专利名称：生产l－型苏氨酸的方法
背景技术：
本申请要求在2003年9月6日在韩国知识产权局提出的韩国专利申请号2003-62423的优先权，其公开内容完整地结合于此作为参考。
1.发明领域本发明涉及一种生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，和一种使用该大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法。
2.相关技术描述L-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛用作饲料或食品添加剂。此外，L-苏氨酸被用作一种医用溶液或是一种药物合成的原料。
L-苏氨酸是使用由大肠杆菌(E.coli)，棒状杆菌属(Corynebacteriasp.)，沙雷氏菌属(Serratia sp.)或者普罗威登斯菌属(Providencia sp.)的野生菌株衍生的突变菌株，通过发酵方法生产的。突变菌株的实例包含抗氨基酸类似物或抗药突变株，具有抗氨基酸类似物或抗药物的二氨基庚二酸，蛋氨酸，赖氨酸，或异亮氨酸营养缺陷型突变株。日本专利公开出版物Hei.2-219582；Appl.Microbiol.Biotechnol.，29.550-553(1988)；韩国专利公开出版物1992-12423等公开了这些突变株。韩国专利公开出版物1992-12423公开了一种生产L-苏氨酸的大肠杆菌TF4076(KFCC 10718)。大肠杆菌TF4076是蛋氨酸营养缺陷型菌株，并且具有对苏氨酸类似物(AHVα-氨基-β-羟基戊酸)，赖氨酸类似物(AECS-(2-氨乙基-)L-半胱氨酸)，异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)，和蛋氨酸类似物(乙硫氨基)的抗性。
使用重组菌株的发酵方法还可以被用在L-苏氨酸的生产中。例如，日本专利公开出版物Hei 5-10076公开了一种使用包含含有天冬氨酸激酶，高丝氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，和苏氨酸合成酶的遗传信息的DNA片断的沙雷氏菌的重组菌株大批量生产苏氨酸的方法。此外，在日本专利公开出版物Hei.1-289493中公开使用来源于抗蛋氨酸代谢拮抗剂的普罗威登斯菌的基因来提高L-苏氨酸产量的方法。
同时，微生物基因的表达可以通过提高微生物中包含的基因的拷贝数来得以提高。因此，一种为微生物提供更大拷贝数的质粒被应用[Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，1989，1.3-1.5]。通过将目的基因插入质粒和然后用获得的重组质粒转化微生物，微生物中质粒的拷贝数得以提高。已经应用这种方法来尝试提高苏氨酸产量，报道了部分成功(美国专利号5,538,873)。但是，在多数情况下这种应用质粒的技术诱导特定基因的过量表达，因此向宿主微生物施加了很大负担。此外，在培养过程中有可能引起质粒丢失以致质粒的稳定性降低。
为了解决这些问题，Sambrook等提出向培养液中加入抗生素，并应用含有表达调控序列的质粒[Molecular Cloning，第2版，1989，1.5-1.6，1.9-1.11]。在应用含有表达调控序列的质粒的情况下，在生长期培养宿主微生物，以使未诱导表达，由此降低了宿主细胞的负担。在另一方面，在宿主微生物充分生长后，诱导暂时表达，由此释放基因产物。但是，这些含有表达调控序列的质粒中多数只有在最终基因产物是蛋白质的情况下才能被应用。当基因产物为与微生物生长密切相关的初级代谢产物时，必须在生长期诱导目的基因的表达。否则，难以期望初级代谢产物的累积。因为苏氨酸属于初级代谢产物，上述情况同样适用于苏氨酸。
作为一种没有这些问题的生产苏氨酸的方法，在美国专利号5,939,307中公开将苏氨酸生物合成基因插入染色体DNA。此外，还公开了一种通过调节苏氨酸操纵子的表达生产苏氨酸的方法，例如，用tac启动子替换苏氨酸操纵子的启动子(WO 98/04715)或者用大肠杆菌λ噬菌体的cI阻遏物和的PR启动子替换苏氨酸操纵子的表达调控区域(EP 0593792)。但是在这种情况下，因为染色体基因被含有可诱导的启动子的相应基因替换，苏氨酸操纵子基因的表达很难被大幅度提高。
