专利名称：使用绒毡层特异的锌指转录因子使花粉受育性降低的方法
技术领域：
本发明涉及在雄蕊花药中特异表达的基因及其应用。本发明特别涉及在花药的绒毡层中特异表达的来自矮牵牛花的锌指型转录因子(ZPT3-2)基因及其应用。
背景技术：
花粉的受育性在农业和园艺的各个方面都是个问题。例如在杂交育种的交配时为了避免自花授粉，要使用很多劳力进行除雄(除去雄蕊)作业。在种苗产业中，为了将杂交育种得到的优良品种在商业上进行保护，需要没有花粉受育性的性状。从这样的要求出发，迫切需要控制花粉受育性的技术(pollination control)。以往，特定的作物进行杂交育种时一直使用细胞质雄性不育系，并获得了一定的成功。然而细胞质不育性状在很多场合下伴随着抗病性低下等不希望有的副作用，另外还存在着性状不稳定、种子的大量生产困难等问题。虽然也研究了通过化学药品处理使受育性降低的方法，但安全性评价和作用机制的阐明还很缓慢，没有达到实用化程度。因此，需要利用基因工程的优良雄性不育技术。
绒毡层位于花药壁的最里层，是包围造孢细胞(花粉细胞)的组织。绒毡层的作用对花粉的发育是必需的，不仅仅是作为花粉细胞的支撑体，而且还涉及花粉发育所必需的营养的供给、包含四分体(tetrad)的胼胝质层的分解、构成花粉细胞表面的外壁层等的化合物的供给等多方面的作用。花药的发育分为以下各个阶段，造孢细胞减数分裂后的四分体期、四分体的小孢子释放期、花粉细胞的扩大和空泡形成为特征的单核期，经有丝分裂向营养细胞和生殖细胞分化的有丝细胞分裂期，以及随后的双核期。通过这些阶段，花药最终开裂，释放出成熟的花粉粒。已知在以上发育过程中，绒毡层的功能的一部分受到损伤时，多数情况下将导致正常花粉的发育受到抑制、失去花粉受育性。
如上所述，人们对于通过基因工程使雄性不育的技术寄予了很大的希望。特别是利用在象绒毡层那样的不暴露在外部的小区域特异表达的基因，不仅不会赋予植物不好的性状，而且有可能做到雄性不育。绒毡层特异的启动子和包含启动子的使雄性不育的基因构建物的例子已有几个报道(Shivanna和Sawhney编，Pollen biotechnology for cropproduction and improvement(Cambrigge University Press)pp.237-257，1997)。然而人们仍然期待着表达的组织特异性和时期特异性高、对花粉受育性控制有用的新的基因的出现。
本发明人等最近对来自矮牵牛花的新型转录因子、含有PEThyZPT3-2(以下，略作ZPT3-2)的7个锌指(ZF)型转录因子的cDNA序列进行了确定。Northern blot分析结果显示，各个转录因子在花药发育不同阶段表现出对花药特异性的瞬时表达(Kobayashi等，PlantJ.13571，1998)。然而对这些转录因子在植物中的生理功能和作用、以及转录因子编码基因的正确表达部位和其表达调控机制还不是很清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供利用对以雄性不育为代表的植物性状的改变有用的、花药的组织特异性基因的基因工程技术。
本发明人将以前从矮牵牛花分离出的编码花药特异性转录因子之一的基因再导入了矮牵牛。结果发现导入基因通过抑制内源性基因的表达阻碍了花粉的正常发育，花粉的受育性显著下降。另外本发明人等从ZPT3-2的基因组基因分离出上游区，研究了其启动子活性的组织特异性。结果发现在从四分体期到单核期的绒毡层中，启动子活性表现出组织和时期特异性。本发明是根据这些认识完成的。
本发明的第一个方面是制作雄性不育植物的方法，涉及包括以下步骤的方法提供含有(i)具有序列号1所示的碱基序列中第1位到第1886位序列的DNA、(ii)在严格条件下与具有(i)的碱基序列的DNA杂交并编码控制花粉发育的转录因子的DNA、或(iii)(i)或(ii)的DNA片段中任一DNA的核酸，和与上述核酸有效连接的启动子的植物表达序列组合的步骤；提供具有控制花粉发育的内源性转录因子的植物细胞的步骤，其中，编码内源性转录因子的基因在严格条件下与上述核酸杂交；将表达序列组合导入植物细胞的步骤；导入了表达序列组合的植物细胞再生为植物体的步骤；以及对于再生的植物体，通过表达上述核酸筛选内源性转录因子的表达被抑制的植物体的步骤。本发明的上述方法可作为赋予植物雄性不育性的方法加以利用。
在一种实施方式中，上述核酸相对于上述启动子正向连接，在上述植物细胞内可按照有义方向进行转录。
在一种实施方式中，上述核酸相对于上述启动子反向连接，在上述植物细胞内可按照反义方向进行转录。
在一种实施方式中，上述植物是双子叶植物。双子叶植物优选茄科植物，更优选矮牵牛属植物。
在一种实施方式中，上述表达序列组合被整合到植物表达载体中。
本发明第一个方面还提供通过上述任一所述的方法制作的雄性不育性植物。
