专利名称：稳定化的磷酸酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有提高的稳定性(优选热稳定性)的固体或液体磷酸酶制剂，所述稳定性的提高是通过添加稳定剂获得的。
本发明涉及将磷酸酶(优选植酸酶)配制到含有碳水化合物(如淀粉)的颗粒和/或液体制剂中，并涉及制备这类含酶颗粒和液体制剂的方法。这些(可食用)颗粒和液体制剂可以用于动物饲料和/或人营养物。含酶颗粒和液体制剂表现出提高的储存和加工稳定性。
背景技术：
在人营养物或动物(如家畜)饲料中使用磷酸酶已经几乎成为普遍的作法。一般通过在工业酶生产者操作的大规模发酵罐中培养微生物来产生这些酶。在发酵的最后一般对得到的“发酵液”进行一系列的过滤步骤，以将生物质(微生物)与(溶液中)所需的酶分开。然后可将酶溶液以液体出售或加工成干制剂。
饲料业和食品业中以商业规模使用含有磷酸酶(优选植酸酶)的酶液体和干制剂。可以在造粒后将液体制剂加入饲料或食物中，以避免酶在造粒过程中可能出现的热失活。然而最终饲料或食品制剂中的酶量一般很小，使酶很难在饲料或食品中匀质分布，而且众所周知，液体甚至比干成分更难于混合。此外，在造粒后向食品中加入液体需要专门的(昂贵)设备，目前在多数食品制造厂中(由于额外的成本)并不具备。甚至在使用含有酶的液体制剂时，这些制剂的储存稳定性也经常成为问题。
另一方面，磷酸酶(特别是植酸酶)的干制剂具有在造粒中酶热失活的缺点。饲料和食品工业中优选的生产流程包括蒸汽造粒，其中在造粒前对饲料或食品进行蒸汽注射。在随后的造粒步骤中将饲料或食品挤压过基质或模具，并将得到的长条切成各种长度的合适小团。造粒前的含水量一般在10％和20％之间。在该方法中，温度可能升至60-95℃。高含水量和高温的组合效应对多数酶是有害的。在其他类型的形变热处理(如挤压和膨胀)中也要面对这些缺点。
许多酶生产商已经开发出了替代的制备方法，以尝试提高干和液体酶产品在造粒和储存中的稳定性。
EP 0 758 018 A1公开了通过加入无机盐提高干酶制剂的加工和储存稳定性的方法。
GB 2 167 758公开了粒化酶的方法和含有酶的颗粒组合物，所述颗粒组合物含有以重量计1％到35％的酶和以重量计从0.5％到30％的合成纤维片或浆。
EP 1 069 832 A1(WO 00/47060)公开了制备含酶颗粒的方法，其中将含有酶的水成液与固体载体和任选的添加剂成分混合并机械加工成颗粒、干燥然后用聚乙二醇包衣。
EP 858 266(WO 97/16076)公开了适合用于生产动物饲料组合物的含酶微粒制剂。
EP 862 623 A1(WO 97/12958)公开了平均颗粒大小从约20到400微米的微粒酶组合物。
所引用的参考文献均未公开用本文描述的树胶或动物蛋白质稳定的含有磷酸酶的制剂。
DE 1 958 104描述了制备适于洗涤剂和洗衣组合物的含酶颗粒的方法，其中使用无机或有机酸的碱盐作为载体。
DE 2 137 043和DE 2 137 042公开了适于洗涤剂组合物的含酶组合物，其中载体由无机盐组成。
EP 716 685公开了适于掺入洗涤剂和清洁组合物的多酶颗粒，所述颗粒含有酶和无机和/或有机载体材料。
WO 00/36927公开了产生含有酶并适于喂养动物的颗粒的方法。
WO 03/059087描述了制备含酶颗粒的方法，其中将含水液体、任选的添加物与固体载体和/或添加剂成分一起加工成颗粒、干燥并随后用聚烯烃包被。
WO 03/059086描述了制备含酶颗粒的方法，其中将含水液体、任选的添加物和固体载体和/或添加剂成分一起加工成颗粒、干燥并随后用含有疏水物质(优选聚烯烃)颗粒的分散系包被。
就饲料应用而言，为了避免在制备(如喷雾干燥、粒化)和饲料加工过程(如造粒、挤压、膨胀)中可能出现的问题，稳定(优选热稳定)的磷酸酶是引起广泛关注的，在所述过程中瞬时高温(高达80-120℃)、潮湿和剪切应力可能影响蛋白质的结构并引起不希望的活性丧失。
通常为了多种目的向饲料或食品制剂中加入磷酸酶。在食品应用中，在例如焙烤或酿酒过程中加入磷酸酶。在饲料应用中，磷酸酶(特别是植酸酶)的功能常常是(例如通过降低消化物粘度或降低某些饲料化合物的抗营养效应)提高饲料的转换率。磷酸酶(优选植酸酶)还可用于例如降低粪肥中对环境有害化合物的量。
在所有这些各种应用中，这些酶经常会面临热攻击(如暴露于热、潮湿或温度)，这可能引起酶的部分或完全失活。
尽管在饲料中以植酸盐磷的形式存在大量的磷酸盐，但是单胃动物(如猪和家禽)缺乏利用这种形式的磷酸盐的能力。植酸的碱或无机碱盐主要天然存在于谷类中。由于单胃动物不能利用这种形式的磷酸盐，因此在动物饲料中加入无机磷酸盐是一种普遍作法。
另一方面，已知在植物和一些微生物中存在称为植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶)的酶。由于可以通过发酵产生植酸酶，因此在本领域已经了解使用植酸酶作为动物饲料添加剂以通过从植酸(肌醇六磷酸)中释放无机磷酸盐来提高植物材料的营养价值。由于动物能够利用使用植酸酶从植酸中释放的磷酸，因此通过在动物饲料中加入植酸酶可以降低环境中磷污染的水平。
Gist-Brocades的国际专利申请WO 93/16175(EP 626 010)描述了稳定的植酸酶液体制剂。其建议使用尿素和水溶性多元醇作为稳定剂，其中提到了山梨醇、甘油和分子量6000的聚乙二醇。
Hoffmann-La Roche的欧洲专利申请EP-A1 0 969 089描述了含有植酸酶和至少一种稳定剂的稳定的酶制剂，所述稳定剂选自a)含有5个碳原子的多元醇，优选C5糖，更优选木糖醇或核醣醇；b)分子量600-4000Da的聚乙二醇；c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐；d)羧甲基纤维素和e)海藻酸钠。它还描述了通过与戊二醛的化学反应进行交联或通过b)用高碘蛋白氧化并随后加成己二酸二腙进行交联来稳定植酸酶制剂。
WO 98/54980描述了含有植酸酶的颗粒，WO 98/55599描述了高活性植酸酶液和含有它们的饲料制品。
尽管本领域已有不同的方法，但是仍然需要适于人和/或动物营养物并在加工、造粒和储存中表现增强的稳定性的稳定化的磷酸酶制剂。该制剂应该易于获得，并易于与常见食品和/或饲料成分相容。此外，制剂(特别是固体制剂)应该易于加工(如提供低粉尘特性)，易于在所需基质中分散或混合。
提供替代的稳定剂以及改善磷酸酶特别是植酸酶的稳定性(优选热稳定性)是本发明的目的，其中稳定性定义为在多种条件下保持活性的能力。稳定性的这一方面涉及酶的整个生存周期，包括产生(发酵、下游加工和配制)、分配(运输和储存)和最终应用(饲料和/或食品的产生和储存)。对于具有商业价值的酶(如植酸酶)，能经受在多种饲料和/或食品加工(如造粒、挤压和膨胀)中达到的高温度(高达80-120℃)和高湿度并在加入饲料和/或食品后在储存(特别是在长期储存)中保持稳定是很重要的。由于最终制剂中稳定剂的量限制了可加入含酶制剂的其他成分，因此提供能以比本领域已知的稳定剂更少的量使用的稳定剂是本发明的另一目的。提供可以特别用于酶混合物的稳定剂是本发明的另一目的。如果从多于一种发酵液中制备酶制剂，那么可以加入到最终制剂中的稳定剂的量是有限的。如果在终产物中需要高的酶浓度并因此可以加入最终制剂中的稀释剂的量有限时特别需要考虑这一点。在本发明的另一方面中，如果使用酶混合物，稳定剂也应优选不仅稳定一种酶，而是稳定混合物中的所有酶。