在这点上，在寻找上述常规L-苏氨酸生产方法的问题的解决方案同时，考虑到metJ基因抑制metL基因表达的事实，metL基因是调节苏氨酸和蛋氨酸生物合成途径的基因之一，本发明人发现包含含有失活metJ基因的染色体DNA的E.coli菌株可以生产高产率的L-苏氨酸，从而完成本发明。
发明概述因此，本发明提供了一种能够以高产率生产L-苏氨酸的大肠杆菌(E.coli)菌株。
本发明还提供了一种用E.coli生产L-苏氨酸的方法附图简述通过参考附图在其例举的实施方案中详细描述，本发明的上述和其它特征及优势将变得更明显，所述附图中
图1是重组质粒pT7Blue/metJ的构建示意图；图2是重组质粒pT7ΔmetJ∷loxpKan和ΔmetJ∷loxpKan DNA片段的构建示意图；图3是大小标记(泳道1)，pGmTN-PPC12亲株(泳道2)，和E.coliFTR1221(登记号KCCM-10392)(泳道3)的DNA印迹分析结果，其应用FLA-5000图像处理系统(FUJIFILM)；和图4是蛋氨酸和苏氨酸的生物合成途径流程图。
发明详述本发明提供了包含含有失活metJ基因的染色体DNA的生产L-苏氨酸的大肠杆菌(E.coli)菌株。
如本文所用，术语“失活metJ基因”或类似的表达表明没有或者极少metJ基因的表达被诱导，或者即使可能表达，但是metJ基因没有活性或活性很小。通过突变可以诱导metJ基因的失活。突变的实例包括插入，缺失和倒位(inversion)。优选地，通过插入序列将metJ基因失活。因此，在缺失所有或者部分metJ基因后，抗生素抗性基因(下文中称作“抗生素标志”)可能被插入到缺失位点。通过这样的操作，当含有失活metJ基因的菌株被选择培养时，可以将特定的抗生素有利地用作选择试剂。抗生素标志可以是kanr，tetr，或ampr，但并不仅限于此。
metJ基因可以通过突变失活，这种突变是通过暴露于化学药品或辐射诱导的。备选地，使用基因重组可以特异性地仅使metJ基因失活。依照后面的实施例，将含有与metJ基因同源的核苷酸的一部分和含有失活metJ基因的DNA片段插入大肠杆菌宿主菌株以诱导同源重组，然后选择含有失活metJ基因的大肠杆菌菌株。DNA片段可以是图2中显示的ΔmetJ∷loxpKan。
metJ基因编码metJ蛋白，metJ蛋白抑制与苏氨酸和蛋氨酸的生物合成相关的metL基因的表达。metJ蛋白是调节E.coli中蛋氨酸的生物合成途径的蛋白质。metJ蛋白与其辅阻遏物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)共同抑制与苏氨酸生物合成相关的metL基因的表达。参考图4，thrA基因，metL基因，和lysC基因分别编码天冬氨酸激酶I，II，III。此外，thrA基因和metL基因分别编码高丝氨酸脱氢酶I和II。在这点上，在依照本发明含有失活metJ基因的E.coli菌株中，metL基因的表达不受控制。即，metL基因的表达被诱导，从而促进苏氨酸的生物合成。
按照本发明的E.coli菌株具有苏氨酸生产能力。优选地，该E.coli菌株具有对苏氨酸类似物，赖氨酸类似物，异亮氨酸类似物和蛋氨酸类似物的抗性。此外，E.coli菌株可以另外包含诸如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(下文称作“ppc基因”)的苏氨酸生物合成基因。优选E.coli FTR1221(登记号KCCM-10392)。
