专利名称：前列腺素e合酶2基因的破环的制作方法
技术领域：
本发明涉及含被破坏的前列腺素E合酶2基因的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞，以及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。
背景技术：
前列腺素E2(PGE2)是通过PGH2降解或通过前列腺素E合酶(PEGS)催化反应衍生于前列腺素H2(PGH2)的一种重要的前列腺素类激素(Jakobsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 967220-25，1999)。由环加氧酶(COX)-1或COX-2催化反应形成的PGH2用作所有前列腺素类激素产物形成的前体，所述产物包括前列腺素、前列腺环素和血栓烷(Smith和Marnett，Biochim.Biophys.Acta 10831-17，1991；Vane和Botting，Inflamm.Res.441-10，1995；Herschman，Biochim.Biophys.Acta 1299125-40，1996)。
对PGE2的特异性单克隆抗体的研究显示PGE2是参于炎症的重要前列腺素类激素(Portanova等，J.Exp.Med.184883-91，1996)。注射PGE2通过血管扩张及血浆外渗和伤害感受器致敏而引起炎症(Vane和Botting，Inflamm.Res.47(Suppl.2)S78，1997)。而且，PGE2刺激基质金属蛋白酶的产生(Mehindate et al.，J.Immunol.1553570，1995)，刺激血管生成(Ben-Av等，FEBS Lett.37283，1995)和抑制T淋巴细胞调亡(Goetzl等，J.Immunol.1541041，1995)。
一种形式的PGES(PGES1或cPGES)在多种哺乳动物细胞系中组成型表达并且细菌脂多糖(LPS)刺激后通常不变(Tanio双敲除等，J.Biol.Chem.4232775，2000)。可诱导形式的PGES(PGES2，iPGES，或mPGES-1)位于微粒体区室。需要注意的是mPGES-1已经成为PGES2的选择命名。PGES2酶已经鉴定为参与类花生酸和谷胱苷肽代谢的膜结合蛋白成员，且受白介素(IL)-1β诱导(Jakobsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 967220，1999；Thoren和Ja双敲除bsen，Eur.J.Biochem.2676428，2000)。该酶最初被称为微粒体谷胱苷肽S转移酶1样1(Jakobsen et al.，Protein Sci.8689，1999)。
各种研究已经表明COX-2和PGES 2以协调形式调节，并且提示PEGS2是涉及炎症、发热效应和细胞生长调节相关的COX-2介导反应中PGE2形成的关键酶(Yamagata等，J.Neuroscience 212669-77，2001；Murakami等，J.Biol.Chem.27532783-92，2000)。因此，提示抑制PGES2的药剂可提供作为可替换的或另外的COX-2抑制剂的治疗(Stichtenoth等，J.Immunol.167469-74，2001)。然而，PGES2抑制的完全作用仍待解析。因此需要另外的研究工具，包括PGES2敲除小鼠和PGES2敲除的ES细胞，以进一步确定PGES2在炎症反应中的作用和调节PGES2活性相关的治疗意义。
发明概述本发明涉及PGES2基因被破坏的纯合或杂合的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞。
在第一个方面，本发明涉及遗传修饰的非人哺乳动物，其中该修饰导致PGES2基因被破坏。优选，哺乳动物是啮齿动物，更优选小鼠和/或该哺乳动物表现对实验诱导炎症模型的反应减弱，如减轻关节炎症，降低白细胞浸润，减少关节接合表面蛋白聚糖损失，和/或减轻炎症疼痛检测。在另一个优选实施方案中，该哺乳动物进一步包括被破坏的ApoE基因。
本发明的第二个方面涉及遗传修饰的动物细胞，其中该修饰包括被破坏的PGES2基因。在优选实施方案中，该细胞是胚胎干细胞(ES)，ES样细胞或ES细胞衍生的巨噬细胞，该细胞在补充PGE2的培养基中培养，和/或该细胞是小鼠或人的。在另一个优选实施方案中，该细胞表现在炎症情况下PGE2产生降低。在另一个优选实施方案中，该细胞分离自含有导致PGES2基因被破坏的修饰的遗传修饰非人哺乳动物。
在第三个方面，本发明涉及鉴定基因的方法，该基因表现表达改变，是由于在动物细胞中PGES2活性改变，所述方法包括比较遗传修饰的动物细胞与野生型细胞的表达情况，其中遗传修饰的动物细胞是PGES 2基因被破坏的遗传修饰的纯合细胞。
本发明的第四个方面涉及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。这种炎症包括慢性炎症(如，类风湿性关节炎和Th1介导疾病如多发性硬化症)，和急性炎症疼痛(如外伤介导的疼痛)。优选，该药剂以足以减轻关节炎症、白细胞浸润、在关节接合表面蛋白聚糖损失，和/或炎症疼痛检测的量给予。
本领域技术人员将完全理解说明书和所附权利要求中描述本发明所使用的术语。然而，除非在此另外提出，下列术语如下面所述。
“遗传修饰”的非人哺乳动物或动物细胞是修饰的杂合或纯合细胞，通过基因工程修饰被导入非人哺乳动物或动物细胞，或者导入祖先非人哺乳动物或动物细胞。可用于导入修饰的基因工程的标准方法包括同源重组、病毒载体基因捕获、放射、化学诱变和编码反义RNA单独或联合催化核酶的核苷酸序列的转基因表达。破坏基因的遗传修饰的优选方法是通过将“外来核酸序列”插入基因位点的修饰内源性基因的方法，如同源重组或病毒载体基因捕获。“外来核酸序列”是基因中非天然存在的外源序列。外来基因的插入可以发生在PGES2基因的任何区域，如增强子、启动子、调节区、非编码区、编码区、内含子或外显子。基因破坏的基因工程最优选方法是同源重组，其中外来核酸序列以定向方式单独插入或同时缺失部分内源基因序列。
被“破坏”的PGES2基因是指经遗传修饰使得被破坏的基因所编码的PGES2多肽在正常表达野生型PGES2基因的细胞中的细胞活性降低或消失的PGES2基因。当遗传修饰有效消除了细胞中PGES2基因的所有野生型拷贝时(如遗传修饰、非人哺乳动物或动物细胞对PGES2基因破坏是纯合的或起初仅存在的PGES2基因的野生型拷贝现在被破坏)，遗传修饰导致PGES2多肽与表达野生型PGES2基因的对照细胞相比活性降低。PGES2多肽活性降低是PGES2基因表达降低(即PGES2 mRNA水平有效降低导致PGES2多肽水平降低)的结果和/或因为被破坏的PGES2基因编码与野生型PGES2多肽相比功能或稳定性改变如降低的突变多肽。优选，PGES2多肽在遗传修饰的非人哺乳动物或动物细胞中的活性降低至野生型水平的50％或更低，更优选至25％或更低，和甚至更优选至野生型水平的10％或更低。最优选，PGES2基因破坏引起已知方法检测不到的PGES2活性。
含PGES2基因破坏的“遗传修饰的非人哺乳动物”是指例如通过产生携带目的遗传修饰的胚泡或胚胎，然后植入代孕母亲体内进行子宫发育而初次产生的非人哺乳动物。在小鼠的例子中，可以通过将遗传修饰的胚胎干细胞(ES)植入小鼠胚泡或通过聚集含四倍体胚泡的ES细胞来制备遗传修饰的胚泡或胚胎。在另一个方法中，使用ES细胞和桑椹胚(8细胞)胚胎(二倍体)通过聚集可以产生嵌合动物。或者，可以通过核转移得到多种遗传修饰的胚胎。在核转移的情况下，供体细胞是体细胞或多能干细胞，并且它被改造为含有破坏了PGES2基因的目的遗传修饰。接着这个细胞的核被转移到去核的受精或单性生殖卵母细胞中；将所得胚胎重构并发育为胚泡。然后，根据本领域技术人员熟知的标准方法将上面方法产生的遗传修饰的胚泡植入代孕母亲。
“遗传修饰的非人哺乳动物”包括上述方法产生的非人哺乳动物的所有后代，只要该后代继承了至少一个拷贝的破坏PGES2基因的遗传修饰。优选遗传修饰的非人哺乳动物的所有体细胞和生殖细胞含有该修饰。优选的被遗传修饰而含有破坏的PGES2基因的非人哺乳动物包括如大鼠和小鼠的啮齿类动物、猫、狗、兔子、豚鼠、仓鼠、绵羊、猪和雪貂。
含破坏的PGES 2基因的“遗传修饰的动物细胞”是指被遗传修饰含有破坏的PGES2基因而产生的动物细胞，包括人细胞，以及继承了破坏的PGES2基因的子细胞。可以根据本领域已知的标准方法在培养物中对这些细胞进行遗传修饰。作为培养物中遗传修饰细胞的可替换物，非人哺乳动物细胞也可以从含有PGES2基因破坏的遗传修饰的非人哺乳动物中分离。本发明的动物细胞可以得自原代细胞或组织制剂以及适应培养的、致瘤的或转化细胞系。这些细胞和细胞系来自例如内皮细胞、上皮细胞、胰岛细胞、神经细胞和其它神经组织衍变的细胞、间皮细胞、骨细胞、淋巴细胞、软骨细胞、造血细胞、免疫细胞、主要腺体或器官的细胞(如睾丸、肝脏、肺脏、心脏、胃、胰腺、肾和皮肤)、肌细胞(包括来自骨骼肌、平滑肌和心肌的细胞)、外分泌或内分泌细胞、成纤维细胞和胚胎细胞和其它全能或多能干细胞(如ES细胞、ES样细胞和胚胎生殖(EG)细胞和其它干细胞，如祖细胞和组织来源干细胞)。优选的遗传修饰细胞是ES细胞，更优选小鼠和大鼠ES细胞，和最优选人ES细胞。
“ES细胞”或“ES样细胞”是指来自胚胎，来自原始生殖细胞，或来自畸胎瘤的多能干细胞，其能够无限自身更新以及分化为代表全部三层胚胎胚层的细胞类型。
“PGES2活性改变”是指引起细胞中功能性PGES2酶水平改变的PGES2基因的遗传操作引起的，或给予促进或拮抗PGES2活性的药剂引起的PGES2酶活性改变。