本发明中所使用的术语“稳定性”涉及工业酶的所有规格，包括活性、特异性、储存期稳定性、机械稳定性、微生物稳定性、毒性等方面、化学组成和物理参数如密度、粘度、潮解性以及颜色、气味和粉尘。本发明优选的方面涉及酶(优选磷酸酶和/或糖苷酶)在配制和饲料和/或食品处理方法(如造粒、挤压和膨胀)中针对热失活的稳定性。
广泛使用磷酸酶特别是植酸酶的主要障碍是这些酶在饲料和/或食品处理方法中抵挡失活所需的热稳定性(80-120℃)的限制。饲料和/或食品应用中目前可用的多数工业磷酸酶对热失活的内在抗性不足。作为分子生物学方法的代替或补充，本发明通过加入不同的添加剂增强磷酸酶特别是植酸酶的稳定性(优选热稳定性)。
发明内容
在本发明的第一个方面中提供了含有至少一种磷酸酶和至少一种稳定剂的稳定化的固体或液体酶制剂，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
术语“酶制剂”包括其中的磷酸酶(优选植酸酶)可商品化的所有液体和固体制剂。优选地，这些制剂中酶的来源为得自发酵液的粗液体制剂。为了制备本发明的液体酶制剂，可以直接向发酵液中加入所选的稳定剂，或者可通过例如过滤或超滤纯化发酵液，然后在过滤步骤以后再加入稳定剂。
为得到稳定的(优选热稳定的)固体制剂，可在所选定稳定剂的存在下使酶喷雾干燥或粒化。固体制剂优选含有少于15％(w/w)、优选少于10％(w/w)、特别是少于8％(w/w)的水。
在本发明优选的实施方案中，稳定的酶制剂为固体，优选为颗粒形式。
本发明的另一方面提供了制备含有磷酸酶的颗粒的方法，该方法包括加工至少一种磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚体的固体载体和至少一种稳定剂，其中所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。本发明的另一方面提供了通过这类方法得到的含酶颗粒。
在本发明的另一方面中提供了包含至少一种磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚体的固体载体和至少一种稳定剂的颗粒，其中所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
在本发明的另一方面中提供了包含至少一种磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚体的固体载体和至少一种稳定剂的颗粒，其中所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，其中包被了颗粒。
通过本方法得到的含有磷酸酶的颗粒寻求解决或至少缓解本领域面临的问题。因此本发明可提供制备颗粒形式的稳定酶制剂的方法，其中使用碳水化合物作为载体。载体可用为微粒或粉末形式。
固体载体的至少15％(w/w)由可食用碳水化合物多聚体(如淀粉)组成。然而，优选固体载体的至少30％(w/w)含有碳水化合物，最优为至少40％(w/w)。有利地，固体载体的主要组分为碳水化合物(如淀粉)，例如大于50％(w/w)，优选为至少60％(w/w)，适当地为至少70％(w/w)，且最优为至少80％(w/w)。这些重量百分比是基于最终干颗粒中非酶组分的总重量。
应该选择可食用碳水化合物多聚体使其可被饲料或食品各自的预设动物或人食用，并优选至少可被部分消化。多聚体优选含有葡萄糖(如含有葡萄糖的多聚体)或(C6H10O5)n单位。碳水化合物多聚体优选含有α-D-吡喃葡萄糖单位、直链淀粉(线性(1→4)α-D-葡聚糖多聚体)和/或支链淀粉(带有α-D-(1→4)和α-D-(1→6)键的分枝状D-葡聚糖)。淀粉是优选的碳水化合物多聚体。可以作为淀粉的代替或补充使用的其他合适的含有葡萄糖的多聚体包括α-葡聚糖、β-葡聚糖、果胶(如原果胶)和糖原。还考虑了这些碳水化合物的衍生物(如醚和/或酯)，尽管凝胶淀粉最好避免并因此不包括在内。合适的是，碳水化合物多聚体是水溶性的。
合适的碳水化合物多聚体为玉米淀粉、马铃薯淀粉和大米淀粉。然而，也同样可以使用得自其他(例如植物，如蔬菜或作物)来源的淀粉，如树薯粉、木薯、小麦、小黑麦、玉米、西米、黑麦、燕麦、大麦、甘薯、高粱或竹芋的淀粉。类似的，本发明可以使用天然或修饰(如糊精)类型的淀粉。碳水化合物(如淀粉)优选含有很少或不含蛋白质，如少于5％(w/w)，如少于2％(w/w)，优选少于1％(w/w)。不管哪种类型的淀粉(或其他碳水化合物多聚体)，其都应该是可用于动物饲料的形式，换言之即可食用或至少可部分消化的形式。
可以在加工中加入水。在本发明的另一个实施方案中，在加工后接着干燥颗粒。应该理解，在一个实施方案中，不管在加工中是否加入了水，都可以干燥颗粒。
优选以含酶(优选水成)液体的形式提供酶和水，如能与固体载体混合并吸收到载体上的溶液或浆。将含酶液体和载体在混合时或混合后加工成颗粒，然后可以干燥所述颗粒。使用碳水化合物载体可以吸收大量的含酶液体(从而吸收大量的酶)。可以使用该混合物形成易于加工成颗粒(如可被挤压)的可塑糊剂或无弹性生面团。
在本发明的方法中，酶和水可以在接触固体载体前存在于同一组合物中。在这一方面中可以提供含酶的水成液体。该液体可以是来自发酵方法的溶液或浆。该发酵方法一般是产生酶的方法。发酵方法可以得到含有(产生所需酶的)微生物和水溶液的发酵液。一但(如通过过滤)与微生物分离，水溶液就可以成为本发明中所使用的含酶水成液。因此在优选的实施方案中含酶水成液为滤液，特别是来自导致产生酶的发酵方法的滤液。取决于从发酵液中分离酶所使用的方法，酶也可以存在于渗余物中。
可以吸收到载体上的含酶液体的量(因此也是酶的量)通常受限于可以吸收的水量。加入固体载体的液体量优选为使(水成)液体中(基本)所有的水被固体载体中存在的碳水化合物吸收。
在提高的温度下，淀粉和其他碳水化合物多聚体在膨胀中能吸收更大量的水。出于这个原因，需要碳水化合物多聚体能够很好的吸收水(或含酶水成液)。例如，玉米淀粉在60℃下可吸收多达三倍于其重量的水，在70℃下则多达十倍。因此本发明考虑使用较高的温度以吸收更大量的含酶液体，事实上在处理热稳定酶时是特别优选的。因此对于这些酶可以在提高的温度(如高于环境温度)下混合固体载体和液体(或酶和水)和稳定剂，如高于30℃，优选高于40℃且最优为高于50℃。另外，可以在此温度下提供液体。
然而，一般优选较低温度(如室温)下的非膨胀条件。这可以使在较高温度下酶的(热敏感)不稳定性引起的活性损失最小化。混合酶和水的合适温度为从10到60℃，如10到50℃，优选20到40℃，优选20到25℃。
本发明中使酶、任选的水(如含酶液体)、稳定剂和固体载体的混合物成为颗粒的机械加工(换言之即粒化)可以使用食品、饲料和酶制剂方法中常用的已知技术。这可能包括膨胀、挤压、滚圆、造粒、高剪力粒化、滚筒粒化、流化床团聚或其组合。一般通过输入的机械能表征这些方法，如螺杆的驱动、混合机械的旋转、造粒设备的滚动机制的压力、通过旋转流化床团聚器的底板的颗粒运动或通过蒸汽的颗粒运动或它们的组合。这些方法使(如粉末形式的)固体载体与酶和任选的水(如含水液体(水溶液或浆))、稳定剂混合并随后粒化。
另外，可以将固体载体与酶(如粉末形式的)和稳定剂混合，然后可以加入(可作为粒化液的)任选的水，如液体(或浆)。
在本发明的另一个实施方案中，通过将含酶液体喷雾或包被到载体上形成颗粒(如团块)，所述含酶液体事先与稳定剂(如在流化床团聚器中)混合。由此得到的颗粒可以包括如在流化床团聚器中产生的团块。
含酶液体、固体载体和稳定剂的混合还优选地包括捏合混合物。这可以提高混合物的可塑性以便于粒化(如挤压)。