本发明的第二个方面是制作雄性不育植物的方法，涉及包括以下步骤的方法提供包含含有(a)具有序列号3所示的碱基序列中第1位到第1991位序列的DNA、或(b)具有(a)的一部分序列并表现出花药的绒毡层特异性启动子活性的DNA中任一DNA的启动子，和与上述启动子有效连接的异源基因的植物表达序列组合的步骤；将表达序列组合导入植物细胞的步骤；以及使导入了表达序列组合的植物细胞再生为植物体的步骤。本发明的上述方法可作为赋予植物雄性不育性的方法加以利用。
在一种实施方式中，上述植物是双子叶植物。双子叶植物优选茄科植物，更优选矮牵牛属植物。
在一种实施方式中，上述表达序列组合被整合到植物表达载体中。
本发明的第二个方面还可提供通过上述任一项所述的方法制作的雄性不育性植物。
本发明的第三个方面涉及包含以下(I)或(II)的DNA的启动子(I)具有序列号3所示的碱基序列中第1位到第1991位序列的DNA；或(II)具有(I)的一部分序列，表现出对花药的绒毡层特异性启动子活性的DNA。
本发明的第四个方面涉及包含上述启动子和与上述启动子有效连接的异源基因的、对赋予植物雄性不育性有用的植物表达序列组合。
附图的简单说明
图1给出了ZPT3-2编码基因(以下，也略作ZPT3-2)的cDNA序列及其对应的氨基酸序列。用下划线标出了3个锌指基序以及DLNL序列(氨基酸411位～425位)。
图2是表达ZPT3-2cDNA序列的植物表达载体(pBIN-35S-ZPT3-2)结构的概略图。
图3是表示ZPT3-2基因编码区的上游序列的图。粗箭头表示转录起始位点(1721位)，下划线表示翻译起始密码(ATG)。
图4是用于解析ZPT3-2cDNA基因的启动子的植物表达载体(pBIN-ZPT3-2-GUS)结构的概略图。
图5是对野生型矮牵牛花的花粉和导入pBIN-35S-ZPT3-2的矮牵牛花的花粉进行拍摄，并表现生物形态的照片(放大倍数为240)。所有花粉都进行了黄酮醇染色。图5(a)～(d)表示野生型矮牵牛花的花蕾在不同生长阶段的花粉，图5(e)～(h)表示转化矮牵牛花的花蕾在不同生长阶段的花粉。图5(a)和(e)是花蕾大小为5mm的花粉，图5(b)和(f)是花蕾大小为35mm的花粉，图5(c)和(g)是花蕾大小为50mm的花粉，图5(d)和(h)是成熟期的花粉。
图6是对导入pBIN-ZPT3-2-GUS的矮牵牛花进行GUS染色的花的器官进行拍摄，并表现生物形态的照片。以花药处于四分体期的花(花蕾)为拍摄对象。图6(a)是放大倍数为2.5的花蕾的外观照片，图(b)表示花药在低倍数(60)时的截面图，图6(c)表示花药绒毡层周边在高倍数(280倍)时的截面图。
实施发明的最佳方式以下进一步详细地对本发明进行说明。
(来自ZPT3-2基因的转录因子)本发明第一个方面的制作雄性不育性植物的方法中有用的核酸是(i)具有序列号1所示的碱基序列中第1位到第1886位序列的DNA，(ii)在严格条件下与具有(i)的碱基序列的DNA杂交，并编码控制花粉发育的转录因子的DNA，或(iii)(i)或(ii)中的任一DNA片段。本发明中上述核酸优选(i)的DNA，即，优选编码ZPT3-2的DNA或其片段，更优选(i)的DNA。
本说明书中的“转录因子”是指与基因调控区的DNA结合并控制mRNA合成的蛋白质。已知某一种转录因子是在其DNA结合结构域中具有称之为锌指基序的保守性高的氨基酸序列。ZPT3-2是Cys2/His2型(EPF家族)的锌指蛋白质，是在由444个氨基酸构成的全长氨基酸序列内含有3个锌指基序，另外还含有称之为DLNL序列的疏水区的转录因子(Kobayashi等，同上)。图1同时给出了编码ZPT3-2的cDNA序列(序列号1)以及对应的推测氨基酸序列(序列号2)。
在本说明书中核酸或DNA的“片段”是指导入植物体并以适当方式表达时，能抑制该植物内源性转录因子表达的片段。该片段可以是从上述(i)或(ii)的DNA的编码锌指基序区以外选择，并具有至少约40个碱基对以上长度，优选约50个碱基对以上长度，更优选约70个碱基对以上长度、进而优选约100个碱基对以上长度。
在本说明书中，所谓用于杂交的“严格条件”是指使特定的碱基序列(例如，来自矮牵牛花的编码ZPT3-2的DNA)和与该序列同源性高的其它碱基序列(例如，存在于矮牵牛花以外植物的编码ZPT3-2类似物的DNA)形成聚核苷酸双链所需要的充分条件。作为适用于本发明的严格条件的代表性例子，例如以下条件。在含有1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、32P标记探针DNA(1×107cpm)和50μg/ml鲑精DNA的溶液中，于60℃杂交16小时后，用2×SSC/1％SDS于60℃洗30分钟，反复2次。
在本发明中，为了分离编码ZPT3-2的DNA、以及在严格条件下与它杂交并编码控制花粉发育的转录因子的DNA，可以使用与公知的转录因子基因编码的氨基酸序列的保守区相对应的简并引物对。使用该引物对，以植物的cDNA或基因组DNA作为模板进行PCR，然后以得到的扩增DNA片段作为探针，可以筛选同一植物的cDNA文库或基因文库。作为这种引物对的例子，如5’-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3’(序列号4)和3’-RTGNCCNCCNARNGCYTG-5’(序列号5)的组合(这里，N是次黄嘌呤核苷，R为G或A，而Y为C或T)。上述引物序列分别对应包含在ZPT3-2的锌指基序中的氨基酸序列QALGGH。
