专利名称：生产l－谷氨酰胺的方法和生产l－谷氨酰胺的细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及属于棒状杆菌的产L-谷氨酰胺细菌，用于产生L-谷氨酰胺。本发明还涉及生产L-谷氨酰胺的方法。L-谷氨酰胺在工业上有很多用途的氨基酸，可作为调味品的成分、肝功能提升试剂、氨基酸浸剂、复合氨基酸药物等等。
现有技术的简述已知许多利用重组DNA技术提高L-氨基酸产量的方法。比如，提高涉及L-氨基酸合成的酶活性或者是涉及L-氨基酸降解的酶的活性等方法。公开号为No.2003/0003550的美国专利已经公开了一种通过增强谷氨酰胺合成酶活性提高L-谷氨酰胺产量的方法。而且已经报道了编码谷氨酰胺合成酶(Genbank Accession No.Y13221)和谷氨酰胺2-酮戊二酸氨基转移酶(Genbank Accession No.AB024708)的基因，涉及棒状杆菌谷氨酰胺生物合成和降解。
除了上述提到的基因，氨基酸杂志(Amino Acids，773-77，1963)中暗示了棒状杆菌中存在涉及L-谷氨酰胺降解的酶。然而，铵离子和低PH可抑制此酶的活性，因此在谷氨酰胺发酵过程中存在胺离子，酶很少起作用。
谷氨酰胺酶(谷氨酰胺氨基水解酶)是已经报道了编码谷氨酰胺酶的基因有Pseudomonas细菌(FEMS Microbol.Lett.，178(2)，327-325，1999)、米曲霉(Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，59-68，2000)、Rhizobium etli(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)，451-6，1999)、大鼠(J.Biol.Chem，266(28)，18792-18796，1991)等。另外报道在大肠杆菌中也存在谷氨酰胺酶活性(J.Biol.Chem，243(5)，853-878，1968)。但是，还没有在棒状杆菌中分离出谷氨酰胺酶基因，关于此基因的任何有效突变对谷氨酰胺产量的影响也未可知。
通过修饰目的基因的起始序列来增强基因表达的方法是已知的(日本专利特开(Kokai)No.2000-818935)。现在已知棒状杆菌的编码谷氨酰胺合成酶(“glnA”)的基因(FEMS Microbiology Letters，154，81-88，1997)。而且已经分离出包括起始位点的基因翻译起始区域(FEMS Microbiology Letters，205，361-367，2001)。然而以前没有修饰起始位点来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达的描述。
在发酵生产L-氨基酸中经常使用提高微生物的方法。也就是说，既然野生微生物L-氨基酸的产量都非常的低，那么通过突变产生自养或者类似抗性、提高代谢调节或者两者相结合。尽管通过这些方法都可以产生L-谷氨酰胺，目前的现有技术需要提要发酵产量以便有效而且经济的生产L-谷氨酰胺。
发明概述本发明的发明人经过刻苦的研究获得了本发明。本发明涉及棒状杆菌中的一个新基因，以及利用重组技术提高L-谷氨酰胺产量的方法。首先，分离编码谷氨酰胺酶的基因，同时发现在谷氨酰胺酶活性降低的菌株中L-谷氨酰胺的产生能力优于那些谷氨酰胺酶活性与野生菌相似的菌株。进一步发现降低谷氨酰胺酶活性的同时增强谷氨酰胺合成酶的活性更加有利于L-谷氨酰胺的产生。
本发明的目的是通过降低L-谷氨酰胺的降解来提高棒状杆菌产L-谷氨酰胺的能力，因而提供利用这样特性的菌株来生产L-谷氨酰胺的方法。
本发明进一步的目的是提供具有L-谷氨酰胺产生能力并且经过修饰以使胞内谷氨酰胺酶活性降低的棒状杆菌。
本发明进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中是通过断裂染色体上的谷氨酰胺酶基因的方法降低胞内谷氨酰胺酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中谷氨酰胺酶活性约0.1U/mg细胞蛋白。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中当测定每单位质量细胞蛋白的酶活性时，谷氨酰胺酶活性与谷氨酰胺合成酶的活性相似或更低。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中进一步修饰增强谷氨酰胺合成酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，其中通过提高谷氨酰胺合成酶基因的表达来增强谷氨酰胺合成酶活性。
