专利名称：胚胎干细胞体外定向分化药效筛选模型的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属细胞生物学、分子生物学和药理学领域，涉及一种药效筛选模型的构建及应用，尤其是关于药物诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)体外定向分化药效筛选模型的构建及应用，可高效率地对新化合物、天然药物活性进行快速初步筛选与评价。
研究ES细胞体外定向分化为单一类型细胞(心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)起始于90年代，主要用于(1)发育学研究；(2)组织工程学研究。ES细胞具有体外不分化的无限增殖能力，当处于合适的培养条件下，可定向分化形成多种单一类型的细胞。国外约在几年前起步对ES细胞体外定向分化研究，已有在合适的营养环境培养条件下，ES细胞可定向分化成心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等的报道(用于发育学、组织工程学研究)，但所获结果ES细胞的分化成功率远低于药物诱导的分化成功率(参见附
图1)。迄今未见ES细胞体外定向分化用于药效筛选用途。
本发明的目的是利用ES细胞在特定条件下，可分化为单一类型细胞的特性，在药物诱导下，使ES细胞在体外定向分化为特定单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。本发明主要分以下几个步骤1.利用已有的ES细胞支持培养；2.药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；3.利用该模型进行药效初步筛选与评价。
本发明利用已有的ES细胞的支持培养，主要是选用已有的小鼠胚胎干细胞D3细胞株(ES-D3细胞株)，在培养基中接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。
本发明进行的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，这类细胞包含心肌细胞，是用培养基将ES-D3细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养形成拟胚体，拟胚体再进行贴壁培养；加入供试药物共培养，当拟胚体细胞团出现特定指征时，则以此作为定向分化成功的指标。对诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，则以拟胚体细胞团出现有节律性地搏动为定向分化成心肌细胞成功的指标。根据药物诱导拟胚体细胞团出现特定指征，及该药物诱导分化的时效关系和量效关系进行统计学分析，以此作为药效评价指标。供试药物可以是丹参、黄芪、淫羊藿苷、葛根素、银杏黄酮等中药活性物质，或其它化学类药物。
本发明所用的培养基是含DMEM培养基、胎牛血清。
用本发明方法可构建用于心肌细胞定向分化模型、神经元定向分化模型、血管发生定向分化模型等多种单一类型细胞模型，用于相关药物的药效初步筛选与评价。
利用本发明方法诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，还可进行心肌发育依赖性特殊基因表达的研究、心肌结构蛋白表达研究和离子通道形成研究。
本发明具有以下优点1.应用面非常广ES细胞具有体外不分化的无限增殖能力，构建药物诱导ES细胞体外定向分化形成单一类型细胞(如心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)的药效筛选模型，可初步评价以心脏、神经、血管等为作用靶点的多种创新药物的药效。药物在诱导过程中，可能通过干预多个环节使ES细胞定向分化为某种单一类型细胞，因此在该模型的应用中，只要药物具有干预其中某个或几个关键环节的作用，就可初步评价药物的药效。
2.生物信息量大、特异性强ES细胞体外定向分化体系由于能够基本模拟乃至重现体内复杂的发育及组织器官生成过程，具备能人工控制、干预的特点；并且可特殊地通过ES细胞在定向分化过程中，细胞信号转导、基因状况、转录调控等方面高度模拟药物在整体动物的作用，重现药物对生物大分子调控的生命现象本质，为新药研制提供了简单有效的体外药效评价模型。
3.对有诱导ES细胞定向分化为某种单一类型细胞的创新药物，该筛选模型由于可呈现分化的全过程，尚可提供药物作用特异性靶点研究，并存在发现一些有治疗功能基因的可能。
4.观察与评价指标直观、明了，能直观地反映药物的时效关系和量效关系，用于客观评价药效。如ES细胞与具有治疗心脏疾病药效的创新药物共培养后，以ES细胞形成的拟胚体是否具有自发的节律性搏动为评价终点，如获得的时效关系及量效关系资料与对照组有显著性差异，即可明确其对ES细胞定向分化有诱导作用。
5.该药效筛选模型仍保持常规的细胞层面筛选药物活性的一般特点，如所需供试品用量少、节时省钱、效率高等，但由于在定向分化过程中富含发育依赖性生物信息，能提供更多的靶点供药效评价用，因此是一个高效率、高仿真兼顾，药效与机制研究并存的药效筛选模型，在创新药物研制、中药活性物质药效评价领域应用前景十分广阔。
实施例一中药单体淫羊藿苷诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的研究1.ES细胞的支持培养ES-D3细胞在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2×107-5×107个/ml的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法进行传代培养。
2.药物诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的培养①ES-D3细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，按20-30μL接种于培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10ml D-Hanks液，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中悬滴培养2天。此后将悬滴转入盛有10mlES细胞分化培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)的培养皿中，进行ES细胞集落悬浮培养3天，形成ES细胞拟胚体。
②附着ES细胞的分化培养在显微镜下用吸管将拟胚体转移到24孔板内，孵育4-5小时，使其吸附后，每孔中缓慢加入1ml ES分化培养基，加入中药单体淫羊藿苷与ES细胞拟胚体共孵育。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞开始跳动的最初时间。