因此，适用于本发明的严格杂交条件也可作为PCR的条件，代表性例子中可以使用上述简并引物(序列号4和5)。此时的PCR反应条件为于94℃变性5分钟后，一循环94℃30秒，50℃30秒，然后72℃1分钟共进行30个循环，最后于72℃温育7分钟。
PCR按照市售的试剂盒和仪器制造厂家的指导进行，或按照业内人士已知的方法进行。基因文库的制作方法以及基因的克隆方法等也都是业内人士已知的方法。例如可参照Sambrook等《分子克隆 实验指南》第二版(冷泉港实验室，1989)的方法。得到的基因的碱基序列可以利用该领域内公知的核苷酸序列解析法或市售的自动测序仪确定。
在本说明书中，所谓转录因子“控制花粉的发育”主要是指该转录因子的表达受到抑制时，在花粉的形态或功能方面可观察到明显的变化。本发明中的转录因子主要是通过抑制编码该转录因子的基因的表达，使约60％以上，优选使约75％以上，更优选使约90％以上的花粉细胞在成熟之前死亡。这里，抑制转录因子的表达是指通过Northern blot法测定时，与野生型的对照植物相比，mRNA的量约为十分之一以下。
通过上述筛选而分离、鉴定的基因所编码的转录因子(即，ZPT3-2和ZPT3-2类似物)对于花粉发育的控制情况，可根据本说明书的内容制作转化植物，并通过对该花粉的发育特性进行观察来加以确认。
利用本发明中编码控制花粉发育的转录因子的DNA或其片段，可以抑制植物细胞中含有与该DNA同一或相同碱基序列的内源性基因的表达。这种靶内源性基因也可以是控制花粉发育的转录因子。按照本发明的方法，最好是不抑制控制花粉发育的内源性转录因子以外的基因的表达，而只是通过有选择地抑制内源性转录因子的表达，赋予植物雄性不育性。
即，本发明的表达抑制技术适用的植物细胞是具有控制花粉发育的内源性转录因子的植物细胞，编码该内源性转录因子的基因规定为在严格条件下与上述ZPT3-2或ZPT3-2类似物杂交的基因。这里“严格条件”的定义是与ZPT3-2类似物鉴定有关的上述条件相同的条件。虽没有限定本发明范围的意思，但通过上述方法可赋予雄性不育性的植物希望是与分离出ZPT3-2的矮牵牛花、或分离出编码ZPT3-2类似物的基因的植物在进化系统学上近缘的植物。这里，进化系统学上近缘主要是指分在同一目中，优选分在同一科的，更优选分在同一属的，最优选是分在同一种的植物。另外，花药的最里层存在绒毡层并对花粉的发育起着不可缺少的作用，由于是大部分种子植物中普遍的事实，所以如果考虑到这一点，起着与ZPT3-2相同或类似功能的转录因子广泛地存在于其它植物中也容易被理解。
作为用于抑制内源性基因表达的方法，代表性的可以利用共抑制和反义技术。共抑制是指在将重组基因导入植物细胞时，抑制该基因本身以及含有与该基因一部分相同的序列的内源性基因两者的表达。利用共抑制时，本发明的表达序列组合包含相对于启动子以正向连接形式连接的编码转录因子的DNA或其片段。编码转录因子的DNA或其片段以表达序列组合形式导入植物细胞后，在启动子的控制下按照有义方向转录。通过该导入DNA的作用，有可能抑制所期望的基因的表达。共抑制可以在转化植物的一部分个体中观察到，而在其它个体中往往不能充分起作用。因此，通常按照意愿方式对基因表达进行抑制的个体可以通过惯用程序进行筛选。
反义技术是指在将重组基因导入植物细胞时，导入基因的转录产物(mRNA)与内源性基因的转录产物(mRNA)的互补序列形成杂交体，并抑制内源性基因编码的蛋白质的翻译。利用反义技术时，本发明的表达序列组合包含相对于启动子以反向连接形式连接的编码转录因子的DNA或其片段。将编码转录因子的DNA或其片段作为表达序列组合导入植物细胞后，在启动子的控制下按照反义方向转录。通过该反义转录产物的作用有可能抑制目的基因的表达。
(来自ZPT3-2基因的启动子)本发明第二个方面，即制作性状改变的植物的方法中有用的启动子是具有(a)序列号3所示的碱基序列中第1位到第1991位序列的DNA，或(b)具有(a)的一部分序列，并表现出对花药绒毡层特异的启动子活性的任一DNA的启动子。在本发明的上述启动子中，优选(a)的启动子，即ZPT3-2基因的启动子。
除去ZPT3-2基因启动子区的对组织特异性表达活性非必需的序列后得到的、对绒毡层具有特异的启动子活性的序列属于本发明的范围内。这样的序列按照常规方法通过启动子的缺失实验获得。简单地讲，使用ZPT3-2基因启动子区的各种各样缺失突变体(例如，使ZPT3-2基因启动子区从5’上游一侧缺失不同长度的突变体)与适当的报告基因(例如GUS基因)融合的质粒，并通过测定缺失突变体的组织特异的启动子活性，可以鉴定对其活性所必需的区域。