本发明更进一步的目的是提供上面所述的细菌，通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝数或者修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译调控区来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达，这样增强细菌基因的表达。
本发明更进一步的目的是提供一种生产L-谷氨酰胺的方法，包括在培养基中培养上面所述的细菌以产生L-谷氨酰胺，并且从培养物中收集L-谷氨酰胺。
本发明更进一步的目的是提供一种棒状杆菌的谷氨酰胺合成酶基因，其中基因的-35区(region)的序列替换成TTGCCA，-10区的序列替换成TATAAT。
根据本发明，棒状杆菌的产L-谷氨酰胺的能力增强，因而有效而低成本的获得高产量的L-谷氨酰胺。
图1含谷氨酰胺酶基因的质粒pHMKGLS5的构建图2在棒状杆菌中无自我复制位点的质粒pNEL的构建图3含断裂的gls的质粒pNELΔgls的构建图4含增强表达的GS基因的质粒pNELglnA14的构建优选实施方案详述本发明的棒状杆菌在本发明中，棒状杆菌包括但不限于被划分为短杆菌属和棒状杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255，(1981))，这两个菌属的关系非常接近。这样的棒状杆菌包括嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，醋谷棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamucum)，Corynebacterium alkanolyticum，美棒状杆菌(Corynebacterium callunae)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，百合花棒状杆菌(Corynebacteriumlilium)，Corynebacterium melassecola，Corynebacteriumthermoaminogenes，力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)，分支短杆菌(Brevubacterium divaricatum)，黄色短杆菌(Brevubacteriumflavum)，Brevibacterium immariophilum，乳发酵短杆菌(Brevubacteriumlactofermentum)，玫瑰色短杆菌(Brevubacterium roseum)，解糖短杆菌(Brevubacterium saccharolyticum)，生硫短杆菌(Brevubacteriumthiogenitalis)，产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，白色短杆菌(Brevubacterium album)，蜡状短杆菌(Brevubacterium cerium)，嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphillum)。
具体的说，包括了以下菌株嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870醋谷棒状杆菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒状杆菌ATCC15991百合花棒状杆菌ATCC13020，13032，13060分支短杆菌ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒状杆菌ATCC13868谷氨酸棒状杆菌ATCC14020黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳发酵短杆菌ATCC13869玫瑰色短杆菌ATCC13825解糖短杆菌ATCC14066生硫短杆菌ATCC19240产氨短杆菌ATCC6871，ATCC6872白色短杆菌ATCC15111蜡状短杆菌ATCC15112嗜氨微杆菌ATCC15354。
