专利名称：检测猪霍乱沙门氏菌之聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪霍乱沙门氏菌之方法、PCR引物对及试剂盒。特别地，本发明涉及一种利用鞭毛基因fliC检测猪霍乱沙门氏菌之方法、PCR引物对及试剂盒。
背景技术：
Salmonella enterica serovar Choleraesuis(猪霍乱沙门氏菌)是猪中最常发现之血清型之一，此血清型菌株之宿主为人类及猪(Bu毫升er et al.，Infect.Immun.，664579-4587)。猪霍乱沙门氏菌能够引起猪沙门氏菌症，症状为败血症及肠炎。文献指出少数感染沙门氏菌的猪，在屠宰之前能快速传播接着感染更多的猪(Gary et al.，Appl.Environ.Microbiol.，62141-146)。在台湾，猪霍乱沙门氏菌分离株具有高度之多重抗药性且变成广泛存在之病源菌，在猪养殖业上形成主要问题(Hsueh et al.，Emerg.Infect.Dis.，1060-68)。猪霍乱沙门氏菌传播之方式有几种，例如通过受感染的动物造成食品污染而由人类食入、动物及动物饲料之间的散布及人与人之间的传染等。
猪霍乱沙门氏菌检测使用传统的培养方法，其主要依据选择性培养基筛选，例如Rappaport-Vassiliadis液体培养基(Vassiliadis，J.Appl.Microbiol.，5469-76)、GN-Hajna液体培养基(Anderson et al.，Res.Vet.Sci.，64261-261)、Hajna-四硫磺酸盐液体培养基(Osumi et al.，J.Vet.Med.Sci.，65949-951)、生化及血清测试。此种传统检测猪霍乱沙门氏菌之方法需花费三至五天。近来，斑点酶联免疫吸附(dot blot ELISA)方法已被发展用于检测猪霍乱沙门氏菌(Janyapoon et al.，Clin.Diagn.Lab.Immun.，7977-979)。此方法比传统方法快，然而副伤寒沙门氏菌C(Salmonellaenterica serovar Paratyphi C)在此检测方法中会产生假阳性反应；此外，此方法需取得可利用之检测用抗体，在操作上仍有限制。当沙门氏菌丧失对于鞭毛基因表达之能力时，此方法即可能无法正确检测出猪霍乱沙门氏菌的存在。
沙门氏菌属中，利用细胞壁之脂多醣抗原(O-抗原)及鞭毛蛋白质之抗原(H-抗原)作为血清型分类之方式，目前已可定义出2,523种血清型(Popoffet al.，2003)。大部分之沙门氏菌血清型属于双相鞭毛，即能够产生两种不同之鞭毛蛋白质，亦有少数沙门氏菌具有单相或三相之鞭毛。基因所编码第一相及第二相之鞭毛蛋白分别为fliC及fliB，细菌鞭毛基因其5’端及3’端为高度保守之区域，而中间区域则为高度变化区域，大部分的fliC对偶基因能够被单独区别出(McQuiston et al.，J.Clin.Microbiol.，421923-1932)。沙门氏菌菌株可能具有相似的基因型，但却可能有不同的fliC基因(Smith及Selander，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88956-960)，其强烈地支持在菌株间可能发生鞭毛基因交换。菌株间基因交换及重组作用为主要之演化机制，因此于沙门氏菌天然族群之间即可能产生fliC对偶基因及血清型之多样化(Selander et al.，Infect.Immun.582262-2275)。
至今，尚没有能迅速且直接检测出猪霍乱沙门氏菌之方法。因此，市场上亟需一种能更快速且精确地检测出不同样品中猪霍乱沙门氏菌之方法。
发明内容
为达到上述目的，本发明一方面提供一种从样品中检测猪霍乱沙门氏菌存在之方法。
本发明另一方面提供一种检测猪霍乱沙门氏菌之PCR引物对。
本发明又一方面提供一种用于检测猪霍乱沙门氏菌之试剂盒。
本发明之上述及其它目的、特色及优点，将详述于下述详细说明、附图及权利要求中。
图1为本发明之引物对在猪霍乱沙门氏菌fliC基因之位置，该基因序列见GenBank database X03394。
图2为利用本发明之PCR引物对检测猪霍乱沙门氏菌之灵敏度结果。(A)a及j道为100bp阶梯对照物；b至i道分别为沙门氏菌菌株SC41、SI20、SL40、SL45、SN20、SO20、ST180及ST272。(B)a道为100bp阶梯对照物；b至h道为106至102及0CFU菌株及空白对照组。
