胺B甲磺酸盐的沉淀，得到甲磺酸盐的产率为83.1-89.1％。
以甲酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯、己烷和THF替代实施例1程序中的乙醇，得到去铁胺B甲磺酸盐的产率为88.1-93.1％。
在实施例1所述程序的每一个这些的变化中，用HPLC测定的杂质含量均低于2.5％(w/w)。
上面已经参考优选实施方案对本发明进行了描述并且用具体的实施例更进一步举例说明了本发明，在阅读这些公开的基础上，本领域技术人员应该理解可以在不背离本发明精神和范围的基础上进行改进。因此，应该理解上面的描述和实施例仅仅为了列举目的，不应该认为是对随后权利要求所列出的本发明范围的限制。
权利要求
1.从含有由微生物方法生产的去铁胺B的原材料中分离去铁胺B甲磺酸盐的方法，包括如下步骤a)通过将原材料与吸附树脂接触而将去铁胺B吸附到吸附树脂上，b)通过用水与水溶性有机洗脱溶剂的混合物洗脱已经将去铁胺B吸附其上的吸附树脂而得到含有去铁胺B的洗脱液，c)用碱性离子交换树脂或碱性溶液或两者都用将洗脱液的pH调节到约8.6-10.5，d)通过加入去铁胺B游离碱反溶剂，任选在将洗脱液部分浓缩到去铁胺B浓度不超过150gL-1之后，从已调节了pH的洗脱液中结晶去铁胺B游离碱，e)将去铁胺B游离碱悬浮到包括去铁胺B甲磺酸盐反溶剂和选自水与甲醇的去铁胺B甲磺酸盐溶剂的混合溶剂中，f)通过将悬浮液与甲磺酸接触将去铁胺B游离碱溶解于混合溶剂中，和g)沉淀去铁胺B甲磺酸盐。
2.权利要求1的方法，还包括将原材料通过吸附树脂预分离柱床的预备步骤。
3.权利要求1的方法，还包括在原材料中加入无机盐的预备步骤。
4.权利要求3的方法，其中无机盐为氯化铵或硫酸铵。
5.权利要求1的方法，其中吸附树脂用水和一种选自甲醇、乙醇、乙腈和四氢呋喃的水溶性有机溶剂的混合物洗脱。
6.权利要求5的方法，其中水溶性的有机溶剂为乙腈。
7.权利要求1的方法，还包括在调节洗脱液pH前对洗脱液脱色的中间步骤。
8.权利要求1的方法，还包括在调节洗脱液pH前调节洗脱液去铁胺B浓度的步骤。
9.权利要求8的方法，其中通过蒸发将洗脱液中去铁胺B浓度调节到约50gL-1-约150gL-1。
10.权利要求9的方法，其中将去铁胺B浓度调节到约80gL-1-约100gL-1。
11.权利要求10的方法，其中将去铁胺B的浓度调节到约90gL-1。
12.权利要求8的方法，还包括在浓度调节之后，pH调节之前在洗脱液中加入乙腈。
13.权利要求1的方法，其中将洗脱液的pH调节到约9.4-约10。
14.权利要求1的方法，其中通过加入碱性溶液调节洗脱液的pH。
15.权利要求14的方法，其中碱性溶液为NaOH、KOH、氨水或胺的溶液。
16.权利要求15的方法，其中碱性溶液为氨水。
17.权利要求1的方法，其中使用碱性离子交换树脂调节洗脱液的pH。
18.权利要求13的方法，其中将洗脱液的pH调节到约9.4-约10通过在洗脱液中加入碱性离子交换树脂直到pH达到约8.0-约9.3，分离碱性离子交换树脂并且加入氨水直到pH达到9.4-10。
19.权利要求1的方法，其中去铁胺B游离碱悬浮于其中的混合溶剂包括水和去铁胺B甲磺酸盐反溶剂，后者选自C1-C7脂族醇、丙酮、甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、甲苯、四氢呋喃和乙腈。
20.权利要求19的方法，其中去铁胺B甲磺酸盐反溶剂选自乙醇、丙酮和乙腈。
21.权利要求1的方法，其中去铁胺B游离碱悬浮于其中的混合溶剂包括甲醇和去铁胺B甲磺酸盐反溶剂，后者选自C1-C7脂族醇、丙酮、甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、甲苯、四氢呋喃和乙腈。
22.权利要求21的方法，其中去铁胺B甲磺酸盐反溶剂选自乙醇、丙酮和乙腈。
23.权利要求1的方法，其中通过冷却加速去铁胺B甲磺酸盐的沉淀。
24.权利要求1的方法，其中通过加入选自C1-C7脂族醇、丙酮、甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、甲苯、四氢呋喃和乙腈的去铁胺B甲磺酸盐反溶剂加速去铁胺B甲磺酸盐的沉淀。
25.权利要求1的方法，其中沉淀的去铁胺B甲磺酸盐的氯离子含量为约90ppm或更小。
26.权利要求1的方法，其中沉淀的去铁胺B甲磺酸盐含有低于去铁胺B摩尔数的约2.5摩尔％的其它多异羟肟酸盐。
全文摘要
本发明提供一种纯化方法，其中通过微生物生产并处于与其它通过微生物生产的多异羟肟酸盐的混合物中的去铁胺B可以转化为基本上不合其它多异羟肟酸盐和基本上不含氯离子的其甲磺酸盐。所述方法包括去铁胺B在吸附树脂上的吸附及解吸附过程，去铁胺游离碱从来自于吸附树脂的洗脱液中的直接沉淀，将去铁胺B游离碱与甲磺酸接触以及通过沉淀分离去铁胺B甲磺酸盐。该方法将去铁胺B的分解降到最小。
文档编号C12P13/00GK1433399SQ00818750
公开日2003年7月30日 申请日期2000年11月30日 优先权日1999年12月1日
发明者V·克里, Z·措维克, A·梅佐 申请人:拜奥盖尔药厂有限公司