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心获得。每个菌株有其指定的保藏号，根据这个保藏号可以请求提供所需的菌株。美国典型培养物保藏中心的目录中标明了每个菌株的保藏号。菌株AJ12340于1987年10月27日保藏于国家生命科学和人体技术研究院工业科学技术研究所(现在，独立的行政机构，国家高级工业科学和技术研究院，国际专利生物保藏中心(Tsukuba cebtral 6，1-1，higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编305-5466))作为根据布达佩斯条约进行的国际保藏，保藏号为FERM BP-1539。菌株AJ12418于1989年1月5日保藏于国家生命科学和人体技术研究院工业科学技术研究所，作为根据布达佩斯条约进行的国际保藏，保藏号为FERM BP-2205。
在本发明中，“产L-谷氨酰胺的能力”是指当在培养基中培养本发明的棒状杆菌时该细菌在该培养基中积累L-谷氨酰胺的能力。这种产L-谷氨酰胺的能力是野生型棒状杆菌的特性，或者可以通过增殖被给予或增强。
为了通过增殖给予或增强产L-谷氨酰胺的能力，可以使用以下的方法获得6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性菌株的方法(日本专利特开No.3-232497)，获得嘌呤类似物和/或甲硫氨酸亚砜抗性菌株的方法(日本专利特开No.61-202694)，获得α-酮丙二酸抗性的方法(日本专利特开No.56-151495)，获得对含谷氨酸的肽的抗性的方法(日本专利特开No.2-186994)等等。具有产L-谷氨酰胺能力的棒状杆菌的具体实例包括但不限于黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492，参见日本专利特开No.56-151495)黄色短杆菌AJ12210(FERM P-8123，参见日本专利特开No.61-202694)黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123，参见日本专利特开No.61-202694)黄色短杆菌AJ12418(FERM P-2205，参见日本专利特开No.2-186994)黄色短杆菌DH18(FERM P-11116，参见日本专利特开No.3-232497)Corynebacterium melassecola DH344(FERM P-11117，参见日本专利特开No.3-232497)
谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERM P-5493，参见日本专利特开No.56-151495)另外，本发明的谷氨酸棒杆菌经过修饰以致其细胞内谷氨酰胺酶活性降低。“谷氨酰胺酶活性”(即GLS活性)是指酶催化L-谷氨酰胺转化成L-谷氨酸的能力。GLS活性可通过下述方法或其他已知的方法测定。
将棒状杆菌的粗制酶溶液中加入含100mMTris-HCl(pH8.0)和75mM L-谷氨酰胺的溶液中，30℃反应30或60分钟，然后向反应混合物中加入SDS至终浓度为0.5％以终止反应，测定产生的L-谷氨酸的量。本发明中，在上述反应体系中每分钟产生1μmol谷氨酸的谷氨酰胺酶活力定义为1U。粗制酶溶液中的蛋白的量也可根据已知的方法例如“Bio-Rad”法测定，以牛血清蛋白作为标准品。在本文中，GLS活性/mg蛋白以“U/mg”表示。
上述的粗制酶溶液可用以下方法制备。首先，制备细胞。所用培养基含30g葡萄糖，1.5g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，0.01gFeSO4·7H2O，100μg VB1·HCl，，3μg生物素，200mg大豆蛋白水解物，1.5g尿素，0.02ml消泡剂GD-113，加纯水至1L(用NaOH调节pH6.8)。取20ml培养基加入500ml摇瓶中，高压蒸汽115℃灭菌10分钟，然后在31.5℃，115rpm振荡培养菌株细胞。培养基中糖类被完全利用之前结束培养，并立即冷却培养液。冷冻离心从培养液中分离细胞，用100mMTris-HCL(pH8.0)洗涤，超声波破碎细胞。15000g离心15分钟除去未裂解的细胞，就得到粗制酶溶液。该溶液使用前置于冰上保存。
根据上述方法，测定了已知的具有产L-谷氨酰胺能力的细菌的GLS活性，结果列于表8。
术语“修饰以致细胞内谷氨酰胺活性降低”是指棒状杆菌经过修饰使每个细胞的GLS活性低于野生型或非修饰的棒状杆菌。实例包括每个细胞中GLS(谷氨酰胺酶)分子的数量减少或每个GLS分子的活性降低等等。术语“降低”也包括活性的完全消失。作为对照的野生型或非修饰的棒状杆菌，例如黄色短杆菌ATCC14067，由于GLS活性降低，使培养基中L-谷氨酰胺的积累量增加，副产物L-谷氨酸的量减少。