从下列详细的说明和权利要求，本发明的其它特征和优点将很明显。当本发明与具体实施方案结合描述时，须理解可以实施的其它改变和修改也是本发明的一部分并且也在所附权利要求的范围内。该申请旨在覆盖一般遵循本发明原理的任何等同、变化、使用或改编，包括从本发明公开内容出发落在本领域已知或常规实践中，和不需过度实验能够确定的内容。在分子生物学、蛋白科学和免疫学的标准教科书中(如见Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology，ElsevirSciences Publishing，Inc.，New York，NY，1986；Hames et al.，Nucleic Acid Hybridization，IL Press，1985；Molecular Cloning，Sambrook et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Eds.Ausubel等，John Wiley和Sons；Current Protocols in HumanGenetics，Eds.Dracopoli等，John Wiley和Sons；CurrentProtocols in Protein Science，Eds.John E.Coligan等，John Wiley和Sons；以及Current Protocols in Immunology，Eds.John E.Coligan等，John Wiley和Sons)可找到关于制备和使用核酸和多肽的另外指导。这里提及的所有出版物以其完整形式引入作为参考。
附图简述
图1是描述PGES2基因寻靶载体，该载体在内源小鼠PGES2基因中同源重组的位置，和用于证实基因寻靶的引物位置的实施方案的图。
图2显示了野生型(+/+)，杂合型(+/-)，和敲除型(-/-)小鼠关于破坏的PGES2等位基因的基于聚合酶链式反应(PCR)的基因型测定结果。
图3是显示来自PGES2敲除(-/-)，PGES2杂合型(+/-)和野生型(+/+)ES细胞的ES细胞体外衍生的巨噬细胞(ESM)中，花生四烯酸(AA)刺激10分钟对PGE2生产的作用的图。
图4是显示浓度改变的脂多糖(LPS)刺激对来自PGES2-/-，PGES2+/-和+/+ES细胞的ESM中PGE2生产的作用的图。
图5是显示在来自PGES2(-/-)，PGES2(+/-)和(+/+)ES细胞的ESM中，钙离子载体A23187刺激10分钟对PGE2生产的作用的图。
图6是显示在来自PGES2敲除(-/-)，PGES2杂合型(+/-)和野生型(+/+)ES细胞的ESM，花生四烯酸(AA)刺激10分钟，随后用10μg/mlLPS刺激24小时对PGE2生产的作用的图。
图7显示了在PGES2-/-和PGES2+/+胶原蛋白免疫的雄性和雌性小鼠中，随时间的关节炎分值。
图8显示了在PGES2-/-和PGES2+/+胶原蛋白免疫的雄性和雌性小鼠中，随时间的关节炎发病百分比。
图9显示了在混合性别的PGES2-/-和PGES2+/+胶原蛋白免疫的小鼠中，随时间的关节炎分值。
图10显示了在混合性别的PGES2-/-和PGES2+/+胶原蛋白免疫的小鼠中，随时间的关节炎发病百分比。
图11显示了在接受类似免疫接种方案的动物中，在迟发型过敏反应后，PGES2+/+和PGES2-/-的爪体积改变图12显示了吡罗昔康相对载体处理的PGES+/+和PGES-/-小鼠在时间间隔中伸展的数量。
发明详述含有破坏的PGES2基因的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞1.遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞本发明遗传修饰的非人哺乳动物和遗传修饰的动物细胞，包括人细胞，对破坏了PGES2基因的修饰是杂合或纯合的。该细胞可以由遗传改造培养的细胞衍生，或对于非人哺乳动物细胞的情况，该细胞可以从遗传修饰的非人哺乳动物中分离。
用本领域已知的遗传修饰的几个技术之一破坏PGES2基因位点，包括化学诱变(Rinchik，Trends in Genetics 715-21，1991，Russell，Environmental & Molecular Mutagenesis 23(Suppl.24)23-29，1994)，照射(Russell，前述)，PGES2基因反义RNA单独或与催化性RNA核酶序列联合的转基因表达(Luyckx等，Proc.Natl.Acad.Sci.9612174-79，1999；So双敲除1等，Transgenic Research 5363-71，1996；Efrat et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912051-55，1994；Larsson等，Nucleic Acids Research 222242-48，1994)，和如下进一步讨论的，通过将外来核酸序列插入PGES2基因位点破坏PGES2基因。优选，外来序列通过同源重组或通过插入病毒载体而插入。最优选，破坏PGES2基因的方法是同源重组并包括一部分内源PGES2基因序列缺失。
外来基因的整合通过一种或几种下列机制破坏PGES2基因通过干扰PGES2基因转录或翻译过程(如通过干扰启动子识别，或通过将转录终止位点或翻译终止密码子导入PGES2基因)；或通过歪曲PGES2基因编码序列使得它不再编码具有正常功能的PGES2多肽(如，通过将外来编码序列插入PGES2基因编码序列，通过导入移码突变或氨基酸置换，或在双交换事件的情况下，通过缺失一部分功能性PGES2蛋白表达所需的PGES2基因编码序列)。
为了将外来序列插入细胞基因组中的PGES2基因位点以产生基于本说明书的本发明的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞，根据本领域已知的标准方法将外来DNA序列导入细胞，如电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、biolistics、脂质体转染、DEAE-葡聚糖转染或转移感染(如见Neumann等，EMBO J.1841-845，1982；Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 817161-65，1984；Chu et al.，NucleicAcids Res.151311-26，1987；Thomas和Capecchi，Cell 51503-12，1987；Baum et al.，Biotechniques 171058-62，1994；Biewenga et al.，J.Neuroscience Methods 7167-75，1997；Zhang等，Biotechniques 15868-72，1993；Ray和Gage，Biotechniques 13598-603，1992；Lo，Mol.Cell.Biol.31803-14，1983；Nic双敲除loff等，Mol.Biotech.1093-101，1998；Linney等，Dev.Biol.(Orlando)213207-16，1999；Zimmer和Gruss，Nature 338150-153，1989；及Robertson等，Nature 323445-48，1986))。外来DNA导入细胞的优选方法是电穿孔。
2.同源重组同源重组的方法通过将PGES2基因寻靶载体导入含PGES2基因的细胞来破坏PGES2基因。载体破坏PGES2基因的能力源自在载体中使用与PGES2基因同源，即与其相关的核苷酸序列。这个同源区域促进载体和PGES2内源序列之间杂交。通过杂交，寻靶载体和基因组序列之间交换事件的可能性大大增加。这个交换事件导致载体序列整合到PGES2基因位点和PGES2基因的功能性破坏。
Bradley et al.(Biotechnol.10534，1992)综述了关于用于寻靶的载体构建的一般原则。两种不同类型的载体可以用于通过同源重组插入DNA插入载体或置换载体。插入载体是环状DNA，它含有带双链断裂的PGES2基因同源区域。同源区域和内源PGES2基因之间杂交后，在双链断裂处的单一交换事件引起整个载体序列在交换部位插进内源基因内。
通过同源重组产生本发明遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞的最优选载体是置换载体，它是线性对应的而非环状的。置换载体整合到PGES2基因中需要双交换事件，即在寻靶载体和PGES2基因之间杂交的两个部位交换。这个双交换事件导致插在交换的两个部位之间的载体序列整合到PGES2基因和最初跨越交换的两个部位之间的相应内源PGES2基因序列缺失(如见Thomas和Capecchi et al.，Cell 51503-12，1987；Mansour et al.，Nature 336348-52，1988；Mansour etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877688-7692，1990；及Mansour，GATA 7219-227，1990)。
产生本发明遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞的寻靶载体中的同源区域长度通常至少100个核苷酸。最优选，同源区域长度至少1-5千个碱基(kb)。尽管没有表现同源区域需要的最短长度或最低相关程度，但是同源重组的寻靶效率通常与长度和寻靶载体同PGES2基因位点之间相关程度相应。在使用置换载体且同源重组时缺失部分内源PGES2基因的情况下，另外的考虑是内源PGES2基因被缺失部分的大小。如果内源PGES2基因的这部分长度大于1kb，那么推荐超过1kb的具有同源性区域的寻靶盒来增强重组效率。基于本说明书，文献中描述了有关有效进行同源重组的序列选择和使用的更多指导(如见Deng和Capecchi，Mol.Cell.Biol.123365-3371，1992；Bollag等，Annu.Rev.Genet.23199-225，1989；及Waldman和Liskay，Mol.Cell.Biol.85350-5357，1988)。
