专利名称：大肠杆菌生产l－苏氨酸的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将不受苏氨酸反馈抑制的苏氨酸合成相关基因转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌温敏启动子调节基因的表达，使L-苏氨酸能在大肠杆菌大量合成。
背景技术：
苏氨酸1935年首次从血纤维蛋白中分离得到，其结构类似苏糖，故将其命名为苏氨酸。苏氨酸为无色至微黄色结晶性粉末，有极弱的特异性气味。非常易溶于甲酸，易溶于水，难溶于乙醇和乙醚等有机溶剂。苏氨酸的分子量为119.18，有4种异构体，其中D-苏氨酸动物不能吸收利用(BakerDH等，1998)；天然存在的是L-苏氨酸。
试验表明，苏氨酸是动物维持生长所必需的。苏氨酸缺乏，可导致动物采食量降低、生长受阻、饲料利用率下降、免疫机能抑制等症状。在大多数植物性蛋白质饲料(尤其是谷物类饲料)中，苏氨酸是第二或第三限制性氨基酸(Eckert和Allce，1974；Fuller，1979；Allce和Hince，1971)。故在植物性低蛋白日粮中，添加苏氨酸效果显著，特别是补充了蛋氨酸、赖氨酸的日粮，同时再添加苏氨酸可得到最佳效果。补充苏氨酸能够提高生猪采食量、日增重、饲料利用率、降低单位增重成本的效果。在以菜籽粕或大豆粕为蛋白质主要来源的生猪低蛋白质日粮中，赖氨酸是第一限制性氨基酸，苏氨酸是第二限制性氨基酸。
苏氨酸主要用于饲料添加剂和医药。作为饲料添加剂L-苏氨酸主要由发酵生产，部分来自蛋白质水解物分离。通过对自然界菌种诱变而成的L-苏氨酸生产菌株有黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌和粘质赛氏杆菌。它们均以葡萄糖为原料，产酸率分别为18.0g/L，14.0g/L，14.0g/L(农业生物化学，1973年，37，653)。
在大肠杆菌中，苏氨酸合成从天冬氨酸开始，天冬氨酸在天冬氨酸激酶AKI催化下转变为天冬氨酰磷酸，经过还原最后生产高丝氨酸。AKI是一个多功能酶，从天冬氨酸到高丝氨酸的代谢均由AKI催化。AKI由thrA基因编码。高丝氨酸在高丝氨酸激酶催化下磷酸化，磷酸化高丝氨酸通过苏氨酸合成酶合成苏氨酸。高丝氨酸激酶由thrB基因编码，而苏氨酸合成酶由thrC基因编码。thrA、thrB和thrC归属于苏氨酸操纵子，它们编码的酶量及酶活均受苏氨酸和异亮氨酸的反馈抑制。
对苏氨酸代谢调节现在研究比较清晰。在苏氨酸代谢过程中，thrA编码的AKI起决定作用。一般大肠杆菌合成苏氨酸的量有限，因为苏氨酸抑制AKI酶活性，并通过苏氨酸-tRNAs调节苏氨酸操纵子转录。苏氨酸类似物可以用来筛选苏氨酸生产菌种，如α氨基β羟基戊酸的抗性菌株中，thrA基因发生突变，突变基因编码的AKI酶抵制苏氨酸反馈抑制，从而导致苏氨酸的积累。具有抗生素borrelidin抗性的大肠杆菌中，苏氨酸-tRNAs合成酶的构象发生了变化，大大降低了与苏氨酸的亲和力，使苏氨酸大量积累。
限制苏氨酸大量合成的另一个主要因素来源于异亮氨酸。异亮氨酸的合成以苏氨酸为原料，因此如果其合成途径不切断，只能导致异亮氨酸的积累，而苏氨酸的含量不高；另一方面，异亮氨酸对thrA基因的转录水平具有强烈的反馈抑制，高含量异亮氨酸阻断AKI酶的合成。
发明内容
本发明的目的是寻找一种能高产苏氨酸的基因工程菌。
本发明的另一目的公开了高产苏氨酸的基因工程菌的生产方法。
本发明以大肠杆菌K12(购自美国菌种保藏中心ATCC)为原始菌种。利用寄生在以蔗糖为碳源的大肠杆菌中的噬菌体P1(购自美国菌种保藏中心ATCC)侵染大肠杆菌K12菌株，在只含有蔗糖的培养基中筛选，挑取在蔗糖培养基上生长良好的菌株，作为苏氨酸生产的宿主菌。
本发明为了阻断苏氨酸产物流向异亮氨酸，通过同源重组，缺失苏氨酸脱氨酶基因。利用引物gctgactcgcaacccctgtccgtccggtgctccgg aaggtgccgaatatttaagagctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacc和gtcgtggcaatcgtagcccagctctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggtcgccaagttcgaacgccgccagtcgtggccttctgcttaatttgatgcctggcag扩增含有卡那霉素抗性基因表达单元的重组片段。将含有卡那霉素抗性基因表达单元的重组单元PCR扩增后，利用电击仪(Bio-rad Gene pulser)(美国BIO-RED公司)电击转化大肠杆菌，50μl大肠杆菌中加入2μg上面回收的重组单元DNA片段。转化参数如下25KV，200Ω，25μF。电击后大肠杆菌在不加抗生素的丰富培养基上生长1小时，然后涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。37℃培养12小时，筛选具有抗性的菌落。在加入异亮氨酸和未加入异亮氨酸的M9培养基(每升培养基中含Na2HPO47H2O12.8g；KH2PO43g；NaCl0.5g；NH4Cl1g)中对应鉴别异亮氨酸缺陷的大肠杆菌菌株。将具有卡那霉素抗性的细菌划线，同一个菌对应划在含有异亮氨酸和不含异亮氨酸的M9培养基上，37℃生长24-48小时后，挑取前者生长后者不生长的菌落，从中任意选择一个菌落命名为E.colidIle，用于转化具有苏氨酸操纵子表达单元。