与野生型或非修饰的棒状杆菌相比，本发明棒状杆菌的GLS活性显著降低。按照前文所述的测量方法测得GLS活力水平降至0.1U/mg或更低，优选0.02U/mg或更低，更优选降至0.01U/mg或更低。然而，本发明中GLS活性水平并不限于0.01U/mg或更低水平。
虽然以前没有确定棒状杆菌中编码GLS的基因，本发明提供了一种从黄色短杆菌中分离得到的基因。根据公开的谷氨酸棒杆菌的基因组序列，寻找其与Rhizobium bacterium中已知的GLS基因(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)451-6，Mar.19，1999)同源的基因，该基因即为谷氨酸棒杆菌的GLS基因。根据谷氨酸棒杆菌的推定GLS基因序列，从黄色短杆菌中也分离到GLS基因，并且该基因与Rhizobiumbacterium的GLS基因同源。gls基因可通过PCR方法获得(见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185，(1989))，以例如SEQ ID NOS5和6所示序列为引物，棒状杆菌染色体DNA为模板。其他微生物中编码GLS的基因可以用类似的方法获得。按照这种方法获得的黄色短杆菌ATCC14067的gls基因的核酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
采用Saito和Miura的方法从作为DNA供体的细菌中制备染色体DNA(见H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，《生物工程实验手册》生物科学和生物工程协会主编，日本，97-98页，Baifukan，1992)。
降低棒状杆菌GLS活性的方法有紫外线照射或用诱变剂处理细菌，筛选突变菌株。能用于本发明的诱变剂有N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸。除了使用诱变剂，还可以用基因断裂的方法获得GLS活性降低的棒状杆菌。即，用含有缺失了部分序列的gls基因的DNA转化棒状杆菌，该gls基因的部分序列被删除了以致GLS的功能被破坏(缺失型gls基因)。随后发生的的缺失型gls基因与染色体gls基因的重组断裂了染色体gls基因。这种通过同源重组发生基因取代导致的基因断裂是已知的，利用线性DNA和含温度敏感复制起始点质粒来断裂基因的方法也是已知的。
将表达调控序列例如gls基因启动子替换为一个较弱的启动子也能降低GLS的活性(日本专利特开NO.2000-818935)。可联合使用诱变和断裂基因的方法。
采用如下方法将宿主染色体gls基因替换为缺失型gls基因。通过插入温度敏感复制起始点、缺失型gls基因和抗药标记基因如抗氯霉素基因制备重组DNA，然后用该重组DNA转化棒状杆菌。在含药物的培养基中培养转化体，而此时温度敏感复制起始点不起作用，结果获得了染色体DNA整合了重组DNA的转化体。
可采用任意一种已知的转化方法将上述重组DNA导入棒状杆菌中。例如用CaCL2处理受体细胞以增加细胞对DNA的通透性，这一方法已报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。用对数生长期细胞制备感受态细胞，将DNA导入其中，这一方法已报道用于枯草杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，基因，1，153，(1977))。或者制备易于接受重组DNA的原生质体型DNA受体细胞，再将重组DNA转化到该DNA受体细胞中。这种方法已应用于枯草杆菌，放线菌和酵母中(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G..R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。还可采用电穿孔的方法制备棒状杆菌转化体(Sugimoto et al.，日本专利特开No.2-207791)。