一旦鉴定出对启动子活性必需的区域，还可改变其区域内的序列或相邻序列，进而提高启动子表达活性的程度。这样获得的突变体只要对绒毡层表现出特异的启动子活性，也都属于本发明的范围。
在本发明中，“对绒毡层表现出特异的启动子活性”是指启动子在天然植物中或以与任意结构基因连接的表达序列组合形式导入植物时，通过起始DNA的转录在绒毡层特异地表现出指导基因表达的能力。这里，“特异的”是指与同一植物体的花的其它所有组织(包括花粉、花丝、花柱、花头、花瓣、花萼等)相比启动子的表达活性更高。上述特异的启动子优选在绒毡层的表达活性比同一植物体的花的其它所有组织和花以外的部分(根、叶、茎等)更高，更优选在同一植物体的花的其它所有组织和花以外的部分实质上不表现活性。表达活性的程度按照常规方法通过比较启动子在绒毡层中的表达水平和同一启动子在花的其它组织的表达水平进行评价。启动子的表达水平通常是由在该启动子的调控下表达的基因产物的产量来进行确定。
利用上述特异的启动子赋予植物雄性不育性的过程，通过与本发明启动子有效连接的任意异源基因在导入该基因的转化植物中，于启动子的调控下在绒毡层进行特异表达来实现。已知许多组织特异性启动子的组织特异性超越种属被保存下来，所以也可以认为本发明的启动子适用于范围广泛的植物种属。
本发明的启动子，例如可以将公知的cDNA用作探针，对植物基因组文库进行筛选，并通过从与之相对应的基因组克隆中分离出编码区上游序列获得。作为cDNA，例如来自上述矮牵牛花的转录因子ZPT3-2的cDNA。
本发明中的启动子并没有限定在天然分离的启动子，也包括合成的多核苷酸。合成多核苷酸，例如可以通过业内人士已知的手法合成或改变象上述那样序列确定的启动子序列或其活性区域来获得。(表达序列组合和表达载体的构建)编码本发明转录因子的DNA可以利用业内人士公知的方法做成与适当启动子有效连接的表达序列组合，然后利用公知的基因重组技术导入植物细胞。同样，本发明的绒毡层特异的启动子能够以与所希望的异源基因有效连接的表达序列组合形式导入植物细胞。
可与上述转录因子连接的“启动子”是指在植物中进行表达的任意启动子，也包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子中的任一种。
“组成型启动子”是指与植物细胞内外的刺激无关以一定水平表达结构基因的启动子。在植物的其它组织或器官表达异源基因不会给植物带来不良性状时，使用组成型启动子比较简便，也比较理想。作为组成型启动子的例子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(P35S)、以及胭脂氨酸合成酶的启动子(Tnos)，但不限定于这些启动子。
“组织特异性启动子”在本发明中是指至少在包括绒毡层在内的花药的组织中使结构基因特异表达的启动子。在这样的组织特异性启动子中，除了来自本发明ZPT3-2基因的启动子，也包括表现出花药特异表达活性的其它公知启动子。因此，将含有绒毡层特异启动子和编码转录因子的序列的、天然ZPT3-2基因的表达序列组合本身，根据需要与其它的调节元件组合使用也包括在本发明的范围内。
“诱导型启动子”是指给予化学试剂、物理应力等特定刺激时使结构基因表达，而无刺激时不表现表达活性的启动子。作为诱导型启动子的例子，例如可用植物生长素诱导的谷胱甘肽S-转移酶(GST)启动子(van der Kop，D.A.等，Plant Mol.Biol，39979，1999)，但并不限定于此。
在本说明书中，用语“表达序列组合”或“植物表达序列组合”是指含有编码本发明转录因子的DNA和与该DNA有效连接(即，可以控制该DNA的表达)的植物表达启动子的核酸序列，以及含有本发明的绒毡层特异启动子和与启动子有效连接(即，符合读框的)的异源基因的核酸序列。
可与上述绒毡层特异启动子连接的“异源基因”是指ZPT3-2基因以外的矮牵牛花中的内源性基因，或者是矮牵牛花以外植物中的内源性基因，或是相对于植物来说是异源基因(如来自动物、昆虫、细菌和真菌的基因)、且其基因产物的表达是绒毡层所希望的任意基因。本发明中的异源基因的优选例子是编码的基因产物表现出细胞毒性且通过它的表达抑制花粉发育的基因。作为这样的基因的具体例子，如barnase基因(Beals，T.P.和Goldberg，R.B.，Plant Cell 91527，1997)，但不限定于此例。
“植物表达载体”是指除了含有表达序列组合外，还以在宿主植物细胞中可发挥作用的形式连接了各种调节元件的核酸序列。这样的表达载体优选含有终止子、抗药基因和增强子。植物表达载体的类型以及使用的调节元件的种类可按照宿主细胞的不同进行变化，这是业内人士已知的事情。本发明使用的植物表达载体还可以含有T-DNA区。特别是在用土壤杆菌对植物进行转化时，T-DNA区可以提高基因的导入效率。
“终止子”位于基因的蛋白质编码区的下游，是参与DNA转录为mRNA时的转录终止，以及附加多聚A序列的序列。已知终止子对mRNA稳定性有贡献，而且还影响基因的表达量。作为终止子的例子，如胭脂氨酸合成酶的终止子(Tnos)，和花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S终止子，但并不限定于这些例子。