图3为利用本发明之PCR引物对，于(A)猪粪便样品、(B)猪肉样品、(C)猪饲料样品、(D)人类全血样品中检测猪霍乱沙门氏菌之灵敏度结果。(A)、(B)及(C)a道为100bp阶梯对照物；b至h道为每克样品含105至100及0CFU之菌株。(D)a道为100bp阶梯对照物；b至i道为每克样品含107至100及0CFU之菌株。
具体实施例方式
本发明主要提供一种从样品中检测猪霍乱沙门氏菌存在之方法，其包括(a)将样品与含有包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列混合得到反应混合物；(b)将(a)所得之反应混合物进行聚合酶链式反应(PCR)；及(c)检测该反应混合物中PCR产物之存在。
聚合酶链式反应(PCR)之操作及原理可参考Saili et al.(1985)，Science，230 1350。PCR是由重复周期之DNA聚合酶所引起的增幅反应所组成。将目标DNA加热变性，并和与欲扩增之DNA目标序列互补的两段寡核苷酸进行杂交。和DNA聚合酶一起时，这些寡核苷酸作为引物对。DNA的复制是通过延长引物来聚合成为双股的第二份复制品。通过反复热变性、引物杂交及扩增之过程后，目标DNA序列便可在约2-4小时内，扩增至一百万倍或更多。PCR是一种分子生物学方法，其必须配合检测技术同时使用，才能测得扩增的结果。在本发明中，是利用2％琼脂凝胶进行电泳，再以溴化乙锭染色该琼脂凝胶，观察及照相后进行分析。
在本发明之一具体实施例中，若将PCR方法检测之样品中进行预培养，可得到较佳的结果。本发明之预培养中所使用的培养基，是以胰酶大豆肉汁(Trypsic Soy Broth)或1％蛋白胨水(peptone water)作为样品预培养之培养基。对于受伤或者环境压力下之沙门氏菌，如果使用选择性培养基则可能会抑制菌体生长，例如Rappaport-Vassiliadis R10，此培养基含有孔雀绿、氯化镁及较低之pH值，因此有可能抑制猪霍乱沙门氏菌生长而造成假阴性反应。本发明中所使用之两种通用增殖培养基，即TSB或1％蛋白胨水，皆能使目标菌比在选择性培养基中更快速生长，而不影响PCR反应之进行及结果之检测。
本发明还提供一种检测猪霍乱沙门氏菌之PCR引物对，其中该引物对包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列。
本发明主要以猪霍乱沙门氏菌鞭毛第一相之fliC基因作为检测之目标基因，而设计出具有特异性之PCR引物对。猪霍乱沙门氏菌鞭毛第一相之fliC基因序列，见GenBank序列编号第X03394号，如SEQ ID NO3所示。而本发明之引物对包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列，其相对于猪霍乱沙门氏菌鞭毛第一相之fliC基因序列之位置如图1所示，长度分别为21及22bp，所合成之预期PCR产物大小为963bp。本发明之PCR引物对，其序列如下所示SEQ ID NO1(FlinC-F)5’-AAGGAAAAGATCATGGCACAA-3’SEQ ID NO2(FlinC-R)5’-GAACCCACCATCAATAACTTTG-3’该引物对之设计，主要根据National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)网站之GenBank数据库中收集沙门氏菌属，例如沙门氏伤寒杆菌(S.enterica serovar Typhi)、伤寒沙门氏菌(S.enterica serovarTyphimurium)、德比沙门氏菌(S.enterica serovar Derby)、都柏林沙门氏菌(S.enterica serovar Dublin)、猪霍乱沙门氏菌、维吉尼亚沙门氏菌(S.entericaserovar Virginia)、鸡沙门氏菌(S.enterica serovar Gallinarum)，及一些肠内杆菌属(Enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)及鼠疫杆菌(Yersinia pestis)等基因序列，再利用SeqWeb 2.1比对所收集之基因序列后，选择适当之序列设计作为PCR引物对，并进行一连串之实验确认其特异性。