如本领域技术人员会认识到的，大量种类的克隆载体可以在构建本发明的PGES2基因寻靶载体中用作载体骨架，包括pBluescript-相关质粒(如Bluescript KS+11)，pQE70，pQE60，pQE-9，pBS，pD10，phagescript，phiX174，pBK Phagemid，pNH8A，pNH16a，pNH18Z，pNH46A，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，和pRIT5 PWLNEO，pSV2CAT，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，PBPV，PMSG，和pSVL，pBR322和基于pBR322的载体，pMB9，pBR325，pKH47，pBR328，pHC79，噬菌体黄热病病毒28，pKB11，pKSV-10，pK19相关质粒，pUC质粒和pGEM系列质粒。这些载体可以从各种商业来源得到(如Boehringer MannheimBiochemicals，Indianapolis，IN；Qiagen，Valencia，CA；Stratagene，La Jolla，CA；Promega，Madison，WI；和New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。然而，任何其它载体，如质粒、病毒，或其部分，都可以使用，只要它们在所需宿主中可复制并且有活力。载体也可以包括使其能够在待修饰宿主的基因组中复制的序列。这种载体的使用可扩大重组发生过程中相互作用的时间，增加寻靶效率(见MolecularBiology，ed.Ausubel et al，Unit 9.16，Fig.9.16.1)。
用于扩增本发明寻靶载体的特异宿主不是很关键。实例包括大肠杆菌K12 RR1(Bolivar等，Gene 295，1977)，大肠杆菌K12 HB101(ATCC No.33694)，大肠杆菌MM21(ATCC No.336780)，大肠杆菌DH1(ATCC No.33849)，大肠杆菌株DH5α，和大肠杆菌STBL2。或者，可以使用宿主如啤酒糖酵母或枯草芽孢杆菌。上面提及的宿主可以从商业上得到(如Stratagene，La Jolla，CA；和Life Technologies，Rockville，MD)。
为了产生寻靶载体，PGES2基因寻靶构建体添加到上述载体骨架中。本发明的PGES2基因寻靶构建体具有至少一个PGES2基因同源区域。为了制备PGES2基因同源区域，PGES2基因组或cDNA序列用作产生聚合酶链式反应(PCR)引物的基础。这些引物用于通过高保真PCR扩增PGES2序列目的区域(Mattila et al.，Nucleic Acids Res.194967，1991；Eckert和Kunkel 117，1991；及美国专利4,683,202)。基因组序列得自基因组克隆文库或基因组DNA制剂，优选得自待寻靶进行PGES2基因破坏的动物种。小鼠PGES2 cDNA序列可用于制备PGES2寻靶载体(Genbank NM 022415和AB041997)。
优选，本发明的寻靶构建体也包括编码阳性标记蛋白的外源核苷酸序列。阳性标记在载体整合后的稳定表达赋予细胞可辨认的特征，理想地不损害细胞活力。因此，在置换载体的情况下，标记基因位于同源区域的两侧之间使得它在双交换事件后整合到PGES2基因且其定位适于进行表达。
优选该阳性标记蛋白是可选择蛋白；这种蛋白在细胞中的稳定表达赋予可选择的表型特征，即该特征增强在致死条件下细胞的存活力。因此，利用可选择条件，基于生活力，可以将稳定表达阳性可选择标记编码载体序列的细胞与没有成功整合载体序列的其它细胞分离开来。阳性可选择标记蛋白(和它们的选择药剂)的实例包括neo(G418或卡那霉素)，hyg(匀霉素)，hisD(组氨醇)，gpt(黄嘌呤)，ble(博莱霉素)，和hprt(次黄嘌呤)(如见Capecchi和Thomas，美国专利5,464,764，及Capecchi，Science 2441288-92，1989)。也可用作可选择标记替换物的其它阳性标记包括报道蛋白如β-半乳糖苷酶，虫荧光素酶或GFP(如见Current Protocols in Cytometry，Unit 9.5，及CurrentProtocols in Molecular Biology，Unit 9.6，John Wiley & Sons，NewYork，NY，2000)。
上述阳性选择步骤不能区分通过寻靶同源重组已经在PGES2基因位点整合载体的细胞和载体序列随机非同源整合到任何染色体位置的细胞。因此，当使用同源重组的置换载体时，也优选包括编码阴性可选择标记蛋白或合适的替换物的核苷酸序列。阴性可选择标记使得表达该标记的细胞接触某些药剂后丧失活力(即该标记蛋白使细胞在某些可选择条件下致死)。阴性可选择标记(及其致死性药剂)的实例包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(gancyclovir或1，2-脱氧-2-氟-α-d-阿糖呋喃-5-碘尿嘧啶)，Hprt(6-硫代鸟嘌呤或6-硫代黄嘌呤)，和白喉毒素，蓖麻毒素和胞嘧啶脱氨基酶(5-氟胞嘧啶)。
编码阴性可选择标记的核苷酸序列位于置换载体两个同源区域的外部。给定这种位置，如果细胞随机非同源重组发生整合，细胞将仅整合和稳定表达阴性可选择标记；在PGES2基因和寻靶构建体中两个同源区域之间的同源重组将编码阴性可选择标记的序列排除在整合之外。因此，利用阴性条件，随机非同源重组已经整合寻靶载体的细胞丧失活力。
优选上述阳性和阴性可选择标记组合，因为设计一系列阳性和阴性选择步骤可更有效地仅选择已经由同源重组进行载体整合，并由此含有效破坏的PGES2基因的那些细胞。例如美国专利5,464,764，WO94/06908和Valancius和Smithies，Mol.Cell.Biol.111402，1991中描述了阳性-阴性选择方案、可选择标记和寻靶构建体的更多实例。
对于载体整合时稳定表达的标记蛋白，可以设计寻靶载体使得载体整合时该标记编码序列可操作连接内源PGES2基因启动子。在正常表达PGES2基因的细胞中，PGES2基因启动子驱动该标记表达。或者，寻靶构建载体中的每个标记可以含有不依赖PGES2基因启动子而驱动表达的它们自己的启动子。后种方案具有允许该标记在不典型表达PGES2基因的细胞中表达的优点(Smith和Berg，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.49171，1984；Sedivy和Sharp，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86227，1989；Thomas和Capecchi，Cell 51503，1987)。
可用于驱动标记基因表达的外源启动子包括细胞特异性或阶段特异性启动子、组成型启动子和诱导型或调节型启动子。这些启动子的非限制性实例包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子、SV40启动子、PGK启动子、PMC1-neo、金属硫蛋白启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、禽β球蛋白启动子、组蛋白启动子(如小鼠组蛋白H3-614)、β肌动蛋白启动子、神经元特异性烯醇化酶、肌肉肌动蛋白启动子和花椰菜病毒35S启动子(通常见Sambrook等，Molecular Cloning，Vols.1-111，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，及CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，2000)；Stratagene，La Jolla，CA。
为了确定细胞是否已经将载体序列整合到寻靶PGES2基因位点，与目的载体整合事件特异的引物或基因组探针可以与PCR或DNA杂交分析联合使用以鉴定目的载体整合入PGES2基因位点的存在(Erlich et al.，Science 2521643-51，1991；Zimmer和Gruss，Nature 338150，1989；Mouellic et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)874712，1990；及Shesely et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)884294，1991)。
3.基因捕获基于本说明书，可利用的将外来核酸序列插入PGES2基因位点来破坏PGES2基因的方法是基因捕获。这个方法利用所有哺乳动物细胞中存在的将外显子剪接成mRNA的细胞机器将基因捕获载体编码序列以随机方式插入基因中。一旦被插入，基因捕获载体产生可能破坏捕获的PGES2基因的突变。与同源重组相比，这个进行诱变的系统产生更加随机的突变。因此，为了得到含有PGES2基因被破坏的遗传修饰细胞，应该从各种基因随机突变的细胞库中鉴定和选择含有这种特定突变的细胞。