“抗药性基因”是使得转化植物的筛选更容易进行的基因。优选应用可赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，以及可赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因等，但本发明并不限定于这些基因。
本发明的植物表达载体可以使用业内人士公知的基因重组技术制作。在植物表达载体的构建中，例如可以优选使用pBI系列的载体或pUC系列的载体，但不限定于这些载体。
(转化植物的制作)象上述那样构建的表达序列组合或含有表达序列组合的载体，可用公知的基因重组技术导入目的植物细胞。导入的表达序列组合整合在植物细胞中的DNA。这里，植物细胞中的DNA不仅包括染色体DNA，也包括植物细胞中各种器官(如线粒体、叶绿体)中含有的DNA。
在本说明书中，用语“植物”既包括单子叶植物，也包括双子叶植物。优选的植物是双子叶植物。双子叶植物可以包括原始花被亚纲和合瓣花亚纲中任意一种。优选的亚纲是合瓣花亚纲。合瓣花亚纲包括以下各个目龙胆目、茄目、紫苏目、朱樱花目、车前目、风铃草目、玄参目、茜草目、川续断目和紫菀目。优选的目是茄目。茄目包括茄科、田基麻科、花葱科、菟丝子亚科和旋花科中的任意一种。优选的科是茄科。茄科包括矮牵牛属、曼陀罗属、烟草属、茄属、番茄属、辣椒属、酸浆属、枸杞属等。优选的属是矮牵牛属、曼陀罗属和烟草属，更优选的属是矮牵牛属。矮牵牛属包括P.hybrida种、P.axillaries种、P.inflata种和P.violacea种等。优选的种是P.hybrida种。只要不特别说明，“植物”是指从带有花的植物体和植物体得到的种子。
作为“植物细胞”的例子，如花、叶和根等植物器官中各个组织的细胞、愈伤组织以及悬浮培养细胞。
在将植物表达载体导入植物细胞时，可以使用业内认识公知的方法，例如借助于土壤杆菌的方法以及直接导入细胞的方法。作为借助于土壤杆菌的方法，如可以使用Nagel等人的方法(FEMS Microbiol.Lett.，67325(1990))。该方法是首先用植物表达载体(例如，通过电穿孔)转化土壤杆菌，然后通过leaf disk法等已知的方法将被转化的土壤杆菌导入植物细胞的方法。作为直接将植物表达载体等导入细胞的方法，例如电穿孔法、土壤杆菌法、磷酸钙法和聚乙二醇法等。这些方法在该领域内是已知的，适于转化植物的方法可由操作者适宜选择。
导入了植物表达载体的细胞例如能够以卡那霉素抗性等抗药性作为标准进行筛选。筛选出的细胞可以通过常规方法再生成植物体。
导入的植物表达载体是否能在再生的植物体中起作用，可以利用业内人士公知的手法加以确认。例如，以抑制内源性基因的表达为目的时，可通过利用Northern blot解析的转录水平测定进行确认。这样就可以筛选出内源性转录因子表达受到抑制的目的转化植物体。在利用组织特异性启动子表达异源基因时，通常也可以从靶组织提取RNA作为样品，并通过Northern blot解析对异源基因的表达加以确认。
通过本发明的方法抑制内源性转录因子的表达以及降低花粉的受育性，例如可以用含有编码转录因子的DNA的表达载体转化后，将得到的植物的花粉形态根据需要进行组织化学染色，然后进行显微镜观察来确认。
另外，通过本发明的方法使启动子在绒毡层特异表达，例如可以用启动子与GUS基因有效连接的表达载体转化植物，对于转化所得植物的花药组织中GUS活性的分布，通过常规方法进行组织化学染色来确认。
实施例以下根据实施例对本发明进行说明。本发明的范围并不限定在实施例。实施例中使用的限制酶、质粒等可以由商业供给源获得。
实施例1含有编码ZPT3-2的多核苷酸的植物表达载体的构建将以前报道的花药特异性ZF基因(Kobayashi等，同前)中的PEThyZPT3-2(ZPT3-2)的cDNA连接在花椰菜花叶病毒的35S启动子下游，做成植物表达载体。
具体来说，将质粒pBI221(从CLONTECH Laboratories Inc.购入)中含有花椰菜花叶病毒35S启动子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)和含有NOS终止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)依次插入到质粒pUCAP(van Engelen，F.A.等，Transgenic Res.，4288，1995)的多克隆位点，制作pUCAP35S。另外，将含有ZPT3-2 cDNA的pBluescript载体在KpnI位点和SacI位点(均为载体中的位点)切断，插入到上述pUCAP35S的KpnI位点和SacI位点之间。然后，将该重组质粒用EcoRI和HindIII酶切，将编码ZPT3-2的DNA片段导入双载体pBINPLUS(vanEngelen，F.A.等，同前)的EcoRI和HindIII位点之间。构建的ZPT3-2基因如图2所示，由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子区(P35S；0.9kb)、编码本发明ZPT3-2的多核苷酸(ZPT3-2；约1.9kb)、以及胭脂氨酸合成酶的终止子区(Tnos；0.3kb)构成。图2中的Pnos表示胭脂氨酸合成酶的启动子区，而NPTII表示新霉素磷酸转移酶II基因。