此外，本发明还提供一种检测猪霍乱沙门氏菌之试剂盒，其包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列的引物。
利用本发明所揭示之PCR检测方法及检测试剂盒，可特别地适用于人类全血及其它临床样品、人畜粪便样品、猪肉样品及其它食品样品，及饲料样品中，可迅速地得到检测结果，并具有高灵敏度(1-9CFU)。此外，利用本发明之方法，其操作简易且迅速，包括目标菌预培养、细菌DNA提取、PCR扩增作用及电泳检测PCR产物，可在12至18个小时之内完成并得到结果。这些检测之操作及结果叙述于下述之实施例中。
下列之实施例用以举例说明，而非用以限定本发明之范畴。
实施例一、菌株来源本发明使用不同血清型之沙门氏菌分离菌株及其它属之菌株，包括肠内杆菌属，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、志贺氏菌(Shigella)及克雷伯氏菌(Klebsiella)属(如表1及表2所示)。该等菌株分别得自美国菌种中心(American Type Culture Collection(ATCC)，U.S.A.)；美国农业部(United State Department of Agriculture(USDA)，U.S.A.)；台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and ResearchCenter(BCRC)，Taiwan)；台湾国立屏东科技大学(National Ping-TongUniversity of Technologies，Taiwan)；美国疾病管制局(Center for DiseaseControl(CDC)，U.S.A.)；美国纽约市健康及精神卫生部(New York CityDepartment of Health and Mental Hygiene(NYC DOMHM)，U.S.A.)；台湾药物食品检验局(Bureau of Food and Drug Administration，Department ofHealth(BFDA)，Taiwan)；美国威斯康辛大学食品研究所(Food ResearchInstitute(FRI)，University of Wisconsin，U.S.A.)及台湾疾病管制局(Centerfor Disease Control(CDC)，Taiwan)。猪霍乱沙门氏菌分离菌株是由台湾国立屏东技术大学兽医所提供(Department of Veterinary Medicine，NationalPing-Tung University，Taiwan)的。亦选取猪霍乱沙门氏菌ATCC 13312作为参照菌株。所有菌株均在TSB中经培养、活化后，并将菌液与甘油混合后，置于-80℃冷冻储藏备用。
二、利用传统方法检测食品样品中之沙门氏菌属以Bacteriological Analytical Manual(BAM)(FDA)所述之方法，进行确认所检测之上述各种样品中是否含有沙门氏菌属之存在，作为与本发明利用PCR检测之对照。
三、PCR反应将试验菌株于TSB中以37℃培养过夜，接着转移100μl之菌液至新的3毫升TSB培养基中，于37℃下培养8小时。收集1毫升菌液并置于1.5毫升之微量离心管中，经加热100℃下10分钟破碎菌体。取10μl处理后之菌液(菌量约105CFU/10μl)加入预先混合好之PCR混合液，此混合液包含了10×缓冲反应液(100mM之Tris-HCl(pH8.8)、500mM之KCl及1％Triton X-100)、12.5pmole之SEQ ID NO1及SEQ ID NO2之寡核苷酸序列、200pmole之dNTP、2.5mM之MgCl2及0.4U ProZyme，PCR反应混合物之总体积为25μl。
PCR反应之条件设定及操作如下先以94℃进行变性10分钟，接着以94℃、30秒；55℃、30秒；72℃、1分钟进行35个循环之操作，最后再以72℃进行延伸7分钟。
PCR反应完成后，取PCR产物5μl，利用2％琼脂凝胶进行电泳，最后再以溴化乙锭染色，观察及照相后进行分析。