在优选的实施方案中，通过挤压(优选通过低压下的挤压)形成颗粒。该法的优点为被挤压的混合物的温度不会提高或仅轻微提高。低压挤压包括如在Fuji Paudal笼状或球面挤压机中的挤压。挤压可以自然产生颗粒(可以在通过模具后折断颗粒)，或者可以使用切割器。
在干燥前，颗粒合适的含水量为从15％到50％，如20％到40％，如从25％到30％，优选33％到37％。在干燥前，颗粒的酶含量可以从1％到85％，特别是从1％到70％，如2％到60％，优选从1％到50％，优选2％到25％，如3％到15％，如5％到12％(如至少50,000ppm)(均以基于颗粒总重量的重量百分比计算)。
然后可以将得到的颗粒在如滚圆机(如MARUMERISERTM机)中修圆(如滚圆)和/或压实。如果要干燥得到的颗粒，优选在干燥前进行滚圆。可以在干燥前滚圆颗粒，因为这可以减少在终颗粒中形成粉尘和/或可以利于颗粒的任何包衣。
可以接着在如流化床干燥器中干燥颗粒，或者在流化床团聚的情况下可立即(在团聚器中)干燥以得到(干燥的固体)颗粒。技术人员可以使用食品、饲料或酶工业中已知的其他干燥颗粒的方法。颗粒适当地为易流动的。优选在从25到60℃(如30到50℃)的温度下进行干燥。干燥可以持续10分钟到若干小时。所需的时长当然取决于待干燥的颗粒量。
干燥颗粒以后，得到的干燥颗粒优选具有以重量计从3％到10％(如5％到9％)的含水量。
在本发明优选的实施方案中提供了包括如下步骤的方法a)将含有酶的水成液与固体载体以及稳定剂混合；b)机械加工a)中得到的混合物以获得含有酶的颗粒；和c)干燥b)中得到的含酶颗粒。
其中所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
在本发明的另一实施方案中包被了颗粒。可以对颗粒使用包衣以赋予额外的(如有利的)特征或性质，如低含尘量、颜色、在外周环境中保护酶、在一种颗粒中具有不同的酶活性，或这些组合。可以经过或不经过预先干燥而包被颗粒。可以用脂肪、蜡、多聚体、盐、油膏和/或软膏或含有(另一种)酶的包衣(如液体)或它们的组合包被颗粒。显然如果需要的话可以使用多层(不同的)包衣。可以用多种已知方法将包衣应用于颗粒，包括使用流化床、高剪力制粒机、混合制粒机或Nauta混合机。
在一个实施方案中，(优选在干燥后，如残留水分以重量计小于10％)用适于饲料的有机多聚体包被颗粒，包括步骤a)在流化床中用有机多聚体的熔化物、溶液或分散系喷雾颗粒，或用有机多聚体在流化床中进行粉末包衣；或b)在混合机中通过熔化有机多聚体包被颗粒，或用有机多聚体的熔化物、溶液或分散系喷雾粗颗粒或用有机多聚体进行粉末包衣。
且必要时的后干燥、冷却和/或从粗级分中释放各自得到的多聚体包衣的颗粒。
根据本发明方法优选的实施方案，将颗粒置于流化床中，液化并通过喷雾有机多聚体的水或非水(优选水)溶液或分散系进行包衣。就该目的而言，使用尽可能高浓度并仍可喷雾的液体，如含有以重量计从10％到50％的至少一种多聚体的水或非水溶液或分散系，所述多聚体选自a)聚乙二醇，特别是平均分子量从约400到15000(如从约400到10000)的聚乙二醇；b)平均分子量从约4000到20000(如从约7700到14600)的聚烯烃氧化物多聚体或共聚物，特别是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；c)平均分子量从约7000到1000000(如从约44000到54000)的聚乙烯吡咯烷酮；d)平均分子量从约30000到100000(如从约45000到70000)的乙烯替砒咯烷酮/乙酸乙烯共聚物；e)平均分子量从约10000到200000(如从约20000到100000)的聚乙烯醇；和f)平均分子量从约6000到80000(如从约12000到65000)的纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素。
根据另一优选的方法变体，为了进行包衣，使用可喷雾的水或非水溶液或分散系，其含有重量百分比从10到40(优选重量百分比从约20到35)的至少一种选自以下的多聚体g)平均分子量从约100000到1000000的烷基(甲基)丙烯酸盐多聚体和共聚物，特别是丙烯酸乙酯/异丁烯酸甲酯共聚物和丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物；和
h)平均分子量从约250000到700000的聚乙酸乙烯酯，可以用聚乙烯吡咯烷酮稳定化。
一般基于以下原因优选水溶液或水分散系不需要使用特殊的措施或回收溶剂；一些包衣材料优选以水溶液或分散系提供。
然而，在特殊情况下，使用非水溶液或分散系也可能是有利的。包衣材料非常便于溶解或可以有利地分散大部分的包衣材料。以这种方式可以喷雾具有高固体含量的喷雾液，从而缩短加工时间。非水溶剂较低的蒸发焓也使加工时间缩短。
将(含有或不含有惯用的分散剂的)上述多聚体分散到水或非水(优选水)液相中得到可根据本发明使用的分散系。优选以以下方式喷雾多聚体溶液或分散系将颗粒装入流化床装置或混合器中，并在加热装料的同时将喷雾材料喷雾。在流化床装置中通过与加热的干燥气体(常为空气)接触提供能量，在混合器中则通过与加热的壁和适当时加热的混合工具接触提供能量。如果能使喷雾材料以高干物质含量喷雾，则预热溶液或分散系可能是有利的。使用有机液相时，回收溶剂是有利的。包衣过程中产物的温度应该在从约35℃到50℃的范围内。原则上可以在流化床装置中以底部喷雾方法(喷嘴在气体分布器板上并向上喷雾)或顶端喷雾方法(从顶部向流化床喷雾包衣)进行包衣。
合适的聚亚烷基二醇a)的实例为聚丙二醇，特别是不同摩尔质量的聚乙二醇，例如可以商品名Lutrol E 4000和Lutrol E 6000从BASF AG获得的PEG 4000活PEG 6000。
在优选的实施方案中，如本文引入作为参考文献的WO 00/47060中第4页第11到14行和第10页28行到第11页第9行中所述进行聚亚烷基二醇包衣。
上述多聚体b)的实例为聚环氧乙烷和聚环氧丙烷、环氧乙烷/环氧丙烷混合多聚体和由聚环氧乙烷和聚环氧丙烷嵌段组成的嵌段共聚物，如可以商品名Lutrol F68和Lutrol F127从BASF AG获得的多聚体。对于a)和b)的多聚体，优选有利地使用上至以基于溶液总重量约50％(如从约30％到50％)的高浓度溶液。
上述多聚体c)的实例为聚乙烯吡咯烷酮，如BASF AG以商品名Kollidon或Luviskol所销售的。对于这些多聚体，优选有利地使用固体含量基于溶液总重量从约30％到50％的高浓度溶液。
上述多聚体d)的实例为BASF AG以商品名Kollidon VA64销售的乙烯替吡咯烷酮/乙酸乙酯共聚物。可以特别有利地使用基于溶液总重量从约30％到40％的这些共聚物的高浓度溶液。
上述多聚体e)的实例为如Hoechst以商品名Mowiol销售的产品。可以有利地使用固体含量以重量计从约8％到20％范围内的这些多聚体的溶液。
合适的多聚体f)的实例为羟丙基甲基纤维素，如Shin Etsu以商品名Pharmacoat销售的。
上述多聚体g)的实例为烷基(甲基)丙烯酸多聚体和共聚物，其中烷基基团含有1到4个碳原子。合适的共聚物的具体实例为丙烯酸乙酯/丙烯酸甲酯共聚物，如以BASF AG以商品名Kollicoat EMM 30D所销售的或Rohm以商品名Eutragit NE 30D所销售的；还有异丁烯酸/丙烯酸乙酯共聚物，如BASF AG以商品名Kollicoat MAE 30DP或Rohm以商品名Eutragit 30/55销售的。可以根据本发明加工这种类型的共聚物，如重量百分比从10到40的分散系。