实施例2ZPT3-2启动子区的分离以及与GUS报告基因的连接以ZPT3-2的cDNA作为探针，从矮牵牛花基因组DNA文库中分离出对应的基因组克隆，对转录起始点上游的DNA片段(启动子区；约2.0kb)进行亚克隆。将该DNA片段连接在GUS报告基因的上游，克隆于双载体。
具体来说，通过常规的随机引物法(Sambrook等，同前)用[α-32P]dCTP对ZPT3-2的cDNA进行标记，制作放射性标记探针，用该探针对在EMBL3载体(Stratagene生产)中制作的矮牵牛花(Petuniahabrida var.Mitchell)的基因组文库进行筛选。将得到的克隆中含有基因上游区的约2.0kb基因组DNA片段亚克隆于pBluescriptSK载体的EcoRI位点(pBS-ZPT3-2-E)，确定碱基序列(图3)。然后，将含有SalI识别序列的连接DNA插入到ZPT3-2基因上游序列中的BglII位点(碱基号2006)，导入SalI位点(碱基号2016)。然后，将经EcoRI和SalI酶切得到的DNA片段插入到pUCAPGUSNT的GUS编码区上游(pUCAP-ZPT3-2-GUSNT)。由此，在ZPT3-2基因编码区的N末端附近区域按照阅读框架与GUS编码区相连。然后，将pUCAP-ZPT3-2-GUSNT经EcoRI和HindIII酶切得到的DNA片段(含有ZPT3-2启动子、GUS编码区和NOS终止子)插入到pBINPLUS载体中，得到pBIN-ZPT3-2-GUS(图4)。
实施例3各融合基因向矮牵牛花细胞的导入将上述各表达载体按照以下顺序，通过土壤杆菌导入矮牵牛(Petuniahybrida var.Mitchell)。
(1)将根癌土壤杆菌LBA4404株(从CLONTECH Laboratories Inc.购入)在含有250mg/ml的链霉素和50mg/ml的利福平的L培养基中于28℃进行培养。按照Nagel等(同前)的方法制备细胞悬浮液，利用电穿孔将实施例1和2中构建的质粒载体导入上述菌株。
(2)利用以下方法将编码各个融合基因的多核苷酸导入矮牵牛花细胞。将上述(1)中得到的根癌土壤杆菌LBA4404株在YEB培养基(《DNA克隆》第2卷、78页、Glover D.M.编IRL Press、1985)中进行振荡培养(28℃、200rpm)。将得到的培养液用灭菌水稀释20倍，与矮牵牛花(Petunia hybrida var.Mitchell)的叶片一起培养。2～3天后，用含有抗生素的培养基除去上述细菌，每隔2周用选择培养基进行传代，根据是否具有将上述2种融合基因一起导入的pBINPLUS的NPTII基因表达产生的卡那霉素抗性，筛选转化的矮牵牛花细胞。筛选出的细胞通过常规方法诱导愈伤组织后，再分化为植物体(Jorgensen R.A.等，PlantMol.Biol.，31957，1996)。
实施例4导入ZPT3-2基因后转化矮牵牛花的表型利用导入实施例1的载体得到的转化体，通过ZPT3-2的表达量的测定和对花粉形态的观察，研究ZPT3-2 cDNA的导入对植物产生的作用和效果。
具体来说，在35S启动子调控下导入ZPT3-2 cDNA的转化体(15个)通过Norther blot解析筛选出由于共抑制导致基因表达被抑制的个体(4个)。Norther blot解析的条件如下7％SDS、50％甲酰胺、5×SSC、2％封闭试剂(Boehringer Mannheim生产)、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.1％月桂基肌氨酸钠、50μg/ml酵母tRNA和32P标记探针DNA(1×107cpm)的溶液中，于68℃杂交16小时后，用2×SSC/0.1％SDS于68℃洗30分钟。
在上述4个共抑制转化体中，可观察到约90％的花粉细胞在成熟之前就死掉了。按照常规方法进行黄酮醇染色，结果在这些转化体的破裂细胞中几乎没有检测出应当包含在花粉细胞表面外壁层的黄酮醇(图5转化植物的花粉的照片中，蓝白色不规则形状的粒子是破裂的细胞)。
从上述观察结果可以推测，在基因表达受到抑制的转化体的花粉细胞中，由于外壁层的蓄积异常导致细胞壁发育不全，对渗透压敏感的细胞破裂了。四分体之前，花粉细胞的发育与正常植物之间没有什么差别。花粉出现异常时期、与外壁层蓄积时期及ZPT3-2基因正常表达时期非常吻合，这些现象支持上述作用机制。基因表达受到抑制的转化体中，花粉以外的性状没有产生变化。而在过表达ZPT3-2基因的个体中，花粉以及其它性状都没有产生变化。