棒状杆菌的温度敏感质粒包括但不限于p48K和pSFKT2(见日本专利特开No.2000-262288)，pHSC4(见法国专利公开号No.2667875，1992年和日本专利特开No.5-7491)等等。这些质粒在至少25℃时能自主复制，而在37℃时不能自主复制。携带pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏于国家生命科学和人体技术研究院工业科学技术研究所(现在，独立的行政机构，国家高级工业科学和技术研究院，国际专利生物保藏中心(Tsukuba cebtral 6，1-1，higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编305-5466))，保藏编号为FERM P-11763。根据布达佩斯条约，该保藏于1991年8月26日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-3524。另外，也可以用在棒状杆菌中不能自主复制的质粒转化棒状杆菌，通过同源重组将质粒掺入到染色体中，见实施例部分。
在上述的将重组DNA掺入染色体的菌株中，缺失型gls基因与染色体上存在的天然gls基因序列重组，即染色体gls和缺失型gls插入染色体中，从而重组DNA的其它部分(载体片段，温度敏感复制起始点和抗药标记)位于两个基因之间。因此，转化体菌株表达正常的gls，因为在这种情况下天然gls占优势。
为了在染色体DNA上只保留缺失型gls基因，通过两个gls基因的重组，将gls的一个拷贝与载体节段(包括温度敏感复制起始点和抗药标记)从染色体DNA上一起删除。在这种情况下，正常gls基因留在染色体上，缺失型gls基因从染色体中删除；或者相反，缺失型gls基因留在染色体上，正常gls基因从染色体中删除。在这两种情况下，当在温度敏感复制起始点能发挥作用的温度下培养细胞时，被删除的DNA以质粒形式保留在细胞中。如果在温度敏感复制起始点不能发挥作用的温度下培养细胞，则质粒上的gls基因和质粒一起被删除。然后，利用PCR、Southern杂交等方法筛选缺失型gls基因留在染色体上的菌株，即为gls基因被破坏的菌株。
用于基因断裂的缺失型gls基因应该与棒状杆菌染色体上的目的gls基因有足够的同源性以致能进行同源重组。同源性优选为70％或以上，更优选为80％或以上，甚至更优选90％或以上，最优选为95％或以上。另外，严谨条件下的DNA杂交也能导致同源重组。“严谨条件”是指在所述条件下只形成特异性杂交，而不形成非特异性杂交。虽然很难用数量形式准确的表述这种条件，严谨条件是指DNA杂交在相当于Southern杂交洗涤时常规使用的盐浓度下进行，即1倍SSC，0.1％SDS；优选0.1倍SSC，0.1％SDS，60℃。
人们推测在棒状杆菌细胞中，谷氨酰胺合成酶(GS)催化L-谷氨酰胺的合成，而谷氨酰胺酶(GLS)降解L-谷氨酰胺。因此，本申请的发明人推论如果要高效率大产量的生产L-谷氨酰胺，保持GS的高活性水平同时维持GLS的低活力水平是一个很重要的因素。然而，在棒状杆菌中，GS的活性显著低于GLS的活性。虽然在L-谷氨酰胺生产过程中，细胞内L-谷氨酰胺合成与降解的平衡会随着GS、GLS这些酶的活性、Km值以及细胞内底物浓度而变化，但毋庸置疑，酶的活力是一个重要的因素。
例如实施例4所述，GLS活性降低的突变菌株中，当残余的GLS活性降至GS活性的60％时，L-谷氨酰胺的产量增加。
GS活性可通过下述方法测定。棒状杆菌的粗制酶溶液中加入100mM咪唑-HCl(pH 7.0)，90mM KCl，0.1mM NH4Cl，1mM MnCl2，1mM烯醇丙酮酸磷酸，0.3mM NADH，10U乳糖脱氢酶，25U丙酮酸激酶，1mMATP和10mM MSG(谷氨酸钠)，30℃测定340nm处吸光度的变化。以没有加入MSG的上述反应溶液作为空白对照。粗制酶溶液中的蛋白的量也可以已知的方法例如“Bio-Rad”法测定，以牛血清白蛋白作为标准品。本发明中，在上述反应体系中每分钟产生1μmol NAD所需的酶量定义为1U，下文GS活性/mg蛋白以“U/mg”表示。
上述的粗制酶溶液可用以下方法制备。从培养液中离心分离细胞，以100mM咪唑-HCl(pH7.0)溶液(含90mM KCl)洗涤，超声波破碎细胞，超速离心除去未裂解的细胞即可。
为了使本发明的棒状杆菌能高效率的产生L-谷氨酰胺，优选使用GLS活性降低同时谷氨酰胺合成酶活性增强的菌株。
术语“谷氨酰胺合成酶活性增强”是指每个细胞的GS活性高于野生型棒状杆菌的GS活性。例如每个细胞中GS分子的数量增加了或每个GS分子的活性提高了等等。作为对照的棒状杆菌，例如黄色短杆菌ATCC14067，由于GS活性增强，使培养基中L-谷氨酰胺的积累量增加，副产物L-谷氨酸的量减少。
与野生型或非修饰的棒状杆菌相比，本发明棒状杆菌的GLS活性降至足够低的水平而GS活性显著提高。当以“活性/单位质量蛋白”的标准测定时，本发明优选的棒状杆菌其GLS活性与GS活性相当或低于GS的活性，更优选GLS的活性是GS活性的1/2或更低。本发明中，每单位质量蛋白GS和GLS的活性是按照前文所述的方法和定义测定的。