四、利用PCR检测人类全血样品中之猪霍乱沙门氏菌PCR方法已经使用于检测病源菌所引发之菌血症，例如大肠杆菌、霍乱沙门氏菌及肺炎链球菌等(Song et al.，1993；Zhang et al.，1995；Alexandreet al.，1999)。由于台湾猪霍乱沙门氏菌临床分离株大部分由病人血液中分离得到(Chiu et al.，1999)，因此本发明使用PCR方法检测人工污染之猪霍乱沙门氏菌之人类血液样品。
通过周边静脉穿刺法取健康人类血液，将血液置入无菌之EDTA管中，以避免血液凝结。取1毫升之全血样品，并添加100～108CFU/毫升菌量之猪霍乱沙门氏菌，接着将每个序列稀释后之菌液加入9毫升之TSB培养基并以37℃培养12小时。取200μl培养液，再以Blood and Tissue DNA分离试剂盒(购自富联有限公司)提取DNA后，吸取1μl之DNA，并以上述之PCR反应条件及操作进行PCR产物扩增。取PCR产物5μl，利用2％琼脂凝胶进行电泳，最后再以溴化乙锭染色，观察及照相后进行分析。
当利用本发明具特异性之PCR引物对，针对猪霍乱沙门氏菌于人类全血样品中进行分析时，结果显示并无非特异之条带出现。PCR方法之灵敏度检测所得之结果显示于图3的(D)，经过12小时之预培养，能检测至每毫升样品中1-9CFU。
五、利用PCR检测猪粪便样品中之猪霍乱沙门氏菌从台湾台中市的小型养猪场之健康成年猪，采得粪便。取0.1克之猪粪便与无菌水混合，加入菌量为100～107CFU/毫升之猪霍乱沙门氏菌，并使最后体积为1毫升。取1毫升之菌体混合液，放入9毫升之TSB培养基中，再以37℃培养12小时。经过12小时之培养后，取1毫升之培养液于1.5毫升之微量离心管中，经8000rpm离心5分钟后，倒出上清液，再以1毫升无菌水重新悬浮。将此再悬浮后之菌体混合液，直接加热至100℃维持10分钟，以进行菌体破碎。接着以4000rpm离心30秒后，取10μl之上层液，并以上述之PCR反应条件及操作进行PCR产物扩增。取PCR产物5μl，利用2％琼脂凝胶进行电泳，最后再以溴化乙锭染色，观察及照相后进行分析。
沙门氏菌存在猪粪便中之菌数可能少于每克粪便样品中10CFU，由于没经过预培养而直接以PCR分析所测得之灵敏度相当低，且存在于样品中之物质或培养液可能会抑制PCR之进行。因此上述之PCR扩增培养的步骤是必须的(Gray et al.，1996；Lin and Tsen，1999)。图3的(A)表示如果目标菌经过12小时预培养后，利用PCR方法检测，则可检测至每克粪便样品中1-9CFU。
六、利用PCR检测猪肉样品中之猪霍乱沙门氏菌于超级市场购买猪肉样品。取25克切过之猪肉或猪肝样品加入225毫升之1％Bacto蛋白胨水中，以均质机高速均质2分钟以上，直至该混合物成乳糜状。取1毫升已添加100～106CFU/毫升之猪霍乱沙门氏菌菌液之均质液，与9毫升均质液混合，并于37℃下培养12小时。取1毫升之培养液于1.5毫升之微量离心管，经8000rpm离心5分钟后，以1毫升无菌水重新悬浮。将此再悬浮后之菌体混合液，直接加热至100℃维持10分钟，以进行菌体破碎。接着以4000rpm离心30秒后，取10μl之上层液，并以上述之PCR反应条件及操作进行PCR产物扩增。取PCR产物5μl，利用2％琼脂凝胶进行电泳，最后再以溴化乙锭染色，观察及照相后进行分析。
图3的(B)表示了在猪肉样品中，经预培养步骤后所能检测之菌数为1-9CFU。虽然猪肉样品之内生菌可达每克猪肉样品1-9×102CFU，但是仍可达到预期之高灵敏度。利用BAM检测猪肉样品中之沙门氏菌属，结果显示猪肉中并无沙门氏菌属存在。
七、利用PCR检测饲料样品中之猪霍乱沙门氏菌沙门氏菌存在于饲料当中的菌量相当低，可能少于每克饲料中1CFU(D’Aoust and Sewell，1986)，然而，低浓度的菌量仍然能造成感染。在Slovakia，于动物饲料当中已有发表分离出猪霍乱沙门氏菌(World HealthOrganization Global Salm-Surv)。基于此论述，对于检测饲料当中的猪霍乱沙门氏菌即有其重要性。
不含沙门氏菌之猪用饲料，由中兴大学畜产系提供，饲料样品制备方法由Lfstrm et al.(2004)发表的方法改进。取25克饲料样品，加入225毫升之1％Bacto蛋白胨水中，以均质机高速均质2分钟以上，直至该混合物成乳糜状。取1毫升已添加100～106CFU/毫升猪霍乱沙门氏菌菌液之均质液，与9毫升均质液混合，并于37℃下培养12小时。取1毫升之培养液于1.5毫升之微量离心管，经8000rpm离心5分钟后，以1毫升无菌水重新悬浮。将此再悬浮后之菌体混合液，直接加热至100℃维持10分钟，以进行菌体破碎。接着以4000rpm离心30秒后，取10μl之上层液，并以上述之PCR反应条件及操作进行PCR产物扩增。取PCR产物5μl，利用2％琼脂凝胶进行电泳，最后再以溴化乙锭染色，观察及照相后进行分析。