上述多聚体h)的实例为用聚乙烯吡咯烷酮稳定的聚乙酸乙烯酯分散系，如BASF AG以Kollicoat SR 30D销售的(分散系的固体含量以重量计从约20％到30％)。
根据本发明方法另一优选的实施方案，可以将颗粒装入流化床中并进行粉末包衣。优选使用选自平均分子量从约6000到80000的羟丙基甲基纤维素(HPMC)粉末与增塑剂的混合物进行粉末包衣。适合粉末包衣的材料还有可以以粉状形式存在并且不能以熔化物或高浓度溶液使用的所有其他包衣材料(如HPMC的情况)。
优选以向装入流化床的颗粒中连续加入包衣材料的方式进行粉末包衣。包衣材料的细微粒(微粒大小在从约10到100μm范围内)位于粗颗粒相对粗糙的表面上。通过喷入增塑剂溶液将包衣材料微粒粘在一起。合适的增塑剂的实例为聚乙二醇溶液、柠檬酸三乙酯、山梨醇溶液、石蜡油等。为了去除溶剂，优选在轻微加热下进行包衣。在这种情况下产物温度低于约60℃，例如从约40℃到50℃。原则上也可以在混合器中进行粉末包衣。在这种情况下，加入粉末混合物并将增塑剂也通过喷嘴注入。通过混合器的壁和适当时通过混合工具提供能量进行干燥。同在流化床中包衣和干燥一样，这时也必须保持低的产物温度。
根据本发明方法另一个优选的实施方案，将颗粒装入流化床或混合器并用至少一种选自以下的多聚体的熔化物进行包衣a)聚亚烷基二醇，特别是平均分子量从约1000到15000的聚乙二醇；和b)平均分子量从约4000到20000的聚亚烷基氧化物多聚体或共聚物，特别是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
优选以将待包衣的颗粒装入流化床装置的方式在流化床中进行熔化物包衣。在外部容器中熔化包衣材料并(例如通过可加热管)泵入喷雾嘴。加热喷嘴气体是有利的。必须以能使包衣材料容易分布到颗粒表面并使其均匀包衣的方式设定喷雾率和熔化物注入的温度。可以在喷雾熔化物之前预热颗粒。对于包衣材料具有高熔点的情况，必须注意不能将产物的温度设定得太高，以使酶活性的损失减到最少。产物的温度应该在约35℃到50℃的范围内。原则上也可以通过底部喷雾方法或顶部喷雾方法进行熔化物包衣。可以用两种不同方法在混合器中进行熔化物包衣。将待包衣的颗粒装入合适的混合器并将包衣材料的熔化物喷入混合器中，或者也可以将固体形式的包衣材料与产物混合。通过由管壁或混合工具提供的能量将包衣材料熔化并覆盖粗颗粒。必要时，可以间或加入一些脱模剂。合适的脱模剂为例如水杨酸、滑石粉、硬脂酸盐和磷酸三钙。
用于包衣的多聚体溶液、多聚体分散系或多聚体熔化物可以含有其他添加物，如微晶纤维素、滑石粉或高岭土。
在本发明的另一实施方案中，可以如WO 03/059087中第2页第19行到第4页第15行中所述用聚烯烃包衣颗粒。
在本发明的另一实施方案中，可以如WO 03/059086中第2页第18行到第4页第8行中所述用含有分散于适当溶剂中的疏水物质微粒的分散系对颗粒进行包衣。在这种包衣的优选实施方案中使用聚烯烃，特别优选聚乙烯和/或聚丙烯。
颗粒优选具有相对狭窄的粒径分布(如为单分散的)。这可以便于使动物饲料中颗粒内的酶匀质分布。本发明的方法旨在产生具有窄粒径分布的颗粒。然而，必要时可以在方法中包括额外的步骤(如筛选)以进一步缩小粒径分布。合适的颗粒的平均粒径分布在100μm和2000μm之间，优选在200μm和1800μm之间，优选在300μm和1600μm之间。微粒可以是不规则的(但优选规则的)形状，如近似为球形。在优选的实施方案中颗粒的平均粒径分布在500和2000μm之间，优选在500和1800μm之间，优选在600和1000μm之间。可以使用Mastersizer S(MalvernInstruments GmbH的机器，序列号32734-08)测定平均粒径分布。通过D(V，0.1)，D(v，0.5)和D(v，0.9)以及分布D(4，3)的平均粒径值来表征平均粒径分布。可以通过筛选(例如用Fa.Retsch的Typ Vibro VS 1000筛选机)测定平均粒径分布。
因此本发明优选的方法包括a)混合(任选的)水、酶、稳定剂和含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚体的固体载体，如将固体载体与至少一种稳定剂和含酶的水成液混合；b)任选地捏合得到的混合物；c)(如通过机械加工)粒化混合物以得到含酶颗粒，如使用粒化机或通过挤压；d)任选地滚圆颗粒；e)干燥得到的颗粒以得到含酶颗粒。
其中所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
在优选的实施方案中进一步包被步骤e)中得到的含酶颗粒。
在优选的实施方案中，在整个过程中需要使酶所暴露的最高温度保持低于80℃。
水或含酶液体可以含有除磷酸酶之外的一种或多种酶。酶(包括磷酸酶)通常为微生物来源，如从微生物发酵获得。通常酶为活性形式(如具有催化或生理活性)。液体优选为能产生具有所需活性水平的颗粒的浓缩形式，如超滤液(UF)或渗余物。
在本发明的另一个方面中提供了含有至少一种磷酸酶和至少一种稳定剂的液体制剂，其中稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物。
可以使用食品、饲料和酶制剂方法中普遍使用的技术制备液体制剂。在一个实施方案中，可以向酶所溶解或分散的液体中直接加入稳定剂。在本发明的另一个实施方案中，首先将稳定剂溶于额外的水中，任选地可调整所得溶液的pH，然后将如此得到的溶液与酶或酶浓缩物或液体酶制剂混合。任选调整如此得到的混合物的pH。可以用有机或无机盐和/或酸调整pH。
在优选的实施方案中，液体制剂含有至少一种磷酸酶或植酸酶。
稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物。应该理解，稳定剂可以选自一种试剂(如仅一种树胶，如半乳甘露聚糖)或者由混合物如动物蛋白质(如白蛋白)和一种树胶(如黄蓍胶)的混合物或两种或三种或更多不同动物蛋白质或树胶的混合物组成。
在优选的实施方案中，稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)或它们的混合物。
在优选的实施方案中，稳定剂选自黄蓍胶、半乳甘露聚糖、黄素和/或豆角胶。
在一个实施方案中稳定剂为琼脂。琼脂(或琼脂-琼脂)为来自红藻(Rhodophyceae)的杂多糖。其注册为CAS No.9002-18-0。琼脂-琼脂以E 406注册为食品添加剂。
在一个实施方案中稳定剂为藻胶。术语“藻胶”包括海藻酸(CAS No.9005-32-7)和海藻酸盐(海藻酸的盐)。藻胶是来自褐藻(Phaeophyceae)的多糖。海藻酸以E 400注册；海藻酸钠注册为CAS No.9005-38-5、E 401，海藻酸钾为E 402，海藻酸铵为E 304，海藻酸钙为E 404，glykolalginate为E 405。
在一个实施方案中稳定剂为角叉菜胶。角叉菜胶是来自红藻(Rhodophyceae)的多糖。
在一个实施方案中稳定剂为红藻胶(＝丹麦琼脂)。红藻胶是来自红藻(Furcellaria fastigiata)的多糖(CAS No.9000-21-9)。
在一个实施方案中稳定剂为印度胶。印度胶是来自Anogeissus latifolia树(使君子科，Combretaceae)树皮渗出物的多糖。其注册为CAS No.9000-28-6。