如上所述，通过导入编码ZPT3-2的基因，可以高效抑制花粉的发育，使受育性丧失。通过最优化导入基因时所用的启动子，该效率可以进一步提高。例如，替代实施例1载体中所用的单一CaMV35S启动子，可以利用将2个CaMV35S启动子串联起来并使活性提高的启动子(即，E2启动子)等。另外，ZPT3-2基因的导入，其效果对花粉是特异的，而对植物的其它性状没有影响，因此可用作选择性的性状改变技术。
实施例5ZPT3-2启动子活性的组织特异性利用导入实施例2载体得到的转化体，通过GUS活性进行组织化学染色，检测上述DNA片段具有的组织特异启动子活性。
具体来说，利用导入ZPT3-2基因上游区和GUS的融合基因得到的转化体的花，以X-GUS为底物，研究GUS活性的分布(Gallagher，S.R.编、GUS protocolsusing the GUS gene as a reporter of gene expressin、Academic Press，Inc.pp.103-114，1992)。其结果，在花药的绒毡层中特异地检测出GUS活性(图6)。表达的时期是瞬时的，活性峰出现时期与花粉细胞减数分裂刚结束后的四分体期大致相当。由此可知ZPT3-2基因的启动子对花药的绒毡层表现出特异的活性。
如上所述，ZPT3-2基因的启动子对四分体期前后的绒毡层表现出特异的活性。绒毡层如上所述，是在花粉发育中起着关键作用的组织。因此，该启动子作为花粉发育相关详细研究的工具是有用的。另外，利用该启动子或其活性片段，使具有细胞毒性的基因等特异表达，通过破坏绒毡层的组织或使其功能丧失，可以阻碍花粉的发育。
产业上的实用性利用来自ZPT3-2基因并编码转录因子的DNA、以及来自ZPT3-2基因的启动子的本发明的方法，作为利用基因工程有选择地改变植物性状的技术，特别是赋予植物雄性不育性状的技术是有用的。
序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所所长(DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCS，MINISTRY OF AGROCULTURE，FORESTRY AND FISHERIES)<120>使用绒毡层特异的锌指转录因子使花粉受育性降低的方法<130>AR018<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1886<212>DNA<213>杂交矮牵牛(Petunia hybrida)<220>
<221>CDS<222>(283)..(1617)<400>1cccacgcgtc cgcatgtgca gagataaata taaaccaaca tgacctacca ttaagatgag 60acgatgatca tctaaaattt tggagctcag atgattttat tcgacaaatt tcctattttc 120tcgctatggg tttccttttc agctaagcta cctccctcct tcttcttgat ttgattttct 180tgggtttctt gtttcttctt gttttagggt ttttgataca catatatagt tgcttagtta 240cgtagctaag taaggtgggt tatttcattt cttgaacttt ca atg gtt gat tat294Met Val Asp Tyr1caa gat ctt caa gtt ggg atg agc gga aca ctg tgg ata caa ctc aag 342Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp Ile Gln Leu Lys5 10 15 20
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<221>启动子<222>(1).(1991)<400>3gaattcaggg agtagaacgc ttgacaatat acctgttgct ccaaacttat aaattggggc 60gacgatgaat gaagttaatc gatatgatta aattccatca cacagttatt gtttcaattc 120ttgttaccta attttagtta cacttgcttc acttcttttt agtggcgctt tacaaaaata 180atctagtcct cacattgaaa aaataatgcg atattagttt gacaataatt cagaagtact 240tttgaatata tgcaaaaata attatttcta ctgttaagga aaagctgcaa atttctgttt 300tttttttttt cagaagcaga agaaatttat taaattttca agataaaata atttttttaa 360aagactatat