已经描述了基因捕获系统和载体用于遗传修饰小鼠细胞和其它细胞类型(如见Allen等，Nature 333852-55，1988；Bellen et al.，Genes Dev.31288-1300，1989；Bier et al.，Genes Dev.31273-1287，1989；Bonnerot et al.，J.Virol.664982-91，1992；Brenneret al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 865517-21，1989；Chang et al.，Virology 193737-47，1993；Friedrich和Soriano，Methods Enzymol.225681-701，1993；Friedrich和Soriano，Genes Dev.51513-23，1991；Goff，Methods Enzymol.152469-81，1987；Gossleret al.，Science 244463-65，1989；Hope，Develop.113399-408，1991；Kerr et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.2767-776，1989；Reddy等，J.Virol.651507-1515，1991；Reddy等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.896721-25，1992；Skarnes等，Genes Dev.6903-918，1992；yon Melchner和Ruley，J.Virol.633227-3233，1989；及Yoshida等，Transgen.Res.4277-87，1995)。
启动子捕获或5’，载体，从5’至3’顺序，含有剪接接受体序列，之后是外显子，其典型特征是翻译起始密码子和开放阅读框架和/或内部核糖体进入部位。一般来说，这些启动子捕获载体不含有启动子或可操作连接剪接供体序列。所以，整合到宿主细胞的细胞基因组之后，启动子捕获载体序列妨碍上游基因的正常剪接并作为终止外显子。载体编码序列的表达依赖于载体以正确阅读框架整合到被破坏基因的内含子中。在这种情况下，细胞剪接机器从载体编码序列上游的捕获基因剪接外显子(Zambrowicz等，WO 99/50426，美国专利6,080,576)。
制备作用类似于上述启动子捕获载体的可替换方法是载体合并了存在于或改造进入启动子捕获载体的剪接受体和翻译起始密码子或聚腺苷序列之间区域的一组嵌套终止密码子。该编码序列也可以改造含有独立的核糖体进入部位(IRES)使得该编码序列将以大部分不依赖宿主细胞基因组内整合部位的方式表达。典型但不是必须，IRES与一组嵌套终止密码子联合使用。
另一类型的基因捕获方案使用3’基因捕获载体。这类型载体可操作联合含有介导相邻编码序列表达的启动子区域、编码序列和限定编码序列外显子3’末端的剪接供体序列。整合到宿主细胞基因组后，载体启动子表达的转录物与来自捕获基因的位于整合基因捕获载体序列下游的剪接受体序列剪接。因此，载体整合导致融合转录物表达，其包括3’基因捕获盒的编码序列和下游细胞外显子，包括终止外显子及其聚腺苷信号。当这种载体整合到基因，细胞剪接机器剪接捕获基因3’外显子上游的载体编码序列。这种载体的一个优点是3’基因捕获载体的表达由基因捕获盒内的启动子驱动且不需要整合到宿主细胞正常表达的基因中(Zambrowicz等，WO 99/50426)。可能合并到3’基因捕获载体的转录启动子和增强子的实例包括上面讨论的有关寻靶载体的那些。
用作启动子或3’基因捕获载体的结构成分的病毒载体骨架可以从可插入到靶细胞基因组的广泛载体中选择。合适的骨架载体包括但不限于单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、假狂犬病病毒、α疱疹病毒载体等等。在Viral VectorsGene Therapy and Neuroscience Applications，Eds.Caplitt andLoewy，Academic Press，San Diego，1995中可找到病毒载体的全面综述，尤其是适合修饰非复制细胞的病毒载体和如何与外源多核苷酸序列表达联合使用这种载体。
优选，逆转录病毒载体用于基因捕获。这些载体可以与逆转录病毒包装细胞系如美国专利5,449,614中描述的那些联合使用。当非鼠哺乳动物细胞用作遗传修饰的靶细胞时，兼嗜性或泛嗜性包装细胞系可用于包装合适的载体(Ory et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9311400-11406，1996)。例如美国专利5,521,076中描述了可修改而产生刚才描述的3’基因捕获载体的代表性逆转录病毒载体。
基因捕获载体可以含有上面讨论的有关用于同源重组的寻靶载体中的一个或多个阳性标记基因。类似于它们在寻靶载体中的应用，这些阳性标记用于基因捕获载体来鉴定和选择载体已经整合到细胞基因组的细胞。该标记基因可以改造含有独立的核糖体进入部位(IRES)使得该标记以大部分不依赖载体整合到靶细胞基因组的位置的方式表达。
在基因捕获载体以相当随机的方式整合到被感染宿主细胞基因组的情况下，应该从已经历随机载体整合的大量细胞中鉴定具有破坏的PGES2基因的遗传修饰细胞。优选，细胞群中的遗传修饰的随机性和频率足以使总体代表在细胞基因组中基本上每个基因的突变，使得具有破坏的PGES2基因的细胞可能从总体中鉴定出来(见Zambrowicz et al.；WO 99/50426；Sands等，WO98/14614；美国专利6,080,576)。
使用例如反转录和PCR鉴定PGES2基因序列中的突变而鉴定突变细胞群中含有破坏的PGES 2基因的各个突变细胞系。这个方法可以通过汇聚(pooling)克隆而流水线化。例如，为了找到含有破坏的PGES2基因的单个克隆，使用锚定于基因捕获载体的一个引物和位于PGES2基因序列的另一个引物实施RT-PCR。阳性RT-PCR结果显示载体序列编码于PGES2基因转录物中，表明PGES2基因已经被基因捕获整合事件破坏(如见Sands等，WO 98/14614，美国专利6,080,576)。
4.时间、空间和诱导型PGES2基因破坏在本发明的某些实施方案中，内源PGES2基因的功能性破坏发生在特定发育或细胞周期阶段(时间破坏)或在特殊细胞类型(空间破坏)。在其它实施方案中，当某些条件存在时，PGES2基因破坏是可诱导的。重组酶切除系统，如Cre-Lox系统，可以用于在特殊发育阶段，在特定组织或细胞类型，或在特定环境条件下活化或灭活PGES2基因。通常，如Torres和Kuhn，Laboratory Protocols for Conditional GeneTargeting，Oxford University Press，1997所述实施利用Cre-Lox技术的方法。类似于Cre-Lox系统所述的方法也可以使用利用FLP-FRT的系统。例如美国专利5,626,159，美国专利5,527,695，美国专利5,434,066，WO 98/29533，Orban等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 896861-65，1992；O′Gorman等，Science 2511351-55，1991；Saueret al.，Nucleic Acids Research 17147-61，1989；Barinaga，Science 26526-28，1994；及Akagi等，Nucleic Acids Res.251766-73，1997中提供了关于使用重组酶切除系统通过同源重组或病毒插入有条件地破坏基因的更多指导。如本领域技术人员会领会到的，一个以上重组酶系统也可以用于遗传修饰非人哺乳动物或动物细胞。
当使用同源重组以时间、空间或诱导的方式破坏PGES2基因，使用重组酶系统如Cre-Lox系统，一部分PGES2基因编码区被寻靶构建体取代，包括侧接loxP位点的PGES2基因编码区。携带这个遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞含有功能性侧接loxP的PGES2基因。PGES2基因破坏的时间、空间或诱导方面是由非人哺乳动物和动物细胞中表达的分别在目的空间调节、时间调节或诱导型启动子控制下的另外的转基因，Cre重组酶转基因表达模式引起的。Cre重组酶靶向loxP重组位点。因此当Cre表达活化时，LoxP位点接受重组切除插入的PGES2基因编码序列，引起PGES2基因的功能性破坏(Rajewski等，J.Clin.Invest.98600-03，1996；St.-Onge et al.，Nucleic Acids Res.243875-77，1996；Agah et al.，J.Clin.Inyest.100169-79，1997；Brocard et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9414559-63，1997；Feilet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9310887-90，1996；及Kühn et al.Science 2691427-29，1995)。
通过标准转基因技术，或在遗传修饰的非人哺乳动物的情况下，通过在目的启动子控制下，杂交遗传修饰的非人哺乳动物，其中一个亲本含有侧接loxP的PGES2基因而另一个含有Cre重组酶转基因，产生含有Cre重组酶转基因和侧接loxP的PGES2基因的细胞。在例如Sauer，Meth.Enz.225；890-900，1993，Gu et al.，Science265103-06，1994，Araki et al.，J.Biochem.122977-82，1997，Dymechi.Proc.Natl.Acad.Sci.936191-96，1996，及Meyers et al.，Nature Genetics 18136-41，1998.中可找到关于使用重组酶系统和特殊启动子进行时间、空间或有条件地破坏PGES2基因的更多指导。