本发明将大肠杆菌菌株VNIIgenetika M-1(U.S.Pat.No.4321325)中的苏氨酸操纵子中3个结构基因构建到高效表达的原核质粒中，根据克隆载体pGEX-6P(基因库编号U78874)(购自美国Promega公司)设计引物合成新的TAC启动子引物设计如下。
tac15’-caactgcacttgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggatttgtgagcggataac-3’和tac25’-cctagtagcatgaattctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaaatccaca c-3’。PCR扩增条件为94℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒，进行30个循环扩增，扩增后72℃延伸5分钟。将合成的TAC启动子利用PstI和ClaI(购自日本TAKARA公司)酶切后插入pVic40载体(U.S.pat.No.4,321,325)，构建中间载体pTAC-thrA，将pVic40载体PstI和ClaI酶切后，回收酶切后DNA小片段，将DNA小片段TagI部分酶解与pTAC-thrA连接，插入中间载体pTAC-thrA ClaI酶切位点，构建苏氨酸最终表达载体pTAC-THR。利用电击转化法将表达载体pTAC-THR转化到异亮氨酸缺失突变的菌株E.colikdIle中，在100mg/ml的硫酸链霉素中筛选抗性菌落E.coli THR6，获得产苏氨酸的基因工程菌株E.coliTHR6。
本发明利用苏氨酸生产菌株E.coli THR6在含有0.2％葡萄糖，100mg/ml硫酸链霉素固体培养基中生长48小时，10ml 0.9％(重量百分比)氯化钠溶液洗脱并悬浮细菌，加入5000ml种子培养基，每升中的菌量为108。培养基配方如下(重量百分比)糖浆 1.0-4.0％硫酸铵 0.2-0.5％磷酸二氢钾 0.1-0.2％7水合硫酸镁 0.02-0.05％7水合硫酸亚铁0.001-0.002％5水合硫酸锰 0.001-0.002％酵母裂解物 0.2-0.3％加水至100ml将培养基转到5L发酵罐中培养20小时，培养条件为通氧(0.5升/分钟)，生长温度37℃，搅拌(1200转/分钟)，培养基pH值为6.9-7.2。
利用糖浆氨水(氨水∶糖浆＝2-3∶1)混合液调节pH值和补料。发酵32小时，苏氨酸合成量为75g。
本发明的有益效果本发明通过基因工程生产苏氨酸具有以下优点1.原始菌株在经过基因工程改造后除了在苏氨酸代谢途径上有少量变化外，其它生理特征不变。因此不影响菌株的发酵。
2.该工程菌株采用的苏氨酸操纵子不受苏氨酸反馈抑制，因此在苏氨酸合成过程中，细菌生长和苏氨酸代谢不受影响。
3.工程菌株为异亮氨酸缺陷，异亮氨酸合成以苏氨酸为前体，异亮氨酸缺陷可以使合成的苏氨酸大量累计。
4.该工程菌苏氨酸操纵子由原核强启动子控制。
5.工程菌在一定浓度抗生素下正常生长，其中的质粒保持稳定。
图1是苏氨酸合成载体构建。
图2是苏氨酸发酵5L罐试验。
具体实施例方式
实施例1 广谱碳源大肠杆菌K12菌株的筛选利用寄生在以蔗糖为碳源的大肠杆菌中的噬菌体P1侵染大肠杆菌K12菌株，在只含有蔗糖的培养基中筛选，挑取在蔗糖培养基上生长良好的菌株，从中取出一个大肠杆菌菌株定名为E.coli-Sac，作为苏氨酸生产的宿主菌。
实施例2 同源重组缺失大肠杆菌E.coli-Sac异亮氨酸合成体系中的苏氨酸解氨酶基因。
1.重组单元的构建从质粒pBI121(美国国家卫生院生物技术研究中心NCBI基因库GenBank编号AF485783)中扩增卡那霉素抗性基因NPTII，在其两端加入BamHI和SacI位点，构建原核表达载体pYPX251(GenBank编号AY178046)质粒，利用引物gctgactcgcaacccctgtccgtccggtgctccgg aaggtgccgaatatttaagagctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacc和gtcgtggcaatcgtagcccagctctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggtcgccaagttcgaacgccgccagtcgtggccttctgcttaatttgatgcctggcag扩增含有卡那霉素抗性基因表达单元的重组片段。PCR扩增条件为94℃，30秒；60℃，1分钟；72℃，2分钟，进行30个循环扩增，扩增后72℃延伸10分钟。