在一个实施方案中稳定剂为黄蓍胶。黄蓍胶是来自黄芪(Astragalus)科(Fabaceae科)(特别是来自Astragalus gummifer)的茎和灌木枝的渗出物的名称。其注册为CAS No.9000-65-1，以E 413注册为食品添加剂。
在一个实施方案中稳定剂为gum karya(＝gum sterculia)。gum karya是Sterculia urens树渗出物的名称。
在一个实施方案中稳定剂为半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖是来自guar豆(Cyamopsis tetragonobolus)的多糖。
在一个实施方案中稳定剂为豆角胶(＝角豆胶、carubin)。豆角胶是提取自角豆树(Ceratonia siliqua)种子的多糖。其以E 410注册为食品添加剂。
在一个实施方案中稳定剂为罗晃子胶。罗晃子胶是提取自罗晃子树(Tamarindus indica L.)果实的接地种子的多糖。
在一个实施方案中稳定剂为阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖是来自L-阿拉伯糖和D-半乳糖的多糖。其注册为CAS No.9036-66-2。
在一个实施方案中稳定剂为黄素(胶)。黄素是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的微生物阴离子多糖，CAS No.11138-66-2。其以E 415注册为食品添加剂。
在一个实施方案中稳定剂为至少一种动物蛋白质。在优选的实施方案中稳定剂为至少一种选自家禽、牛、猪、鱼的蛋白质的动物蛋白质或其混合物。
本发明的动物蛋白质可以得自任何动物(如从家禽、牛、猪或鱼)。动物包括非反刍动物或单胃动物(猪、飞禽、家禽、水生动物，如鱼)、反刍动物(牛或羊，如奶牛、绵羊、山羊、鹿、小牛、羔羊)。家禽包括小鸡、母鸡、火鸡、鸭和鹅。
可以从动物的任何部分(如也可以从乳)分离动物蛋白质。由于动物蛋白质总是分离自动物，其可以含有以重量计多至20％的非蛋白质组分，优选多至15％，优选多至10％，特别是多至5％。本发明的动物蛋白质也可以是来自动物蛋白质的完全或部分水解产物。
在优选的实施方案中，动物蛋白质选自明胶、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
适合作为稳定剂的动物蛋白质包括但不仅限于酪蛋白、白蛋白、乳蛋白质、明胶。
明胶(CAS No 9000-70-8，EINECS 232-554-6)可以例如从Stoess以100BL A的名称得到。
酪蛋白(CAS No.900-71-9，EG-Nr.232-555-1)可以例如从Merck得到。
白蛋白是包括来自多种来源的血清蛋白质的术语。其包括乳白蛋白(来自乳)、卵白蛋白(来自卵)、血清白蛋白，特别是牛血清白蛋白。
通常以基于待加工的混合物(对于固体制剂)或基于终液体制剂总重量0.01％到50％的量，如1％到30％、如1％到20％，如3％到10％的量加入稳定剂。可以将稳定剂与载体或酶混合或直接将它们加入液体制剂中。
在其他实施方案中可以向酶制剂中掺入额外成分(如作为加工助剂)，以进一步提高造粒稳定性和/或储存稳定性。下文讨论了大量的这些优选的添加剂。
稳定化的固体或液体酶制剂中可以包含盐，例如与固体载体或水一起。优选地(如EP-A-0,758,018中所建议的)，可以加入能提高加工和储存稳定性的无机盐。优选的无机盐为水溶性的。它们可以包括二价阳离子如(特别是)锌、镁和钙或一价阳离子，如钠或钾。尽管可以使用导致水溶性的其他阴离子(如碳酸根)，但是硫酸根是最常用的阴离子。盐可以以固体形式(如向混合物中)加入。然而，也可以在与固体载体混合前先将盐溶于水或含酶液体中。
对于液体制剂，可以直接向液体酶制剂中加入盐。适合以0.1到40、优选0.5到30、特别是1到25，优选1到20的重量百分比的量提供盐。
因此固体制剂(如颗粒)可以含有少于25％(w/w)的盐，优选小于12％，例如2.5％到7.5％，例如4％到6％(重量百分比基于最终的固体制剂)。
另外还考虑可以向固体和/或液体酶制剂中加入已知的稳定剂，如尿素、甘油、聚乙二醇，优选为分子量6000Da的聚乙二醇或它们的混合物。可以加入固体或液体制剂的合适的稳定剂的另一实例为C5糖，优选木糖醇或核醣醇，或山梨醇、分子量600到4000Da(优选1000到3350Da)的聚乙二醇，丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐以及羧甲基纤维素。
可以通过掺入疏水、成胶或缓溶(如在水中)化合物进一步提高造粒稳定性。可以按基于水和固体制剂中固体载体成分重量的1％到10％、或基于液体制剂重量的1％到20％提供这些化合物。合适的物质包括衍生的纤维素如HPMC(羟丙基甲基纤维素)、CMC(羧甲基纤维素)、HEC(羟乙基纤维素)、微晶纤维素、聚乙烯醇(PVA)；和/或食用油。可以(例如向待粒化的混合物中)加入食用油(如大豆油或芸苔油)作为加工助剂。
本文所使用的术语“酶”包括单个酶以及不同酶(如植酸酶和酸性磷酸酶)的混合物和不同来源的同一种酶(如真菌植酸酶和细菌植酸酶)的混合物。
本发明的酶制剂含有至少一种磷酸酶。磷酸酶包括植酸酶(3-植酸酶和6-植酸酶)和/或酸性磷酸酶。
在优选是实施方案中磷酸酶为至少一种植酸酶。
术语“植酸酶”不仅指天然存在的植酸酶，还指任何具有植酸酶活性(如能催化涉及从磷酸肌醇中移去或释放无机磷(磷酸)的反应)的酶。优选植酸酶属于EC 3.1.3.8类别。植酸酶可以是3-植酸酶和/或6-植酸酶。
一个植酸酶活性单位(＝FTU)定义为在pH 5.5和37℃下每分钟从0.0051mol/l植酸钠中释放1微摩尔无机磷的酶量。
该分析方法基于从过量加入的植酸钠中释放无机磷。孵育时间为pH5.5下60分钟。通过黄色钼-钒复合物测定释放的磷并在波长415nm处评估光度值。平行操作已知活性的植酸酶标准品用于比较。用与标准品的比率表示测出的产物样品中吸收的提高(相对方法，AOAC官方方法)。
可以根据“Determination of Phytase Activity in Feed by aColorimetric Enzymatic Method″Collaborative Interlaboratory Study”Engelen等Journal of AOAC International第84卷，No.3，2001测定植酸酶的活性。
本发明的植酸酶可以是微生物来源和/或得自对天然存在的植酸酶的遗传修饰和/或从新构建(遗传工程)。
在优选的实施方案中植酸酶为植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶或可由酵母产生的植酸酶。
植酸酶优选来自微生物来源，如细菌、真菌和酵母，但也可以是植物来源。在优选的实施方案中，植酸酶来自真菌菌株，特别是曲霉(Aspergillus)菌株，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)。多数优选的植酸酶来自黑曲霉菌株或米曲霉菌株。
在另一优选的实施方案中，植酸酶来自细菌菌株特别是芽孢杆菌(Bacillus)菌株或假单胞菌(Pseudomonas)菌株。优选地，植酸酶来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。