3.用该模型进行药效评价若拟胚体细胞团能有节律性地搏动，则以此作为定向分化成心肌细胞的指标，作出药物淫羊藿苷对ES-D3细胞诱导分化的时效关系曲线和量效关系曲线，结果见附图1，以此作为药效评价的指标。附图1中，淫羊藿苷终浓度分别为0，10-8，10-7mol·L-1.*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001 vs 0mol·L-1，每个浓度n＝400拟胚体，相同实验重复做了6次。
本课题组已分别对6种心脏疾病疗效明确的药物(如丹参、黄芪、淫羊藿苷、葛根素、银杏黄酮等)进行诱导分化试验。结果其中有3种药物分别在与ES-D3细胞共培养5-7天时，就有90％以上的细胞克隆出现节律性搏动，并有心脏胚芽纤维蛋白表达上调。另有2种药物与ES-D3细胞共培养9-11天时，均有80％以上的细胞克隆出现节律性搏动，同时可见心肌发育依赖性基因上调。其中以中药单体淫羊藿苷的诱导作用最明显，且具有很好的量效关系。
实施例二心肌发育依赖性特殊基因表达的研究若药物能诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，则分别在药物共培养前，药物共培养后拟胚体形成时，拟胚体搏动时，进行如下研究(1)DNA文库克隆→培养后提取噬菌体DNA作模板PCR反应扩增→扩增产物测序；(2)半定量逆转录聚合酶链反应鉴定→对一些基因进行功能推测研究；(3)对差异表达基因进行RT-PCR半定量鉴定→对某些基因进行功能推测研究。
实施例三心肌结构蛋白表达研究(1)电镜显示心肌结构蛋白特征性图谱，并以出现与否及其成熟程度来显示药物作用。
(2)蛋白电泳，western blot，评价是否有表达差异，及表达后修饰等。必要时进行搏动拟胚体电信号采集与分析。
用本发明的药效筛选模型能高效快速地初步评价具有改善心肌功能、抗心律失常、改善心肌供血、抗老年性痴呆、抗帕金森病、抗肿瘤及肿瘤转移，治疗心脑血管疾病、治疗糖尿病、抗肝病等药效的创新药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
本发明所参考的文献有1、都同功，陈系古，刘兰英，等.小鼠胚胎干细胞的培养.中国实验动物学报，1999，7(1)1-4.
2、娟娟，杜冠华.药物筛选模型研究进展.基础医学与临床，2001，21(4)302-304.
3、郭晓霞，贺福初.胚胎干细胞的研究与利用.科学通报，2000，45(5)467-474.
4、杜忠伟，丛笑倩.胚胎干细胞体外分化的研究进展.细胞生物学杂志，1998，20(3)102-106.
5、薛庆善主编.《体外培养的原理与技术》.科学出版社.
6、Robbins J，Doctschman T，Jones WK，et al.Embryonic stem cell asa model for cardiogenesis.Trends Cardiovasc Med，1992，244-50.
7、Joseph MM，Linda CS，Elizabeth MR，et al.Embryonic stem cellcardiogenesis application for cardiovascular research.TCM，1997，7(2)63-68.
权利要求
1.一种胚胎干细胞体外定向分化药效筛选模型的构建及应用，其特征是在药物诱导下，使胚胎干细胞(ES细胞)定向分化为特定单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行创新药物药效初步筛选与评价，本发明主要分以下几个步骤(1)利用已有的ES细胞的支持培养；(2)药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；(3)利用该模型进行药效初步筛选与评价。
2.如权利要求1所述的利用已有的ES细胞的支持培养，其特征是选用小鼠胚胎干细胞D3细胞株(ES-D3细胞株)，接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。
3.如权利要求1所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是当诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，用培养基将ES-D3细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养形成拟胚体，拟胚体进行贴壁培养，加入供试药物共培养，以拟胚体细胞团出现特定指征，作为定向分化成功的指标。
4.如权利要求3所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是当诱导定向分化为心肌细胞时，拟胚体细胞团出现的特定指征是有节律性地搏动。
5.如权利要求3所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是本发明所用的培养基是含DMEM培养基、胎牛血清。
6.如权利要求3所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是供试药物可以是丹参、黄芪、淫羊藿苷、葛根素、银杏黄酮等中药活性物质，也可以是化学类药物。
7.如权利要求1所述的利用该模型进行药效评价，其特征是当诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，根据药物诱导拟胚体细胞团出现有节律性地搏动，该诱导分化的时效关系曲线和量效关系曲线差异应具有统计学意义，作为药效评价指标。
8.如权利要求1所述的模型的应用，其特征是利用本发明方法构建的模型，诱导定向分化为心肌细胞，可进行心肌发育依赖性特殊基因表达的研究、心肌结构蛋白表达研究和离子通道形成研究。
9.如权利要求1所述的胚胎干细胞体外定向分化药效筛选模型的构建及应用，其特征是利用该方法，可构建心肌细胞定向分化模型、神经元定向分化模型、血管发生定向分化模型以及其它多种单一类型细胞模型，用于药效初步筛选与评价。
全文摘要
一种胚胎干细胞体外定向分化药效筛选模型的构建及应用，是在药物诱导下，使胚胎干细胞定向分化为特定单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。本模型应用只要药物具有干预定向分化的某个或若干个作用环节，就可初步评价药物的药效。该模型是一种高效率药效筛选模型，评价指标直观、明了。可对许多创新化合物、天然药物的药理作用进行快速初步评价，为新药研制提供了简单有效的体外药效评价模型，且该药效筛选模型所需供试品用量少、节时省钱，富含发育依赖性生物信息，是一个高效率与高仿真兼顾，药效与机制研究并存的药效筛选模型。
文档编号C12Q1/18GK1403586SQ0213729
公开日2003年3月19日 申请日期2002年9月27日 优先权日2002年9月27日
发明者楼宜嘉, 朱丹雁, 王志强 申请人:浙江大学