通过增加编码GS蛋白的基因的拷贝数可以增强棒状杆菌中GS的活性。例如，将编码GS的基因片段与已知的能在细菌中起作用的载体连接，优选多拷贝型载体，得到重组DNA，再将此重组DNA转化具有产谷氨酰胺能力的宿主。或者，将上述重组DNA转化到棒状杆菌中制备转化体，该转化体随之获得了产谷氨酰胺的能力。
来源于棒状杆菌的各种基因，以及来源于其他种属例如埃希氏属的基因，都可以作为GS基因。在这些基因当中，来源于棒状杆菌的基因因为易于表达而成为优选。
已知glnA基因编码棒状杆菌的GS(FEMS MicrobiologyLetters，154，81-88，1997)。根据该基因已知的核酸序列制备引物，如SEQ ID NOS19和20所示，以棒状杆菌染色体DNA为模板，通过PCR方法可制备GS基因。用类似的方法可以获得其他微生物中编码GS的基因。黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067 glnA基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列如SEQ ID NOS3和4所示。
除了glnA基因，编码GS的基因还包括编码取代、缺失、插入、添加或颠换了一个或几个氨基酸的氨基酸序列的基因，只要其编码产生的GS能催化谷氨酸和铵基产生谷氨酰胺。所述的“几个氨基酸”，其数量根据氨基酸残基在三级结构中的位置和氨基酸的类型而变化，通常是2-30个，优选为2-20个，最优选为2-10个。
编码如上所述的GS蛋白的DNA还包括与SEQ ID NO3所示的核酸序列的874-2307位核苷酸形成的探针杂交的DNA，或在严谨条件下与从SEQ ID NO3所示的核酸序列制备的探针杂交的DNA，并且其编码的蛋白与GS有相似的活性。“严谨条件”是指在所述条件下只形成特异性杂交，而不形成非特异性杂交。虽然很难用数量形式准确的表述这种条件，严谨条件是指在该条件下有高同源性的DNA分子，如有70％或更高同源性，优选80％或更高，更优选为90％或更高，甚至更优选95％或更高同源性的DNA分子互相杂交，而低于上述同源性的DNA分子不杂交。或者，严谨条件是指例如Southern杂交洗涤时的常规盐浓度条件，即1倍SSC，0.1％SDS；优选0.1倍SSC，0.1％SDS，60℃。
能在棒状杆菌中起作用的的载体是指例如在棒状杆菌中能自主复制的质粒。具体例子有pAM330(参见日本专利特开No.58-67699)，pHM1519(参见日本专利特开No.58-77895)，pSFK6(参见日本专利特开No.2000-262288)。
将赋予质粒在棒状杆菌中自主复制能力的DNA片段从这些载体中取出，插入前述的大肠杆菌载体中，就形成在大肠杆菌和棒状杆菌中都能自主复制的所谓穿梭载体。
穿梭载体的实例包括下面提到的这些。携带有穿梭质粒的细菌菌株及其在国际保藏单位的保藏号(以括号表示)如下
pAJ655 大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844 大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611 大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148 谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440 芽孢杆菌AJ11901(FERM BP-140)pHC4大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)从这些保藏的菌株中可获得穿梭质粒，即收集对数生长期的细胞，以溶菌酶和SDS裂解细胞，30000g离心。上清液加入聚乙二醇，通过氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心分级分离和纯化。
棒状杆菌染色体DNA中存在多拷贝基因能增加GS基因的拷贝数，即以染色体上的多拷贝基因作为目标序列。转座子末端的重复DNA或反向重复序列可作为染色体DNA上的多拷贝序列。或如日本专利特开No.2-109985公开的，将GS基因的多个拷贝结合在一个转座子中并转移，可在染色体DNA中引入GS基因的多个拷贝。