2.异亮氨酸缺陷菌株的筛选1)制备大肠杆菌E.coli-Sac菌株的电激感受态。方法如下利用100ml LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠)培养细菌过夜至细菌浓度为OD600＝0.5-0.8。5000转/秒离心收集培养好的细菌，利用灭菌的双蒸水洗离心菌体两次，每次25ml，再用灭菌的10％甘油洗一次，最后利用1ml 10％甘油悬浮菌体。
2)将含有卡那霉素抗性基因表达单元的重组单元PCR扩增后，利用1％琼脂糖凝胶电泳，切下电泳条带，装入由半透膜组成的透析袋中，加入足量的水将透析袋中空气排除干净，100V电泳30分钟，回收透析袋中的全部水溶液至新的离心管中，在离心管中加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M的醋酸钠，-20℃放置1小时，12000转/分钟离心30分钟，获得的沉淀即重组单元DNA片段，在离心管中加入20微升灭菌的双蒸水悬浮沉淀。DNA片段浓度达到每微升1微克。
3)利用电击仪(Bio-rad Gene pulser)(美国BIO-RED公司)电击转化大肠杆菌，50μl大肠杆菌中加入2μg上面回收的重组单元DNA片段。转化参数如下25KV，200Ω，25μF。
4)电击后大肠杆菌在不加抗生素的丰富培养基上生长1小时，然后涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。37℃培养12小时，筛选具有抗性的菌落。
5)在加入异亮氨酸和未加入异亮氨酸的M9培养基(每升培养基中中含Na2HPO47H2O12.8g；KH2PO43g；NaCl 0.5g；NH4Cl1g)中对应鉴别异亮氨酸缺陷的大肠杆菌菌株。将4)中具有卡那霉素抗性的细菌划线，同一个菌对应划在含有异亮氨酸和不含异亮氨酸的M9培养基上，37℃生长24-48小时后，挑取前者生长后者不生长的菌落，从中任意选择一个菌落命名为E.colidIle，用于转化具有苏氨酸操纵子表达单元。
实施例3 苏氨酸生产菌株的基因工程构建1)根据克隆载体pGEX-6P(基因库编号U78874)(购自美国Promega公司)的TAC启动子设计引物合成新的TAC启动子引物设计如下。
tac15’-caactgcacttgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggatttgtgagcggataac-3’和tac25’-cctagtagcatgaattctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaaatccaca c-3’。PCR扩增条件为94℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒，进行30个循环扩增，扩增后72℃延伸5分钟。
2)将合成的TAC启动子利用PstI和ClaI(购自日本TAKARA公司)酶切后插入pVic40载体(U.S.pat.No.4,321,325)，构建中间载体pTAC-thrA，将pVic40载体PstI和ClaI酶切后，回收酶切后DNA小片段，将DNA小片段TagI部分酶解，每微克DNA片段加入0.1-0.5单位的TagI，37℃酶解30-60分钟，将酶解好的DNA小片段与pTAC-thrA连接，将DNA小片段插入中间载体pTAC-thrA ClaI酶切位点，构建苏氨酸最终表达载体pTAC-THR。
3)利用电击转化法(方法同实施例2)，将表达载体pTAC-THR转化到异亮氨酸缺失突变的菌株E.colikdIle中，在100 mg/ml的硫酸链霉素中筛选抗性菌落E.coli THR6。
实施例4 苏氨酸生产菌株生长和发酵(重量百分比)苏氨酸生产菌株E.coli THR6在含有0.2％葡萄糖，100mg/ml硫酸链霉素固体培养基中生长48小时，10ml 0.9％(重量百分比)氯化钠溶液洗脱并悬浮细菌，加入5000ml种子培养基，每升中的菌量为108。培养基配方如下1000ml培养基营养成分如下糖浆 30ml硫酸铵 4g磷酸二氢钾 1g7水合硫酸镁 0.3g7水合硫酸亚铁0.01g5水合硫酸锰 0.01g酵母裂解物 2g将培养基转到5L发酵罐中培养20小时，培养条件为通氧(0.5升/分钟)，生长温度37℃，搅拌(1200转/分钟)，培养基pH值为6.9-7.2。