使用四环素反应二元系统也可完成PGES2基因的诱导型破坏(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-51，1992)。这个系统包括遗传修饰细胞，将Tet启动子导入内源PGES2基因调节元件和表达四环素可控抑制剂(TetR)的转基因。在这种细胞中，给予四环素活化TetR，它又抑制PGES2基因表达且因此破坏PGES2基因(St.-Onge et al.，Nucleic Acids Res.243875-77，1996，U.S.PatentNo.5,922,927)。
当使用例如WO98/29533和美国专利6,288,639所述遗传修饰方法的基因捕获时，也可以采用上述系统对PGES 2基因进行时间、空间和诱导型破坏。
5.产生遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞上述遗传修饰方法可用于破坏来自动物的实质上任何形式的体细胞或干细胞中的PGES2基因。本发明遗传修饰的动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞，包括人细胞和鸟类细胞。这些细胞可以源自遗传修饰的任何动物细胞系，如适应培养的、致瘤的或转化的细胞系，或它们可以分离自携带目的PGES2遗传修饰的遗传修饰的非人哺乳动物。
该细胞可以是杂合或纯合的PGES2基因被破坏的细胞。为了获得纯合的PGES2基因破坏的细胞(PGES2-/-)，可实施两个等位基因的直接、顺序寻靶。通过循环阳性可选择标记促进这个过程。根据这个方案，在破坏一个等位基因后使用Cre-LoxP系统去除编码阳性可选择标记的核苷酸序列。因此，在寻靶破坏第二个PGES2基因等位基因的随后循环中可使用相同的载体(Abuin和Bradley，Mol.Cell.Biol.161851-56，1996；Sedivy等，T.I.G.1588-90，1999；Cruz等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887170-74，1991；Mortensen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887036-40，1991；Riele等，Nature(London)348649-651，1990)。
获得PGES2-/-的ES细胞的另一策略是从一群PGES2基因破坏(PGES2+/-)的杂合细胞中进行细胞同基因型化(homogenotication)。该方法使用在很高药物浓度下选择表达选择性耐药标记的PGES2+/-寻靶克隆的方案；这种选择利于表达两个拷贝的编码耐药标记序列的细胞，因此，PGES2基因破坏是纯合的(Mortensen et al.，Mol.Cell.Biol.122391-95，1992)。此外，遗传修饰的动物细胞可由生殖细胞是PGES2+/-的非人哺乳动物交配产生的遗传修饰的PGES2-/-非人哺乳动物得到，如下详细讨论。
遗传修饰目的细胞或细胞系之后，根据本领域已知的标准PCR或DNA印迹方法，用PCR分析证实PGES 2基因位点是修饰部位(如见美国专利4,683,202；及Erlich等，Science 2521643，1991)。如果在正常表达PGES2基因的细胞中，PGES2基因信使RNA(mRNA)水平和/或PGES2多肽水平降低，也可以更进一步证实PGES2基因的功能性破坏。使用反转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹分析或原位杂交可获得PGES2基因mRNA水平测定。用例如本领域已知的标准免疫试验方法可进行细胞产生PGES2多肽水平的定量。这种免疫试验包括但不限于竞争性和非竞争性实验系统，使用技术如RIA(放射免疫试验)、ELISA(酶链免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散实验、原位免疫试验(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、2-二维凝胶分析、沉淀反应、免疫荧光试验、蛋白A试验和免疫电泳试验。
优选的遗传修饰的动物细胞是胚胎干细胞(ES)和ES样细胞。这些细胞源自多种物种的预先植入胚胎和胚泡，例如小鼠(Evans等，Nature 129154-156，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，787634-7638，1981)、猪和绵羊(Notanianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260，1991；Campbell等，Nature 38064-68，1996)和灵长目，包括人(Thomson et al.，U.S.Patent No.5,843,780，Thomson et al.，Science 2821145-1147，1995；and Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844-7848，1995)。
这些类型的ES细胞是多能的。也就是说，在适当条件下，它们分化成来自全部三个胚胎胚层外胚层、中胚层和内胚层的多种细胞类型。依赖于培养条件，ES细胞样品可如同干细胞进行无限培养，允许在单一样品内分化为多种不同细胞类型，或直接分化为特定细胞类型，如巨噬细胞样细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、角质细胞和造血细胞如嗜酸性细胞、肥大细胞、类红细胞祖先细胞或巨核细胞。通过在培养条件中包括特殊生长因子或基质成分完成直接分化，例如Keller等，Curr.Opin.Cell Biol.7862-69，1995，Li等，Curr.Biol.8971，1998，Klug等，J.Clin.Invest.98216-24，1996，Lieschke等，Exp.Hematol.23328-34，1995，Yamane等，Blood 903516-23，1997，及Hirashima等，Blood 931253-63，1999进一步所述。
用于遗传修饰的特定胚胎干细胞系并不关键；示范的小鼠ES细胞系包括AB-1(McMahon和Bradley，Cell 621073-85，1990)，E14(Hooper等，Nature 326292-95，1987)，D3(Doetschman等，J.Embryo.Exp.Morph.8727-45，1985)，CCE(Robertson et al，Nature323445-48，1986)，RW4(Genome Systems，St.Louis，MO)和DBA/1lacJ(Roach等，Exp.Cell Res.221520-25，1995)。根据发表的步骤(Robertson，1987，Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，Ed.E.J.Robertson，OxfordIRL Press，pp.71-112，1987；Zjilstra等，Nature 342435-438，1989；及Schwartzberget al.，Science 246799-803，1989)，遗传修饰的小鼠ES细胞可以用于产生遗传修饰的小鼠。
在证实ES细胞含有目的功能性破坏的PGES2基因后，根据本领域已知的方法(Capecchi，Trends Genet.570，1989)，这些ES细胞接着被注射到合适的胚泡宿主产生嵌合小鼠。本发明中使用的特定小鼠胚泡不是很重要。这种胚泡的实例包括来自C57BL6小鼠、C57BL6白化小鼠、Swiss Webster远交小鼠、CFLP小鼠和MFI小鼠的胚泡。SwissWebster小鼠可从Charles River Laboratories商业得到，即CD-1小鼠。或者Es细胞可以在聚集孔中夹在四倍体胚胎之间(Nagy等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA908424-8428，1993)。
含遗传修饰ES细胞的胚泡或胚胎接着被植入代孕雌性小鼠并允许在子宫中发育(Hogan et al.，Manipulating the Mouse EmbryoALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory press，ColdSpring Harbor，NY1988；及Teratocarcinomas and Embryonic StemCellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.，IRLPress，Washington，D.C.，1987)。
筛选养育母亲所生的后代以鉴定PGES2基因破坏杂合的后代。通常，这种后代含有来自遗传修饰供体ES细胞的一些细胞以及来自最初胚泡的其它细胞。在这种环境下，在已经利用皮毛颜色选择策略的情况下，最初以嵌合皮毛颜色筛选后代，以区分来自供体ES细胞，来自胚泡的其它细胞的细胞。或者，后代的尾组织的DNA可用于鉴定含有遗传修饰细胞的小鼠。
在生殖细胞系含有被破坏的PGES2基因的杂合小鼠交配产生在所有生殖细胞系和体细胞中具有被破坏的PGES2基因的后代。被破坏的PGES2基因杂合小鼠接着可交配产生纯合体(如见美国专利5,557,032，及美国专利5,532,158)。