在另一优选的实施方案中，植酸酶来自细菌菌株特别是大肠杆菌菌株。
在另一优选的实施方案中，植酸酶来自酵母，特别是克鲁弗氏酵母属(Kluveromyces)菌株或酵母属(Saccharomyces)菌株。优选地，植酸酶来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
在本发明上下文中，“来自于…的酶”包括特定菌株天然产生的酶，所述酶回收自该菌株或由从该菌株中分离的DNA序列编码并在用所述DNA序列转化的宿主生物中产生。
可以使用任何合适的技术从目的微生物中获得植酸酶。具体而言，可以通过在合适的营养培养基中发酵产生植酸酶的微生物并通过本领域已知的方法分离酶来获得植酸酶。
培养所使用的发酵液或培养基可以是适合目的宿主细胞生长的任何常规培养基，并可根据现有技术的原则配制。培养基优选含有碳源和氮源和其他无机盐。合适的培养基(如基本培养基或复合培养基)可从生产商获得，或者可以根据发表的配方制备(如美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株目录)。
在培养后，通过从培养液中分离和纯化蛋白质的常规方法回收植酸酶。熟知的纯化操作包括通过离心或过滤将细胞与培养基分开，通过盐(如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质组分，以及层析方法，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
另外，优选使用重组DNA技术(如本文引入作为参考的出版物EP-A1-0 420 358所述)大量产生植酸酶。
优选地，如EP-A1-0 420 358所述，在有助于表达编码植酸酶的基因的条件下培养用得自无花果曲霉或黑曲霉物种的植酸酶编码基因转化的曲霉种真菌。
优选在用于本发明的制剂以前通过过滤和超滤处理含有植酸酶的发酵液。
在本发明的另一实施方案中使用来自分子工程的植酸酶，如WO94/03072(Rohm)、WO 99/49022(Novozymes)、WO 00/43503(Novozymes)或WO 03/102174(BASF AG)中所述的遗传修饰的植酸酶。
本发明优选使用的另一种植酸酶是所谓的共有植酸酶。它是根据理论分子生物学方法研发的植酸酶，其与曲霉植酸酶相比具有更高的内在稳定性，参阅欧洲专利申请出版物No.897 985。在本发明的实践中还可使用实施例3-13中具体描述的共有植酸酶。
还可以通过遗传工程产生这些植酸酶，其中将得自真菌的基因转移到宿主生物如细菌(如大肠杆菌)、酵母或另一种真菌中，其他细节参阅如欧洲专利申请出版物No.68431 3和欧洲专利申请出版物No.897 010。
在本发明优选的实施方案中可以使用EP-B1 420 358的植酸酶。
在本发明优选的实施方案中，本发明的酶制剂还含有其他酶。
本发明的制剂优选的其他酶包括用于食品(包括焙烤)和饲料工业的酶。
这些酶包括但不仅限于蛋白酶(细菌、真菌、酸性、中性或碱性)，优选具有中性和/或酸性最适pH。
蛋白酶(蛋白水解酶)可以是微生物酶，优选蛋白酶来自细菌或真菌菌株或者蛋白酶可以是胰蛋白酶或胃蛋白酶。在优选的实施方案中，蛋白水解酶为来自芽孢杆菌菌株(优选枯草芽孢杆菌菌株或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株)的细菌蛋白酶。市售的芽孢杆菌蛋白酶为AlcaseTM和NeutraseTM(Novozymes，丹麦)。在另一优选的实施方案中，蛋白水解酶为来自曲霉菌株(优选刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株、黑曲霉菌株、米曲霉菌株)的真菌蛋白酶。市售的曲霉蛋白酶为FlavourzymeTM(Novozymes，丹麦)。
这些酶包括但不仅限于脂肪酶(真菌、细菌、哺乳动物)，优选如哺乳动物胰磷脂酶A2的磷脂酶或任何三酰甘油酯酶(E.C.3.1.1.3)。
这些酶包括但不仅限于葡萄糖氧化酶。
这些酶包括但不仅限于糖苷酶(E.C.3.2，也称为糖酶)，如淀粉酶(α或β)、纤维素酶(完整纤维素酶或其功能性组分)，特别是木聚糖酶、葡聚糖酶，优选β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和半乳糖苷酶，如α-或β-半乳糖苷酶。
糖苷酶可以是任何糖苷酶(EC 3.2.1，也称为糖酶)。优选地，糖苷酶为淀粉酶(特别是α-淀粉酶或β-淀粉酶)、纤维素酶、葡聚糖酶(特别是内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)或内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6))、木聚糖酶(特别是内切-1，4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)或木聚糖-内切-1，3-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.32))、α-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)、多聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15，也称为果胶酶)、纤维素-1，4-β-纤维二糖酶(E.C.3.2.1.91，也称为纤维二糖水解酶)、内切葡聚糖酶(特别是内切-1，6-δ-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.75)、内切-1，2-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.71)、内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)或内切-1，3-α-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.59))。它们还包括甘露聚糖酶，如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.25)和甘露聚糖-内切-1，4-β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)。
本发明优选的内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)为本文引入作为参考文献的WO 01/70998(BASF AG)中描述的内切-1，4-β-葡聚糖酶。
在优选的实施方案中，其他酶选自糖苷酶、磷脂酶和葡萄糖氧化酶。
在优选的实施方案中其他酶选自糖苷酶。
在优选的实施方案中其他酶选自木聚糖酶、葡聚糖酶及其混合物。
在本发明优选的实施方案中，其他酶为至少一种木聚糖酶。木聚糖酶可以得自微生物来源，如黑曲霉、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)以及芽孢杆菌和链霉菌物种。还可以通过重组表达获得木聚糖酶，例如EP 121138中所述。在优选的实施方案中，可以根据本发明使用如EP 0 463 706 B1(BASF AG)和/或WO 02/24926 A1(BASF AG)中所述的木聚糖酶。
本发明合适的木聚糖酶可以是内切木聚糖酶和/或外切木聚糖酶，优选内切木聚糖酶，特别是内切-β-木聚糖酶。