利用糖浆氨水(氨水∶糖浆＝2.92∶1)混合液调节pH值和补料。发酵32小时，苏氨酸合成量为75g。
权利要求
1.一种能阻断苏氨酸产物流向异亮氨酸缺失苏氨酸脱氨酶基因苏氨酸操纵子不受苏氨酸反馈抑制，由原核强启动子控制苏氨酸操纵子利用蔗糖为碳源的生产L-苏氯酸的大肠杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，其特征在于该菌株的性能缺失苏氨酸脱氨酶基因具有阻断苏氨酸产物流向异亮氨酸。
3.根据权利要求1所述的生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，其特征在于苏氨酸操纵子中的三个结构基因为天冬氨酸激酶AKI基因、高丝氨激酶基因和苏氨酸合成基因不受苏氨酸反馈抑制表达。
4.如权利要求1所述的生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的制备方法，包括由a、筛选出蔗糖培养基生长良好的大肠杆菌菌株；b、利用设计引物PCR扩增获得用于同源重组缺失苏氨酸脱氨酶基因；c、上述缺失苏氨酸脱氨基酶基因的DNA片段通过电击转化大肠杆菌；d、将大肠杆菌菌杆中的苏氨酸操纵子中3个结构基因构建到高效表达的原核质粒中，设计合成TAC启动子，PCR扩增将合成TAC启动子构建成中间载体PTAC-ThrA再与酶切后的DNA小片段连接，插入PTAC-ThrA ClaI酶切位点构建成苏氨酸最终表达载体PTA-THR；e、再将上述PTAC-THR表达载体利用电击转化法转化到异亮氨酸缺失突变的大肠杆菌菌株中，抗性筛选获得苏氨酸基因工程菌。
5.根据权利要求4所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于设计引物为gctgactcgcaacccctgtccgtccggtgctccgg aaggtgccgaatatttaagagctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacc和gtcgtggcaatcgtagcccagctctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggtcgccaagttcgaacgccgccagtcgtggccttctgcttaatttgatgcctggcagPCR扩增同源重组获得用于缺失苏氨酸脱氨基酶基因的DNA片段。
6.根据权利要求4所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于构建苏氨酸合成质粒方法为苏氨酸操纵子中三个为天冬酸激酶AKI基因，高丝氨酸激酶基因和苏氨酸合成酶基因并构建到高效表达的原核质粒中，设计合成TAC启动子，引物为tac15’-caactgcacttgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggatttgtgagcggataac-3’和tac25’-cctagtagcatgaattctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaaatccaca c-3’将合成的TAC启动子利用PstI和ClaI酶切后插pvic40载体构建中间载体Ptac-ThrA再与酶切后的DNA小片段连接，插入PTAC-ThrA ClaI酶切位点构建成苏氨酸最终表达载体PTAC-THR。
7.根据权利要求4所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于苏氨酸表达载体PTAC-THR利用电击转化法转化到异亮氨酸缺失突变的大肠杆菌菌株中，抗性筛选获得苏氨酸生产基因工程菌E.coli THR6。
8.根据权利要求4所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于苏氨酸基因工程菌E.coli THR6在培养基(重量百分比)为糖浆 1.0-4.0％硫酸铵 0.2-0.5％磷酸二氢钾 0.1-0.2％7水合硫酸镁0.02-0.05％7水合硫酸亚铁 0.001-0.002％5水合硫酸锰0.001-0.002％酵母裂解物 0.2-0.3％加水100ml中发酵培养，温度在37℃，PH为6.9-7.2，提取获得。
全文摘要
本发明公开了大肠杆菌生产L－苏氨酸的方法，本方法采用大肠杆菌K
文档编号C12P13/08GK1597974SQ03151020
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者王焕章, 吴新, 彭日荷, 姚泉洪 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司