图3的(C)显示当预培养12小时后，于每克饲料样品中可以检测菌数为1-9CFU。
八、本发明之PCR引物对之特异性分析本发明中共使用141株不同血清型之沙门氏菌及40株非沙门氏菌之菌株，包括了肠内杆菌属，例如志贺氏菌属、大肠杆菌及柠檬酸杆菌属等(如表1及表2所示)，作为上述PCR方法及传统方法之分析。所有97株猪霍乱沙门氏菌菌株，包括参照菌株ATCC 13312及分离株，皆能如预期地产生936bp之PCR产物。非猪霍乱沙门氏菌之菌株，均未产生假阳性结果，部分结果亦显示于图2的(A)中。
表1、以本发明之PCR引物对检测沙门氏菌分离株之特异性结果
a菌株来源如实例一所述。
bPCR反应结果，其中“-”表示不具PCR产物，“+”表示含有PCR产物。
c所有96株分离菌株均产生阳性反应。
表2、以本发明之PCR引物对检测非沙门氏菌分离株之特异性结果
a菌株来源如实例一所述。
bPCR反应结果，其中“-”表示不具PCR产物，“+”表示含有PCR产物。
九、本发明之PCR引物对之灵敏度分析以PCR方法检测之灵敏度，与目标DNA之数目、所使用之PCR引物对对于目标DNA黏合之效率，及目 NA制备之方法有相关(Way et al.，1993；Tsen et al.，1998；Wang and Yeh，2002)。以本发明之PCR引物对利用PCR方法检测纯菌之灵敏度，所得之结果如图2的(B)所示，可达到每个分析试验为102CFU。
经上述实施例及参考附图后，应明白本发明并非限于上述实施例中。所属技术领域的技术人员在不脱离本发明说明书及权利要求所定义之范围及精神之情况下，当可进行不同变化及改进，亦属本发明之范畴中。
序列表SEQUENCE LISTING<110>曾，浩洋<120>检测猪霍乱沙门氏菌之聚合酶链式反应方法<130>无<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1Aaggaaaaga tcatggcaca a21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gaacccacca tcaataactt tg 2权利要求
1.一种从样品中检测猪霍乱沙门氏菌存在之方法，其特征是包括(a)将样品与含有包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列混合；(b)将(a)所得之混合物进行聚合酶链式反应；及(c)检测该混合物中PCR产物之存在。
2.根据权利要求1所述之方法，其特征是该样品为人类全血样品或其它临床检体样品。
3.根据权利要求1所述之方法，其特征是该样品为人畜粪便样品。
4.根据权利要求3所述之方法，其特征是该样品为猪粪便样品。
5.根据权利要求1所述之方法，其特征是该样品为猪肉样品或其它食品样品。
6.根据权利要求1所述之方法，其特征是该样品为饲料样品。
7.根据权利要求1至6任一项所述之方法，其特征是该样品于胰酶大豆肉汁或1％蛋白胨水中进行预培养。
8.一种检测猪霍乱沙门氏菌之PCR引物对，其特征是该引物对包括具有如SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示之寡核苷酸序列。
9.一种检测猪霍乱沙门氏菌之试剂盒，其特征是包括具有权利要求8所述之PCR引物对。
全文摘要
本发明揭示一种用于快速检测猪霍乱沙门氏菌之方法。本发明还揭示一种用于检测猪霍乱沙门氏菌之PCR引物对及含有该引物对之试剂盒。本发明之PCR检测方法可特别地适用于人类全血及其它临床样品、人畜粪便样品、猪肉样品及其它食品样品及饲料样品中，其可迅速得到检测结果，并具有高灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK1912136SQ20051008985
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者曾浩洋, 邱采新 申请人:曾浩洋