合适的其他酶是动物食品(包括宠物食品)和/或人营养物中所包含的酶。这些酶的功能常是(例如通过降低粘性或某些饲料化合物的抗营养效应)提高饲料的转换率。还可以使用饲料酶，如为了降低粪肥中对环境有害的化合物的量。
将本发明的酶制剂用于食品应用时，酶必须为食品品质。
本发明的范围内包括使用至少一种、优选两种、优选三种或更多不同的酶。这些可以是同一类别的酶(如两种不同的植酸酶)或者不同类别的酶(如植酸酶和木聚糖酶)。应该理解，无论何时，当涉及到酶时，这些术语中也包括酶混合物(无论这些混合物是否从单一发酵中直接得到或是通过混合来自不同发酵的酶而得到)，另外还包括通过发酵重组微生物得到的酶。
如果磷酸酶为植酸酶，优选该固体或液体酶制剂具有1000到80000，如2000到70000，如3000到60000，优选4000到50000，如5000到25000，如从5000到15000，如5000到10000，如6000到8000FTU/g的活性。
如果其他酶为植物细胞壁降解酶(如木聚糖酶)，则最终固体或液体制剂可以具有3000到500000，优选4000到250000，优选5000到100000，优选6000到80000，最优为8000到70000EXU/g范围内的该酶活性。
如果其他酶为纤维素酶如葡聚糖酶(优选β-葡聚糖酶)，则固体或液体酶制剂可以具有100到150000，如500到100000，优选750到50000，优选从1000到10000，最优1500到7000BGU/g的该酶活性。
一个内切木聚糖酶活性(EXU)定义为在测试条件下(pH 3.5和55℃)每分钟释放1.00微摩尔以木聚糖等价物衡量的还原糖的酶量。
一个β-葡聚糖酶单位(BGU)定义为在测试条件下(pH 3.5和40℃)每分钟释放0.258微摩尔表达为葡聚糖等价物的还原糖的酶量。
可以根据Engelen等Journal 0f AOAC International第79卷，No.5，1019(1996)测定内切木聚糖酶活性(EXU)和β-葡聚糖酶活性(BGU)。
固体制剂(如颗粒)可以含有重量百分比从1到20，如从5到20，如从7到15的酶(磷酸酶加其他酶)。
液体制剂可以含有重量百分比从0.5到20，如5到15的酶(磷酸酶加其他酶)。
本发明的另一方面涉及制备动物饲料或动物饲料的预混合料或前体的方法，所述方法包括将权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂与一种或多种动物饲料物质(如种子)或成分混合。可随后将其灭菌(如进行热处理)。然后可以将得到的组合物适当地加工成型并任选地干燥。
补充了酶的饲料可以进行若干方法饲料加工方法，如挤压、膨胀和造粒，其中可能出现暂时性的高温，热稳定是有利的。
本发明的稳定的酶制剂可以应用于如饲料固体。可以用自来水稀释热稳定的液体酶制剂以得到具有所需酶活性的溶液。如果磷酸酶为植酸酶，优选稀释溶液以得到100到1000，优选200到700FTU/g，特别是300到500FTU/g活性的溶液。可以将饲料固体转移到机械混合器中并在搅动时将稀释的酶制剂喷到饲料固体上，以得到具有添加的酶活性的同质产物。含有植酸酶的饲料固体的实例优选为获得约500FTU/g活性的饲料固体。
另外可以将固体或液体酶制剂直接与饲料糊混合，然后将混合物进行加工，如造粒、膨胀或挤压。
本发明的另一方面涉及制备适于人营养物的组合物或预混合料或前体的方法，所述方法包括将权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂与一种或多种食品物质或成分混合。可随后将其灭菌(如进行热处理)。然后可以将得到的组合物适当地加工成型并任选地干燥。
优选以低于1g∶1kg，优选低于0.5g∶1kg，特别是低于0.1g∶1kg，优选低于0.05g∶1kg的比例将固体制剂(如颗粒)与饲料或食品物质或成分混合。
本发明的另一方面涉及权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂用于人体和/或动物营养的用途。因此本发明包括组合物，如动物饲料组合物或适于人营养物的组合物。这些组合物优选为片剂(pellet)的形式(每片可以含有1-5、如2-4个干燥颗粒)。这些组合物可以具有8％到20％、如12％到15％的含水量。酶量可以从重量百分比0.0001到0.005，适当的为重量百分比从0.0005到0.0012，如至少5ppm。
本发明的另一方面涉及提供满足单胃动物食物磷需求的方法，其中用根据本发明的饲料喂养动物并在饲料中不加入额外的磷酸盐。
另一方面涉及促进动物生长和/或改善饲料转换率的方法，所述方法包括用含有权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂的食物喂养动物。
合适的组合物含有从0.05到2.0，如0.3到1.0，最优为0.4到0.6FTU/g的磷酸酶(如植酸酶)。可以存在0.5到50EXU/g，例如1到40EXU/g，优选2到25，特别是2到15EXU/g的木聚糖酶。另外，可以存在0.05到1.5，如0.1到1.0，如0.2到0.6BGU/g的纤维素酶。
本发明的另一方面涉及权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂在动物饲料或动物食物中的用途或作为动物饲料或动物食物的成分的用途。
在被动物和/或人食用时，权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂降低了环境污染。此外，在被动物食用时，它们还会提高动物产品(如肉、蛋)的质量，所述动物产品得自用权利要求1到10和/或权利要求26中任一项所定义的固体和/或液体酶制剂喂养的动物。
合适的动物包括农业动物(猪、家禽、家畜)、非反刍或单胃动物(猪、飞禽、家禽、水生动物，如鱼)、反刍动物(牛或羊，如奶牛、绵羊、山羊、鹿、小牛、羔羊)。家禽包括小鸡、母鸡、火鸡、鹅和鸭。
本发明的另一方面涉及在含磷酸酶的组合物中使用至少一种稳定剂以提高酶的粒化稳定性，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物。
本发明的另一方面涉及用至少一种稳定剂作为添加剂用于生产固体和/或液体酶制剂(优选固体酶制剂)的用途，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物。在本发明的该实施方案中，优选以固体化合物将稳定剂加入标准粒化混合物中。这些制剂可以在高剪力粒化加工后得到提高的(如所测定的磷酸酶活性的)回收率(多至20％)，所述高剪力粒化加工包括在流化床干燥器上45℃15分钟的颗粒干燥步骤。另外，在与饲料和/或食品混合时，这些含有本发明稳定剂的颗粒在饲料和/或食品处理(如85℃的造粒过程)后可以表现出与不含这些添加剂的颗粒相比提高的回收率。
本发明一个方面的优选特征和特性可经必要的变更后同等效应用于另一方面。
实施例除非另有说明，所有的百分比均为w/w。
实施例V1(比较)通过捏合、挤压、滚圆和干燥制备基于玉米淀粉的酶颗粒。
第一步将玉米淀粉装入实验室混合器(Loedige Typ M5 RMK)中并缓慢搅动。将含有植酸酶的超滤液、ZnSO4×6H2O、PVA(聚乙烯醇)和额外的水的混合物倒入烧杯中并溶解/分散。将该混合物倒到Loedige混合器中的玉米淀粉上。