上述将来自一个细胞的遗传修饰转移给整个动物的ES细胞技术的可替换技术是使用核转移。可使用这个方法制造除小鼠之外的其它遗传修饰的非人哺乳动物，例如绵羊(McCreath等，Nature 291066-69，2000；Campbell等，Nature 38964-66，1996；及Schnieke等，Science 2782130-33，1997)和小牛(Cibelli等，Science 2801256-58，1998)。简言之，体细胞(如成纤维细胞)或多能干细胞(如ES样细胞)选择作为核供体并遗传修饰使其含有功能性破坏的PGES2基因。当DNA载体插入体细胞使PGES2基因突变时，优选载体中使用无启动子的标记，使得该载体整合到PGES2基因导致该标记在PGES2基因启动子控制下表达(Sedivy和Dutriaux，T.I.G.1588-90，1999；McCreath等，Nature 291066-69，2000)。来自具有适当被破坏的PGES2基因的供体细胞的核接着转移到去核的受精或单性生殖卵母细胞中(Campbell等，Nature 38064，1996；Wilmut等，Nature 385810，1997)。胚胎被重构，培养发育为桑椹胚/胚泡阶段，并转移到养育母亲在子宫中进行足月发育。
本发明也包括遗传修饰的非人哺乳动物和遗传修饰的动物细胞的后代。无论后代的破坏PGES2基因的遗传修饰是杂合或纯合，由于突变或环境影响，除了在继承后代中可能发生的最初遗传破坏的PGES2基因外，它们在遗传上与亲代非人哺乳动物和动物细胞可能不等同。
使用本领域技术人员已知的技术，来自非人遗传修饰动物的细胞可从组织或器官分离。在一个实施方案中，本发明遗传修饰的细胞可无限增殖。根据这个实施方案，通过在细胞中端粒酶基因、癌基因，如mos或v-src，或凋亡抑制基因、如bcl-2的遗传修饰，可使细胞无限增殖。或者，利用本领域技术人员已知的技术，与杂交伙伴融合可使细胞无限增殖。
6.“人源化的”非人哺乳动物和动物细胞本发明含有破坏的内源PGES2基因的遗传修饰的非人哺乳动物和非人动物细胞可进一步修饰表达人PEGS2序列(这里称作“人源化的”)。人源化细胞的优选方法包括由同源重组用编码人PGES 2序列的核苷酸序列取代内源PGES2序列(Jakobsson等人，Proc.Acad.Sci USA967220-25，1999)。该载体在5’和3’同源臂和阳性/阴性选择方案类似于传统用作寻靶载体的那些。然而，该载体也包括重组后置换人PGES2编码序列内源序列或实现碱基改变、外显子置换或密码子置换以修改编码人PGES2的内源序列。一旦已经鉴定了同源重组，可使用Cre或Flp介导的位点定向重组切除任何基于选择的序列(如neo)(Dymecki，Proc.Natl.Acad.Sci.936191-96，1996)。
当人PGES2序列置换内源序列时，优选这些改变直接导入内源翻译起始位点下游。这个定位保持PGES2基因的内源时间和空间表达模式。人序列可以是为了正确加工而在3’末端连接多聚A尾巴的全长人cDNA序列或整个基因组序列(Shiao等，Transgenic Res.8295-302，1999)。在例如Sullivan等，J.Biol.Chem.27217972-80，1997，Reaume et al.，J.Biol.Chem.27123380-881996，及Scott等，美国专利5,777,194中找到关于遗传修饰细胞和非人哺乳动物，用其人副本取代内源基因表达的这些方法的更多指导。
产生这种“人源化”生物体的另一种方法是两步过程包括破坏内源基因，随后用原核显微注射将编码人序列的转基因导入敲除的胚胎中。
7.遗传修饰非人哺乳动物和动物细胞的用途调查本发明被破坏的PGES2基因纯合(-/-)和杂合(+/-)的非人哺乳动物和动物细胞的表型可说明PGES2功能和治疗相关性。例如，遗传修饰PGES2-/-非人哺乳动物和动物细胞可用于确定PGES2在某些疾病模型中是否作用引起、降低或预防症状或表型发展，如关节炎和癌症。如果PGES2-/-非人哺乳动物或动物细胞与野生型(PGES2+/+)或PGES2+/-非人哺乳动物或动物细胞相比，症状或表型不同，那么PGES2多肽在调节与该症状或表型相关的功能中起作用。可用于估计PGES2功能的动物模型的实例包括检测慢性和急性炎症反应和感受伤害功能的模型(如胶原诱导的关节炎，用于白细胞趋化性的气袋模型，角叉菜胶诱导的水肿和醋酸诱导的扭曲)，估计心肾功能的模型(如测定泌尿道前列腺素分泌作为钠吸收的函数)和估计血栓形成的模型(如测定出血时间和血小板聚集)。
此外，在一种药剂被鉴定为PGES2激动剂或拮抗剂的情况下(如当该药剂给予PGES2+/+或PGES2+/-非人哺乳动物或动物细胞时，该药剂显著改变一种或多种PGES2多肽活性)，本发明遗传修饰的PGES2-/-动物细胞可有效描述该药剂引起的除已知PGES2激动(拮抗)引起作用之外的任何其它作用的特征(即，非人哺乳动物和动物细胞可用作阴性对照)。例如，如果给予该药剂对PGES2+/+非人哺乳动物或动物细胞引起未知是否与PGES2多肽活性相关的作用，那么将该药剂给予相应的PGES2-/-非人哺乳动物或动物细胞，可以确定该药剂是否单独或主要通过调节PGES2发挥这个作用。如果缺乏或明显降低这个作用，至少部分是由PGES2引起。然而，如果PGES2-/-非人哺乳动物或细胞显示出可与PGES2+/+或PGES2+/-非人哺乳动物或动物细胞相当程度的作用，那么该作用由不包括PGES2信号的途径介导。
此外，如果猜测一种药剂可能通过PGES2途径发挥作用，那么PGES2-/-非人哺乳动物可有效作为阴性对照来检测这个假说。如果该药剂确实通过PGES 2作用，那么该药剂给予PGES2-/-非人哺乳动物时，不应该显示出与PGES2+/+非人哺乳动物类似的作用。
本发明遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞也可以用于鉴定PGES2+/-或PGES2-/-非人哺乳动物或动物细胞相对于其野生型对照表达被上调的基因。基于本发明说明书，本领域技术人员已知的技术可用于鉴定这种基因。例如，DNA试验可用于鉴定在PGES2+/-或PGES2-/-小鼠中表达被上调以补偿PGES2表达缺陷的基因。DNA阵列是本领域技术人员已知的并且具有商业来源，如Affymetrix(如见U.S.Patent No.5,965,352；Schena et al.，Science 270467-470，1995；DeRisi等，Nature Genetics 14457-460，1996；Shalon等，Genome Res.6639-645，1996；及Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9310539-11286，1995)。
实施例A.文库杂交335个核苷酸的部分cDNA片段(Genbank AB041997中小鼠PGES2cDNA序列的核苷酸35-369)用于与DBA/1lacJ基因组λ噬菌体文库(Stratagene)杂交。分离三个重叠PGES2基因组克隆并亚克隆进入pBluescript SK+(Stratagene)的Not I位点。对这些克隆绘制限制性酶切图谱并确定含有24kb的PGES2基因组位点，包括所有3个外显子。
B.寻靶载体构建从PGES2基因组克隆#24.2-8分离1.0kb NheI/Bgl II片段并亚克隆进入Litmus 28载体(New England Biolabs，Beverly，MA)的Xba I/BamHI位点。用Kpn I/Eco RI消化从Litmus载体再次分离l.0kb片段并克隆进入pJNS2-Frt寻靶载体骨架的Kpn 1/Eco R1位点(Dombrowicz等，Cell 75969-76，1993)作为5’同源臂。这个中间克隆记做PGES2 5′-JNS2Frt克隆#10。也从基因组克隆#24.2-8分离8.8kb Not I/Sph I限制性片段的3’同源臂。这个8.8kb片段亚克隆进入克隆载体Litmus 39(New England Biolabs)的Eag I/Sph I位点，从Litmus 39载体再次分离8.8kb Sal I片段。这个Sal I片段克隆进入PGES2 5′-JNS2Frt克隆#10的Xho位点。名为PGES2-双敲除克隆#5的含两个同源臂的最后寻靶载体克隆被设计用PGK-新霉素盒取代3.0kb的PGES2基因组位点。该3.0kb缺失片段含有部分外显子1和完整外显子2，编码Genbank AB041997的cDNA序列的35-256个核苷酸(图1)。
C.筛选ES细胞用NotI将PGES2-双敲除克隆#5寻靶载体线性化并电穿孔到DBA/1LacJ ES细胞(Roach等，Exp.Cell.Res.221520-25，1995)。在丝裂霉素C(Sigma Chemical，St.Louis，MO)处理的原代胚胎成纤维细胞(PEF)饲养层上，干细胞培养基(SCML)中培养维持多能Es细胞，所述培养基由去除DMEM(Invitrogen Life Technologies，Inc.(ILTI)，Carlsbad，CA，#10829-018)组成，并补充15％ES细胞质量的胎牛血清(ILTI，#10439-024)，0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma Chemical，#M-7522)，0.2mM L-谷氨酰胺(ILTI，#25030-081)，0.1mM MEM非必需氨基酸(ILTI，#11140-050)，1000单位/ml重组小鼠白血病抑制因子(ChemiconInternational Inc.，Temecula，CA，#ESG-1107)和青霉素/链霉素(ILTI，#15140-122)。