caatttattt caactgttat atatctcaaa tataaataaa actctattct 420tcttgtccat ctttatattt aaatttattc ctaccgatta aagaccttaa taatattttt 480atactacatt ttaaatttta atcaaatgaa taaataatta aatagattaa ataaaaattt 540tcttgatttt tttaaaaatc tttcacattt aaacaataat atcagccaca aatacaactt 600tagtgctgtt tttttgcact atttttaaaa taagcagtct tttgcagcta gacagacaag 660ttcatccaag tcaaatgcat cttaggtaaa ccaatgggcg tgaataattt tttttttcgc 720gtaactttat atttctaaaa tcacttttcg tagtaaaatt ccaaaggata gaaggaaagt 780ttgacgttat agcaaaatta tatgaaaaga tgatttctat ccttttataa gtgagtgaaa 840tcaaagttca tatcatggtt gagaagattt ttattaatgg taaaacaaat taagggcttt 900attgaaatat aagatggata ttatagcatt gatgtgggaa ttttggccgg tgtaaatgtg 960gcatgaatat gatcggatcg gataaaattg ggcagaaaca cggcaagcta agattaaaaa 1020acgcgcaang caaacacntc ancagtcaat gcaccactca agtagggtaa ttaatgacaa 1080attttacatt caaactaaat taaatgcaca cggttaaaat ctctgttaaa agttttggta 1140actttcagac tccttgaaca aactttccat ttggctaaag gtttgaacca aatgaatggg 1200aatacctatg agatatacac cactggaaag tccaagataa tttgaaatta caagagtttc 1260catttgatta ggctacttgt aatcttttga tttaattggt agtcaaattt taaaagatca 1320gaatgatctt ccatttcaca ccatcactta tcccatatct ttatttacaa ttcaaaatac 1380attaatatgt aaaacaaatt aaataactaa taatttcagt aaaactgttg gataattaaa 1440
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<223>人工序列的说明引物<400>5gtycgnranc cnccngtr18
权利要求
1.一种制作雄性不育性植物的方法，该方法包括以下步骤提供包含含有(a)具有序列号3所示的碱基序列中第1位到第1991位序列的DNA、以及(b)具有(a)的一部分序列并表现出花药的绒毡层特异性启动子活性的DNA中任一DNA的启动子，和与该启动子有效连接的异源基因的植物表达序列组合的步骤；将该表达序列组合导入植物细胞的步骤；以及导入了表达序列组合的植物细胞再生为植物体的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述植物是双子叶植物。
3.权利要求2所述的方法，其中，上述植物是茄科植物。
4.权利要求3所述的方法，其中，上述植物是矮牵牛属植物。
5.权利要求1所述的方法，其中，上述表达序列组合被整合到植物表达载体中。
6.一种通过权利要求1～5任一项所述的方法制作的雄性不育性植物。
7.一种含有以下(I)或(II)DNA的启动子(I)具有序列号3所示的碱基序列中第1位到第1991位序列的DNA；以及(II)具有(I)的一部分序列，并表现出对花药的绒毡层特异性启动子活性的DNA。
8.一种用于赋予植物雄性不育性的植物表达序列组合，其中，包含权利要求7所述的启动子和与该启动子有效连接的异源基因。
全文摘要
本发明提供一种制作雄性不育植物的方法，该方法是利用包含来自ZPT3－2基因的启动子、和与该启动子有效连接的异源基因的植物表达序列组合，制作雄性不育植物的方法。
文档编号C12N15/82GK1611607SQ20041003242
公开日2005年5月4日 申请日期1999年11月19日 优先权日1999年11月19日
发明者S·卡普尔, 小林晃, 高辻博志 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所, 独立行政法人农业·生物系特定产业技术研究机构