在Loedige混合器中以100-250rpm混合并捏合66％(w/w)的玉米淀粉、20％(w/w)的含有植酸酶的超滤液、1％(w/w)的PVA、0.3％(w/w)的ZnSO4×6H2O和12.7％(w/w)的额外的水，从而得到含酶的生面团。
第二步用Fuji Paudal实验室挤压机(型号DG-L1)挤压含酶的生面团，以得到湿的挤出物，然后在实验室滚圆器中滚圆，以得到平均直径500-800μm的圆形微粒。
然后在流化床(Niro-Aeromatic，型号MP-1)中在约40℃的床温下将这些微粒干燥60-90分钟。干燥并接着冷却约1.5kg的湿颗粒。得到的干燥酶颗粒具有8920FTU/g的活性。
实施例1酪蛋白作为稳定剂第一步 将玉米淀粉和酪蛋白(得自Merck，Darmstadt，CAS No.900-71-9)装入实验室混合器(Loedige Typ M5 RMK)中并缓慢搅动。将含有植酸酶的超滤液、ZnSO4×6H2O和额外的水的混合物倒入烧杯中并溶解/分散。将该混合物倒到Loedige混合器中的玉米淀粉和酪蛋白上。从而通过在Loedige混合器中以100-250rpm混合并捏合所述成分得到含有植酸酶的生面团。
如实施例V1所述通过挤压生面团、滚圆、干燥和冷却得到含酶的颗粒。得到的干燥酶颗粒具有7690FTU/g的活性。
实施例2酪蛋白作为稳定剂根据实施例1获得含酶(植酸酶)的颗粒。得到的干燥酶颗粒具有7580FTU/g的活性。
造粒稳定性比较对本发明的植酸酶颗粒进行造粒试验，并将其造粒稳定性与根据标准配方(＝实施例V1)产生的颗粒进行比较。造粒试验由将不同的酶颗粒与标准肉鸡食品以1g/kg饲料的水平混合而组成。通过在调温器中注射蒸汽处理含酶饲料并紧接着在压片器中造粒以获得饲料片剂，随后冷却。在压片器之后直接测得的粒温度为78℃。这种类型的加工一般在饲料业中使用以得到饲料片剂。实施例1以及实施例2与实施例V1相比表现出至少10％的造粒稳定性提高。
权利要求
1.含有至少一种磷酸酶和至少一种稳定剂的稳定化的固体或液体酶制剂，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
2.根据权利要求1的酶制剂，其中磷酸酶为植酸酶。
3.根据任一前述权利要求的酶制剂，其中植酸酶为植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶、可由酵母产生的植酸酶或共有植酸酶。
4.根据任一前述权利要求的酶制剂，其中动物蛋白质选自来自家禽、牛、猪、鱼的蛋白质及其混合物。
5.根据任一前述权利要求的酶制剂，其中动物蛋白质选自明胶、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项的酶制剂，其特征在于制剂为液体。
7.根据权利要求1至5中任一项的酶制剂，其特征在于制剂为固体。
8.根据权利要求7的酶制剂，其特征在于固体制剂为颗粒形式。
9.根据权利要求8的酶制剂，其中颗粒包含至少一种磷酸酶、含有至少w/w 15％可食用碳水化合物多聚体的固体载体和至少一种稳定剂，其中稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
10.根据权利要求9的酶制剂，其中包被了颗粒。
11.制备含有磷酸酶的颗粒的方法，所述方法包括加工(i)至少一种磷酸酶，(ii)含有至少w/w 15％可食用碳水化合物多聚体的固体载体，和(iii)至少一种稳定剂，其中稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。
12.根据权利要求11的方法，其中在加工中加入了水。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法，其中以含酶水成液提供水和磷酸酶。
14.根据权利要求13的方法，其中液体是来自产生磷酸酶的发酵方法的滤液。
15.根据权利要求11到14中任一项的方法，其中在加工后干燥颗粒。
16.根据权利要求11到15中任一项的方法，其中动物蛋白质选自来自家禽、牛、猪、鱼的蛋白质及其混合物。
17.根据权利要求11到16中任一项的方法，其中动物蛋白质选自胶原、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
18.根据权利要求11到17中任一项的方法，其中所述方法包括a)将含有酶的水成液与固体载体和稳定剂混合；b)机械加工a)中得到的混合物，以获得含酶颗粒；并c)干燥b)中获得的含酶颗粒。
19.根据权利要求11到18中任一项的方法，其中加工为机械加工，包括挤压、造粒、高剪力粒化、膨胀、流化床团聚、滚圆、滚筒粒化或其组合。
20.根据权利要求11到19中任一项的方法，其中混合了含酶水成液、固体载体和稳定剂，并在粒化前捏合得到的混合物。
21.根据权利要求11到20中任一项的方法，其中加工为低压下和/或在笼状或圆顶挤出机中进行的挤压。
22.根据权利要求11到21中任一项的方法，其中滚圆了颗粒。
23.根据权利要求11到22中任一项的方法，其中包被了颗粒。
24.根据权利要求11到23中任一项的方法，其中磷酸酶为植酸酶，优选为植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶、可由酵母产生的植酸酶或共有植酸酶。
25.根据权利要求11到24中任一项的方法，其中颗粒具有1000到80000FTU/g，优选2000到70000FTU/g，优选3000到60000FTU/g，更优选4000到50000FTU/g并更优选5000到15000FTU/g范围内的植酸酶活性。
26.通过权利要求11到25中任一项所限定的方法得到的含酶颗粒。
27.制备动物饲料或动物饲料的预混合物或前体的方法，所述方法包括将根据权利要求1到10和/或权利要求26中任一项的稳定化的固体和/或液体制剂与一种或多种动物饲料物质或成分混合。
28.制备适于人营养物的组合物或预混合物或前体的方法，所述方法包括将根据权利要求1到10和/或权利要求26中任一项的稳定化的固体和/或液体制剂与一种或多种食品物质或成分混合。
29.根据权利要求27或28中任一项的方法，其中对饲料或食品物质与稳定化的固体和/或液体制剂的混合物进行灭菌或用蒸汽处理、造粒并任选地干燥，所述稳定化的固体和/或液体制剂为根据权利要求1到10和/或权利要求26中任一项的固体和/或液体制剂。
30.根据权利要求1到10和/或权利要求26中任一项的稳定化固体和/或液体制剂用于人和/或动物营养物的用途。
31.促进动物生长和/或提高饲料转换率的方法，所述方法包括用含有根据权利要求1到10和/或权利要求26中任一项的稳定化固体和/或液体制剂的食物喂养动物。
全文摘要
本发明涉及含有至少一种磷酸酶和至少一种稳定剂的稳定化固体或液体酶制剂，所述稳定剂选自琼脂、藻胶、角叉菜胶、红藻胶、印度胶、黄蓍胶、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角胶(＝角豆胶)、罗晃子胶、阿拉伯半乳聚糖、黄素(胶)、至少一种动物蛋白质及它们的混合物，条件是如果在作为固体制剂的颗粒中使用明胶作为唯一的稳定剂，则其后需包被颗粒。本发明还涉及生产这些制剂(特别是固体制剂如颗粒)的方法以及它们在动物和/或人营养物中的用途。
文档编号C12N9/14GK1909796SQ200580002895
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月28日 优先权日2004年1月30日
发明者A·哈比希, J·布劳恩 申请人:巴斯福股份公司