使用BTX电子细胞操纵器600(BTX，Inc.，San Diego，CA)，在240v电压、50μF电容和360欧姆电阻下，电穿孔SCML中的1×107个细胞和25μg线性化寻靶载体。电穿孔含有200μg/ml G418(ILTI，#11811-031)和2μM gancyclovir(Syntex，Palo Alto，CA)的SCML24小时后开始阳性/阴性选择。选择8-12天后用微量吸管挑出抗性克隆。如Mohn和双敲除ller(Mohn，DNA Cloning 4(ed.Hames)，143-184，Oxford University Press，New York，1995)所述实施抗性ES细胞克隆的扩增和筛选。
从在G418和gancydovir选择中存活的79个ES细胞克隆分离DNA并用Nhe I和Eco RV限制性酶消化。消化物在0.7％琼脂糖凝胶(BioWhittaker Molecular Applications，Rockland，ME)上电泳并转移到Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)尼龙膜进行DNA印迹分析。1.1kb KpnI/Nhe I基因组片段，8.8kb的3′同源臂的3’用作探针筛选3’端的同源重组。1.1kb探针识别12.5kb内源Nhe I片段和靶等位基因的11.0kb片段，因为在新霉素盒中导入Eco Rv位点。从筛选的79克隆中，用1.1kb3’探针(克隆#22，#70，#78，和#84)鉴定到4个靶克隆。使用时1.0kb 5’同源臂5’的400bpNot I/Bgl II片段证实这些克隆的5’端的重组。这个400bp探针识别12.0bk内源Spe I/Eco RV片段和靶等位基因的3.5kb片段，因为用新霉素盒导入的新Eco RV位点。
D.敲除小鼠的制备和基因型测定来自靶克隆的#22和#70的ES细胞显微注射到分离自雌性C57BL/6J(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)的胚泡阶段的胚胎。
鉴定对亍两个克隆的雄性嵌合体并与雌性DBA/1lacJ(The JacksonLaboratory)回交产生种系PGES2杂合(+/-)后代。用PCR对杂合动物是否存在新霉素基因进行基因型测定，使用引物组Neo-833F(5′gcaggatctcctgtcatctcacc 3′)(SEQ ID NO1)和Neo-1023R(5′gatgctcttcgtccagatcatcc 3′)(SEQ ID NO2)。这个引物组扩增PGES2靶等位基因的190bp片段。
纯合PGES2敲除小鼠(PGES2双敲除)产生于杂合交配(杂合×杂合)，观察到正常孟德尔比例。由PCR对来自杂合交配的动物进行基因型测定，使用两个寡核苷酸组，一组对靶等位基因特异(Neo PCR)，另一组对PGES2等位基因特异(没有敲除区域)。Neo PCR使用用于杂交筛选的相同引物组。PGES2 PCR的寡核苷酸是PGES2双敲除-409F(5′tcccaggtgttgggatttagacg 3′)(SEQ ID NO3)和PGES2双敲除-821R(5′taggtggctgtactgtttgttgc 3′)(SEQ ID NO4)。这些寡核苷酸扩增412bp的片段并包含在3.0kb敲除区域内。
因此，在确定基因型中时，野生型动物的PGES2 PCR将是阳性，NeoPCR是阴性。PGES2杂合动物的两种PCR都将是阳性，PGES2双敲除动物的PGES2PCR是阴性(因为两个等位基因都缺乏该区域)，Neo PCR是阳性(图2)。
雄性和雌性野生型和PGES2双敲除(对于每种性别和基因型n＝1)的最初病理组织学显示无可检测差异。PGES2双敲除小鼠和野生型小鼠的生育力之间也没有可检测差异。
E.PGES2/ApoE双敲除小鼠PGES2敲除小鼠和ApoE敲除小鼠(C57/BI6背景，Charles RiverLaboratories)交配产生PGES2/ApoE双敲除小鼠。产生PGES2+/-/ApoE-/-和PGES2-/-/ApoE-/-小鼠。
F.PGES2敲除ES细胞使用来自DBA/1LacJ细胞系(Roach等，Exp.Cell Res.221520-525，1995)的DBA-252小鼠ES细胞系。培养维持多能ES细胞，在丝裂霉素C处理的原代胚胎成纤维细胞(PEF)饲养层上，干细胞培养基(SCML)中，它含有去除D-MEM的基础培养基(ILTI，#10829-018)，并补充有15％ES细胞质量的胎牛血清(ILTI，#10439-024)，0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma Chemical，#M-7522)，0.2mM L-谷氨酰胺(ILTI，#25030-081)，0.1mM MEM非必需氨基酸(ILTI，#11140-050)，1000单位/ml重组小鼠白血病抑制因子和50μg/ml庆大霉素(ILTI，#15710-064)。
使用BTX电子细胞操纵器600(BTX，Inc.)，在260v电压、50μF电容和360欧姆电阻下，电穿孔含25μg线性化PGES2双敲除寻靶载体的400μl SCML中的1×107个DBA-252 ES细胞，如实施例B讨论。电穿孔后，细胞平铺于SCML中丝裂霉素C处理的PEF上，于四个100mm组织培养皿中。电穿孔二十四小时后，向SCML中添加175μg/ml G418和2μM gancyclovir起始阳性/阴性选择。寻靶序列同源重组到缺失了小鼠PGES2基因并插入了新霉素抗性基因的ES细胞基因中。G418选择7-9天后，用微量吸管挑出G418抗性克隆转到24孔组织培养皿的各个孔中并扩增为克隆ES细胞系。DNA印迹分析鉴定表明由同源重组实现基因寻靶的转化的ES细胞系。
PGES2靶(+/-)ES细胞克隆#22和#70用于产生PGES双敲除(-/-)ES细胞。融化该克隆并在PEF上，175μg/ml G418的SCML中维持2天，接着G418浓度增加到2mg/ml(Mortensen等，Mol.Cell.Biol.122391-95，1992)。在高G418选择7-10天后，分离存活的ES细胞克隆，并将2-5×105个细胞/ml平铺于新PEF上，在含2mg/ml G418的SCML中。高G418选择另外4-7天后，用微量吸管挑出抗性克隆并转移到不含PEF的含2mg/ml G418的SCML的24孔组织培养皿的各个孔中并扩增为克隆ES细胞系。DNA印迹分析鉴定表明野生型等位基因丧失的PGES2双敲除(-/-)ES细胞系。
G.来自PGES2双敲除ES细胞的巨噬细胞DBA-252 WT(+/+)和PGES双敲除(-/-)ES细胞克隆#22D，#22F和#70V用于发育体外分化(IVD)为巨噬细胞的ES细胞。WT和双敲除PGES2ES细胞克隆在不含PEF饲养细胞的SCML中维持。胚胎样小体(EB)形成前两天，所有ES细胞系转换到含Iscove′s MDM(ILTI，#31980-030)的基础培养基，其补充有15％ ES细胞质量的胎牛血清，0.2mM L-谷氨酰胺，0.1mM MEM非必需氨基酸，1000单位/ml重组小鼠白血病抑制因子，50μg/ml庆大霉素和0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma#M-7522)的I-SCML培养基中。
胚胎样小体阶段分开WT和双敲除ES细胞克隆并生长于悬浮培养，在细菌学100mm皿中MacEB培养基中，其含有Iscove′s MDM的基础培养基，补充了15％ES细胞质量的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，300μg转铁蛋白(ILTI，#13008-016)，50μg/ml L-抗坏血酸(SigmaChemical，#A-4403)，5％PFHM-II(ILTI，#12040-093)，4×10-4M一硫代甘油(MTG)，和50μg/ml庆大霉素。ES细胞在悬液中生长6天形成ES细胞聚集体。
巨噬细胞前体阶段第6天分开ES并平铺于含Mac I培养基的组织培养皿中，该培养基含有10％FBS(ILTI，#10439-024)，5％PFHM-II(ILTI，#12040-093)，2mM L-谷氨酰胺，3ng/ml M-CSF(Sigma#M-9170)，1ng/mlIL-3(PeproTech，Inc.，Rocky Hill，NJ，#213-13)和50μg/ml庆大霉素。当这个细胞群汇合后，巨噬细胞前体发育为非贴壁群并可以从第14天至第30天隔天收集。
来自ES细胞的巨噬细胞从培养基中离心收集巨噬细胞前体的非贴壁群。细胞沉淀重悬于Mac II培养基，其含有补充了10％FBS，5％PFHM-II，2mM L-谷氨酰胺，3ng/ml M-CSF，和50μg/ml庆大霉素基础培养基Iscove’s MDM。细胞平铺到组织培养皿或多孔皿上并在定性前培养1-5天。
挽救来自在源自PGES2敲除ES细胞的巨噬细胞中野生型表型观察到来自PGES2双敲除ES细胞克隆#22F的ES细胞IVD巨噬细胞与来自DBA-252 WT和PGES2+/-克隆#22 ES细胞的巨噬细胞相比，显示活力和生长特性降低。为了确定该表型是否PGES2产生的损失的结果，在分化过程的所有阶段以0.1，1.0或10μM的剂量向培养基中添加PGE2(Cayman Chemicals# 14010)。
来自PGES2敲除克隆#22F的，在不含PGE2下培养的巨噬细胞大约是野生型密度的一半。来自PGES2敲除克隆#22F，在0.1，或1.0μM PGE2中培养的巨噬细胞与野生型密度等同，来自PGES2敲除克隆22F，在100μM PGE2中培养的巨噬细胞大约是野生型密度的75％。