E.coli FTR1221(登记号KCCM-10392)是将含有具有双拷贝的ppc基因和苏氨酸操纵子的染色体DNA的E.coli pGmTN-PPC12(登记号KCCM-10236)中的metJ基因失活的生成物。E.coli pGmTN-PPC12(登记号KCCM-10236)是将从E.coli TF4076的染色体DNA通过PCR获得的ppc基因和苏氨酸操纵子插入作为L-苏氨酸生产菌株的E.coli TF4076(登记号KFCC-10718)(韩国专利公开出版物号92-12423)的生成物。因此，在E.coli pGmTN-PPC12中，将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为苏氨酸生物合成前体的草酰乙酸的酶ppc的基因，和参与从草酰乙酸生产苏氨酸的苏氨酸生物合成途径的基因(thrA，thrB，和thrC)高水平表达。因此，E.colipGmTN-PPC12其特征在于它生产增加L-苏氨酸的能力。E.colipGmTN-PPC12于2000年12月29日保藏在韩国微生物培养物中心(登记号KCCM-10236)。
本发明提供了生产L-苏氨酸的方法，该方法包括(a)培养包含含有失活metJ基因的染色体DNA的生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株。
(b)从培养物中回收L-苏氨酸。
在步骤(a)中，培养可以在本领域普通技术人员公知的常规大肠杆菌培养基和条件下进行。取决于所用菌株和培养规模可以以各种方式进行培养。
在步骤(b)中，可以使用本领域普通技术人员已知的任何回收方法。例如，从培养基中去除E.coli菌株，接着离子交换层析和结晶，但并不限于此。
现在将通过实施例更详细地描述按照本发明的L-苏氨酸生产方法。
1.重组质粒的构建从将用于构建包含metJ基因片段的重组质粒pT7Blue/metJ的生产苏氨酸的菌株中提取染色体DNA。尽管对于可用的克隆载体没有特别限制，优选使用pT7Blue克隆载体。
将含有loxP位点的卡那霉素抗性基因片段插入到重组质粒pT7Blue/metJ中以获得重组质粒pT7ΔmetJ∷loxpKan。因此，重组质粒pT7ΔmetJ∷loxpKan中包含失活metJ基因。
2.将含有失活metJ基因的DNA片段插入到菌株和菌株选择E.coli菌株被重组质粒pT7ΔmetJ∷loxpKan转化和从转化的E.coli菌株中提取质粒DNA。用限制酶消化质粒DNA，之后电泳以获得DNA片段，ΔmetJ∷loxpKan(图3)。
将ΔmetJ∷loxpKan DNA片段转化到生产苏氨酸的菌株中。结果，天然metJ基因通过同源重组被ΔmetJ∷loxpKan DNA片段替换。
将如此得到的转化体涂到包含卡那霉素的固体培养基中选择菌落。结果，包含失活metJ基因的重组菌株可从菌落中选择。
如此选择的重组菌株即使在其生长继续时仍能稳定地保持metJ基因的失活状态，并具有相对于亲株卓越的苏氨酸生产能力。
下文中，将通过实施例更具体地描述本发明。但是，提供下列实施例仅用于举例说明，因此本发明不仅限于此或受它们限制。
实施例1重组质粒的构建和使用重组质粒将metJ基因失活从生产苏氨酸的菌株pGmTN-PPC12(登记号KCCM-10236)中使用QIAGEN Genomic-tip系统提取染色体DNA。使用染色体DNA作为模板，通过PCR扩增包含metJ基因的可读框(ORF)大约700bp的片段。扩增的引物是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所列的那些，将PCR预混合物(Bioneer Co.)用作PCR的反应混合物。PCR反应在94℃下保持30秒以变性，在55℃下保持30秒以退火，并在72℃下保持1分钟30秒延伸共30个循环。
在PCR产物通过0.1％的琼脂糖凝胶电泳大小分级后，纯化含有所需大小的DNA片段的条带。将DNA片断与pT7Blue克隆载体(Novagen Co.)在16℃下连接过夜。结果，获得了重组质粒pT7Blue/metJ(图1)。在E.coliNM522被pT7Blue/metJ转化以后，将获得的转化体涂到固体培养基(50mg/L)上，37℃培养过夜。
用牙签将固体培养基上生长的菌落接种到含有羧苄青霉素的3mL的液体培养基中并培养过夜。然后，使用QIAGEN小量制备试剂盒分离质粒DNA，并测定它们的大小。此外，用限制酶Mlu I消化质粒DNA以确定克隆的metJ基因片段的存在。质粒DNA被鉴定为pT7Blue/metJ DNA。用限制酶Mlu I消化pT7Blue/metJ DNA，并将3.6kb的条带在0.8％的琼脂糖凝胶上分离。条带中含有的DNA片段通过Klenow酶消化以获得平端DNA片段。在另一方面，用限制酶Hinc II和EcoR V消化质粒pUG6[Ulrich等，Nucleic Acids Research，1996，24，第2519-2524页]以获得包含loxP位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。将平端的DNA片断与含有loxP位点的卡那霉素抗性基因片段连接以获得重组质粒，pT7ΔmetJ∷loxpKan(大约5.3kb)(图2)。
实施例2选择包含含有失活metJ基因片段的染色体DNA的菌株在将pT7ΔmetJ∷loxpKan重组质粒转化到NM522中后，将获得的转化体涂到含有羧苄青霉素和卡那霉素(分别为50mg/L和25mg/L)的固体培养基上，32℃过夜培养。用牙签将固体培养基上生长的菌落接种到含有羧苄青霉素和卡那霉素的3mL液体培养基中，在250rpm下振荡过夜培养。然后，使用QIAGEN小量制备试剂盒提取质粒DNA。在通过限制酶切割确定质粒DNA的大小后，用限制酶Pvu II消化质粒DNA，约为2.4kb的DNA片断(ΔmetJ∷loxpKan)在0.7％的琼脂糖凝胶上分离(图2)。将DNA片断(ΔmetJ∷loxpKan)转化到生产苏氨酸的pGmTN-PPC12菌株中，将获得的重组体涂到含有卡那霉素的固体培养基上选择菌落。最终，从菌落中选择含有失活metJ基因的重组菌株。
实施例3在选择的重组菌株和亲株之间苏氨酸生产能力的比较在实施例2在涂到含有卡那霉素的固体培养基上以后选择的菌落中，将30个菌落在锥形瓶中培养，所述锥形瓶中含有具有下表1培养基组成的苏氨酸生产培养基，评估苏氨酸的产量。
表1苏氨酸生产的培养基组成
首先，将30个单菌落在包含LB固体培养基的32℃培养箱中过夜培养。然后，将1菌环量的每个单菌落接种到25ml苏氨酸生产培养基中，32℃，250rpm振荡培养48小时。评估结果在下表2中显示。如表2所示，30个菌落中，25个菌落生产25g/L或更多的苏氨酸。另一方面，亲株pGmTN-PPC12在培养物中生产23g/L的苏氨酸。从上述结果可见，依照本发明的重组菌株相对于亲株显示卓越的生产苏氨酸的能力。
实际上，依照本发明的重组菌株显示相对于亲株产率最大增加约8％。基于上述结果，在重组菌株中，选择具有最高苏氨酸生产能力的菌株。选择的菌株被命名为E.coli FTR1221，于2002年6月25日保藏在韩国微生物培养物中心(登记号KCCM-10392)。
表2重组菌株的烧瓶滴定试验的结果
实施例4使用DNA印迹分析鉴定失活metJ基因进行DNA印迹分析，以便确定metJ基因是否已经特异性地插入到实施例2中选择的菌株中。将亲株pGmTN-PPC12和E.coli FTR1221(登记号KCCM-10392)在3ml含有卡那霉素的液体培养基中200rpm振荡过夜培养，然后使用QIAGEN染色体试剂盒20分离各自的染色体DNA。用限制酶Mlu I过夜消化染色体DNA，然后用0.7％琼脂糖凝胶电泳大小分级。电泳后，使用毛细转移法[Sambrook等，Molecular Cloning，第1卷，第6.31-6.38页]将DNA级分片段从琼脂糖凝胶转移到尼龙膜(YOUNG Sci.Biodyne B Membrane)上。将膜干燥，接着用UV照射(120mJ/cm2，SpectroLikerTM)将DNA片段固定在膜上。将膜在55℃下放在预杂交液1(Roche#1093657)中2小时以预杂交。然后，将变性DNA探针加入预杂交液，并将获得的溶液在55℃杂交灶(BAMBINO 230300)中温育过夜杂交。
此处用到的探针制备如下。用QIAGEN试剂盒分离的质粒pUG6被限制酶Hinc II和EcoR V消化以获得含有loxP位点的卡那霉素抗性基因片段(大约1.7kb)。将基因片段在100℃水中加热5分钟，然后在冰上立即冷却5分钟以获得单链DNA。使用DIG标记和检测试剂盒(Roche#1093657)在37℃过夜温育单链DNA。结果，获得了标记有异羟基洋地黄毒苷(DIG)-UDP的DNA探针。