H.来自PGES2敲除ES细胞的巨噬细胞的特征来自PGES2敲除，PGES2杂合体和野生型ES细胞的ES细胞IVD巨噬细胞(ESM)，在分化第14-21天，以5×105个细胞/孔(96孔板)平铺于MacII(见实施例G)培养基中。细胞在37℃(5％CO2，95％湿度)生长过夜，接着在改变的条件下刺激1)ESM在所示浓度的脂多糖(LPS)(图3)(含1mg/ml LPS原液(E.coli 0111B4，Sigma Chemical)的磷酸缓冲盐水(PBS)，在细胞培养基中稀释达到目的终浓度，范围从0.001-100μg/ml)存在下培养24小时；2)ESM与100μM花生四烯酸(AA)(Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI)(含10mM AA原液的100％乙醇，在培养基中稀释达到终浓度)培养10分钟(图4)；3)ESM与钙离子载体A23187培养10分钟(Calbiochem，San Diego，CA)(100％DMSO中10μM)(图5)；和4)ESM在存在10μg/ml LPS的细胞培养基中培养24小时，随后与含100μM AA的细胞培养基中培养10分钟(图6)。
在每个培养期末，分离细胞上清并保存在-20℃直到进行PGE2试验。用ELISA检测药剂盒(Cayman Chemical)进行PGE2测定。所有样品稀释至在标准曲线的动力范围内产生信号。图3-6中每个图显示的数据是三个独立实验的代表，每个实验重复实施。
如图3所示，结果表现PGES2是负责炎症状况下(如LPS刺激)细胞外PGE2释放的关键PGE2合酶。然而，如图4，5和6所示，结果也表明这个PGES2基因的破坏不在更加剧烈的刺激情况(如花生四烯酸或钙离子载体(A23187)刺激)抑制ESM释放PGE2。这些结果表明PGES2是炎症期间产生PGE2的重要基因。
I.炎症模型中PGES2双敲除的特征在两个炎症实验模型-胶原诱导的关节炎(慢性炎症模型)和醋酸诱导的扭曲(急性炎症/疼痛模型)中描述了PGES2敲除小鼠的情况。所有实验对DBA1/lacJ遗传背景下繁殖的年龄/性别匹配的动物实施。这个遗传背景对胶原诱导的关节炎(CIA)最佳。通过估计抗体产生和迟发型过敏反应来描述PGES2敲除和野生型动物的免疫反应，进一步描述CIA的表型。总之，CIA结果和醋酸诱导扭曲模型显示PGES2在PGE2介导的慢性炎症、急性炎症和与神经病变检测相对的急性炎症疼痛检测中起作用。
胶原诱导的关节炎在第0天，用使用下列药剂醋酸(冰冷的)(Sigma Chemical，#33，882-6)，小鸡II型胶原(Chondrex，Redmond，WA，#20001-1)，结核分枝杆菌H37RA(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，#231，141)和弗氏不完全佐剂(Sigma Chemical，#F-5506)制备的胶原溶液和完全弗氏佐剂免疫小鼠。0.1M醋酸放置于-80℃冰箱中10分钟直到溶液变成融雪状。接着这个醋酸溶液的一部分(5ml)添加到10mg小鸡胶原瓶(2mg/ml)中，然后用箔包裹并置于4℃摇动过夜。随后，20ml弗氏不完全佐剂置于玻璃组织研磨机(50ml)中，添加40mg结核分枝杆菌(2mg/ml)并混合直到观察到均匀的悬液(即完全弗氏佐剂)。等体积的每种溶液混合大约15分钟直到难于混合。所有小鼠在它们尾巴根部去毛。在第0和20天，每个动物在它们尾巴根部的皮下给予0.1ml。
第20天进行第二次免疫。到第25天，小鼠开始出现关节炎的第一个迹象(关节红肿)。到第50天，平均关节炎分值达到最大。如图7-10所示，PGES2敲除小鼠关节炎的发病率和严重性减弱。野生型对照的严重性达到最大，关节炎分值与在第56天仅达到1.1±0.4分值的PGES2敲除动物相比是5.5±0.7(图7和9)。PGES2敲除组的发病率也显著减低(图8和10)。此外，组织学检查揭示与野生型相比，在胶原处理的PGES2敲除关节的关节表面无蛋白聚糖损失。
为了确定关节炎的差异是否PGES2敲除动物中缺乏抗体产生的结果，用ELISA确定抗II型胶原(抗原)的抗体水平，使用小鼠IgG型II胶原抗体ELISA药剂盒(Chondrex，Redmond，WA，#2031)，山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech，Birmingham，AL，#1031-05)，山羊抗小鼠IgG1-HRP(Southern Biotech，#1070-05)，山羊抗小鼠IgG2a-HRP(Southern Biotech，#1080-05)，和山羊抗小鼠IgG2b-HRP(SouthernBiotech，#1090-05)。
按照试剂盒提供的规程，除了第二步。使用稀释于第二稀释缓冲液(Chondrex药剂盒的C溶液)的HRP缀合的同种型特异性抗体代替使用冷干的抗IgG抗体。
野生型和PGES2敲除动物都产生显著水平的抗II型胶原的IgG1、IgG2a和总IgG抗体。来自两个基因型的小鼠间的抗体产生没有可检测差异提示关节炎的差异不是由于PGES2敲除动物不能对这个特殊抗原产生免疫反应。
为了确定野生型和PGES2敲除小鼠关节炎的严重性和发病率差异的机制，在接受类似胶原免疫方案的动物中引起迟发型过敏(DTH)反应。在第0天，小鼠在尾巴根部接受注射。第17天，10μg(15μl)胶原注射到右爪的背侧区。每个动物的左爪用作对照并在相同部位接受15μl盐水。第18天，使用器官充满度测量器确定爪厚度。野生型小鼠的胶原处理爪比对侧盐水处理爪发生更加明显的肿胀。水肿与白细胞浸润有关，如组织病理学所分析确定的。PGES2敲除小鼠的胶原处理爪的水肿形成与野生型或PGES2敲除动物的盐水处理爪类似(图11)。这个不足伴发有注射部位白细胞浸润数量明显降低，与PGES2在炎症中的作用一致。
此外，分析从PGES2敲除和野生型小鼠分离的血液的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜曙红细胞数。健康和患病动物之间没有观察到可检测差异，这表明总免疫缺陷不能引起CIA模型所观察到的PGES2敲除表型。
醋酸诱导的扭曲载体(0.5％(w/w)甲基纤维素，Sigma Chemical，#M0512)或10mg/kg吡罗昔康(Sigma Chemical，#P5654)口服随机给予小鼠。一个小时后，腹膜内给予16μl/g体重0.7％醋酸。小鼠置于5个区室的盒子中，醋酸注射后，计伸展数量20分钟。
表现PGES2敲除小鼠与野生型小鼠相比疼痛反应减轻(图12)。吡罗昔康处理降低野生型小鼠的反应，但对PGES2敲除小鼠没有作用。
也描述炎症性前列腺素6-酮PGF1α(PG12的稳定代谢物)和PGE2的体内水平。注射醋酸溶液引起两种前列腺素高于基线水平的明显升高。不考虑治疗，在任何一个基因型中，没有记录到6-酮PGF1α的可检测差异。相比之下，PGES2敲除组的PGE2水平与野生型动物相比降低52％，与PGES2敲除动物观察到的扭曲反应减轻一致。
为了进一步描述PGES2抑制/破坏调节疼痛反应如在脊柱和脊柱上水平疼痛的能力，热平板实验测定PGES2敲除和野生型动物的退缩潜伏期。在52.5℃，55.5℃或58.5℃下测定反应没有差异。
序列表<110>Pfizer Products Inc.
<120>前列腺素E合酶2基因的破坏<130>PC23078A<150>60/405652<151>2002-08-22<150>60/337,431<151>2001-11-30<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>小家鼠
<400>1gcaggatctc ctgtcatctc acc 23<210>2<211>23<212>DNA<213>小家鼠<400>2gatgctcttc gtccagatca tcc 23<210>3<211>23<212>DNA<213>小家鼠<400>3tcccaggtgt tgggatttag acg 23<210>4<211>23<212>DNA<213>小家鼠<400>4
taggtggctg tactgtttgt tgc 2权利要求
1.一种遗传修饰的非人哺乳动物，其中该修饰导致破坏的PGES2基因。
2.权利要求1的哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠。
3.权利要求1的哺乳动物，其中所述哺乳动物进一步包含破坏的ApoE基因。
4.一种遗传修饰的动物细胞，其中该修饰包含破坏的PGES2基因。
5.权利要求4的动物细胞，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞或ES样细胞。
6.权利要求4的动物细胞，其中所述细胞是ES细胞衍生的巨噬细胞。
7.权利要求4的动物细胞，其中所述细胞分离自含有产生破坏的PGES2基因的修饰的遗传修饰的非人哺乳动物。
8.权利要求4的动物细胞，其中所述细胞在补充有PGE2的培养基中被利用。
9.一种治疗炎症介导疾病的方法，所述方法包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。
10.权利要求9的方法，其中所述药剂以足以减轻关节炎症、降低白细胞浸润、减少关节接合表面蛋白聚糖损失，和/或减轻炎症疼痛检测的量给予。
全文摘要
本发明涉及含有被破坏的前列腺素E合酶2基因遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞，以及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。
文档编号C12N15/09GK1592576SQ02822937
公开日2005年3月9日 申请日期2002年11月8日 优先权日2001年11月30日
发明者L·P·奥德利, J·E·汉伯, M·L·罗奇, J·L·斯托克, O·L·弗兰克尼, M·哈吉帕森德 申请人:辉瑞产品公司