杂交后，与膜非特异性结合的DNA使用洗脱液I和II(Roche#1093657)去除。使用预杂交液2(Roche#1093657)将膜在室温下掩蔽30分钟。然后，加入能与DIG-UTP特异性结合的抗DIG抗体，室温下温育30分钟。使用洗脱液III(Roche#1093657)去除与膜非特异性结合的抗DIG抗体，并在室温下使用标记和检测试剂盒(Roche#1093657)进行呈色反应直至条带显见。结果在图3中显示。不包含卡那霉素基因的亲株pGmTN-PPC12(泳道2)中未见条带。在另一方面，如所期望，在E.coliFTR1221(登记号KCCM-10392)(泳道3)中观察到约1.3kb的条带。这条1.3kb的条带表示部分metJ基因(1.5kb)和卡那霉素抗性基因(约0.8kb)的两个片段。泳道1是大小标记。
实施例5比较使用发酵罐的苏氨酸的生产能力评估E.coli FTR1221(接受号KCCM-10392)和亲代菌株pGmTN-PPC12在5L发酵罐中苏氨酸生产能力。初始培养物的培养基组成在下表3中表示。将包含10g/L葡萄糖和0.1g/L L-蛋氨酸的LB培养基用作种子培养基。初始接种体积被调节到发酵罐中初始培养物体积的3％到5％。向发酵罐培养基中加入6次葡萄糖以保持培养基中残留的葡萄糖能达到5％的水平。当葡萄糖被耗尽时进行葡萄糖的添加。此外，在加入葡萄糖的过程中，加入磷酸二氢钾(KH2PO4)以保证KH2PO4的含量达到1wt％。初始培养物体积为1.5L，最终培养物体积为3.0L。发酵后，加入的葡萄糖总量为250g/L。振荡速度设为700到1,000rpm。pH和温度分别设定为7.0和32℃。在发酵过程中，使用25-28％的氨水控制pH。通气速率设定为0.5vvm。
结果在下表4中表示。亲株生产93.5g/L苏氨酸，并显示37.4％的产率，既每一消耗的葡萄糖生产的苏氨酸。在另一方面，E.coli FTR1221生产105g/L苏氨酸，并显示42％的产率。因此，E.coli FTR1221相比亲株苏氨酸产率提高了4.6％。
表35L发酵罐中的初始培养基的组成
表4重组菌株的5L发酵罐中苏氨酸生产的结果
从上述描述很容易看出，依照本发明的E.coli菌株包含含有失活metJ基因的染色体DNA。因此，metJ基因产物导致的苏氨酸生物合成基因表达的抑制被消除，由此生产出高浓度的苏氨酸。此外，依照本发明中的L-苏氨酸生产方法，可在高产率下生产出高浓度的L-苏氨酸。
尽管已经参照其例举的实施方案具体显示和描述了本发明，本领域普通技术人员应当理解，可以在其中不背离后附权利要求限定的本发明精神和范围下进行形式和细节上的各种变化。
Sequence Listing序列表<110>CJ株式会社<120>生产L-苏氨酸的方法<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1agttccctgg gctttgtcg 19<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gctaggcctg ataagcgtag c2权利要求
1.生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，其包含含有失活metJ基因的染色体DNA。
2.按照权利要求1的大肠杆菌菌株，其中所述metJ基因是通过插入序列失活。
3.按照权利要求1的大肠杆菌菌株，其耐受苏氨酸类似物，赖氨酸类似物，异亮氨酸类似物和蛋氨酸类似物。
4.按照权利要求3的大肠杆菌菌株，其是登记号为KCCM-10392的大肠杆菌FTR1221。
5.生产L-苏氨酸的方法，其包含(a)培养依照权利要求1至4中任何一项的大肠杆菌菌株；和(b)从培养物中回收L-苏氨酸。
全文摘要
提供生产L－苏氨酸的大肠杆菌菌株和生产它的方法。该大肠杆菌菌株包含含有失活metJ基因的染色体DNA。因此，防止通过metJ基因产物的苏氨酸生物合成基因的表达抑制，由此生产高浓度的苏氨酸。另外，使用该方法可以以高产率生产高浓度的L－苏氨酸。
文档编号C12P13/00GK1607246SQ20041006872
公开日2005年4月20日 申请日期2004年9月6日 优先权日2003年9月6日
发明者赵载溶, 李炳春, 金大哲, 李镇浩, 朴英薰 申请人:Cj株式会社