除了以上的基因扩增方法，替换表达控制序列也能促进GS基因的表达，例如将GS基因的启动子替换成一个强启动子。强启动子包括lac启动子、trp启动子、trc启动子等。另外，也可以按照WO00/18935所公开的，取代GS基因启动子区域的几个核苷酸从而使将其修饰成更强的启动子。通过这种启动子的取代和修饰，GS基因的表达增强了，因此GS的活性也提高了。这种表达调控序列的修饰可与GS基因的拷贝数增加相结合。
Anton et al.报道了棒状杆菌glnA基因的转录起始点和启动子区(FEMS Microbiogy Letters，205，361-367，2001)。将-10区序列替换成TATAAT，-35区替换序列成TTGCCA，能增加GS的活性。-10区和-35区序列如上述参考文件的图3C所示。而在本发明中，GS基因的-35区是指从上述参考文件所公开的-35区到转录起始点下游的3bp处(SEQ ID NO3的核苷酸序列的727-732位)。-10区与上述参考文件所公开的-10区相同(SEQ ID NO3的核苷酸序列的751-756位)。对GS基因这些区域的修饰可通过例如点突变而实现。
-10和-35区被修饰的GS基因的实例包括棒状杆菌的glnA基因，它具有如SEQ ID NO3所示的序列。其编码的蛋白包括取代、缺失、插入、添加或颠换一个或几个氨基酸的蛋白，并且具有催化L-谷氨酸和铵基产生谷氨酰胺反应的活性。
除了以上讨论的增加GS基因的表达，还可通过对细胞内的GS腺苷酰化消除对活性的控制从而增加GS的活性。(美国专利USNO.2003/0003550A1)本发明的棒状杆菌中，GLS活性降低，GS活性增强，参与L-谷氨酰胺生物合成途径的酶的活性也增加。这样的酶包括异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，柠檬酸合成酶，丙酮酸脱氢酶，烯醇丙酮酸磷酸羧化酶，丙酮酸羧化酶，丙酮酸激酶，果糖磷酸激酶等。
另一方面，参与L-谷氨酰胺生物合成旁路途径产生除L-谷氨酰胺之外其他化合物的酶，其活性降低或消失。这些酶包括异柠檬酸水解酶，α-酮戊二酸脱氢酶，谷氨酸合成酶等。
利用本发明的微生物制备L-谷氨酰胺通过培养如前所述的棒状杆菌，L-谷氨酰胺在培养基中积累并从中收集，可以高效的生产L-谷氨酰胺，并同时抑制副产物L-谷氨酸的产生。。
为了应用本发明的棒状杆菌制备L-谷氨酰胺，使用普通培养基按常规方法培养棒状杆菌，该培养基包括碳源，氮源，矿物质，如果需要还可添加有机痕量营养物质如氨基酸，维生素。合成培养基或天然培养基都能使用。可使用能被所培养的菌株利用的各种碳源和氮源。
碳源包括糖类，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物和糖蜜。有机酸类，如乙酸和柠檬酸，醇类如乙醇，这些物质可单独应用或与其他碳源联合应用作为碳源。
氮源包括氨，铵盐如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵和乙酸铵，硝酸盐等。
氨基酸，维生素，脂肪酸，核苷酸以及含有这些成分的物质如消化蛋白，酪蛋白水解物，酵母提取物和大豆蛋白分解产物等也可以作为碳源。当培养营养缺陷型突变体时，需要氨基酸或其他物质才能生长，还可补充添加所需的营养物质。
磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐等可用作矿物盐。
培养在通气条件下进行，温度控制在20-45℃，pH控制在pH5-9。培养过程中pH值降低时，需要添加碳酸钙或碱如氨气等中和培养基。以上述方式培养10-120小时后，培养基中可积累大量的L-谷氨酰胺。
以常规方法从培养液中收集L-谷氨酰胺。例如，从培养液中除去细胞后，浓缩结晶培养液就可得到L-谷氨酰胺。
实施例下文，参照优选实施方案对本发明作更加具体的解释，但仅仅是作为例子给出。
实施例1gls扩增菌株的构建(1)测定棒状杆菌的谷氨酰胺酶的活性至今为止没有明确报道棒状杆菌中存在可降解L-谷氨酰胺生成L-谷氨酸的谷氨酰胺酶。因此，本发明的发明人要证实棒状杆菌中是否存在谷氨酰胺酶活性。
黄色短杆菌ATCC14067接种到含葡萄糖30g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O 0.4g、FeSO4·7H2O 0.01g、VB1·HCL 100μg、生物素3μg、大豆水解物200mg、尿素1.5g、防泡沫剂GD-113 0.02ml溶于1L纯净水中配制的培养基中(用KOH调pH7.0)，在31.5℃震荡培养。培养物离心收集细胞，100mM pH8.0 Tris-HCL缓冲液洗涤细胞，超声波破碎。破碎后离心去除未裂解的细胞获得粗酶溶液。利用小牛血清白蛋白作为标准样品，用Protein Assay(Bio-Rad)定量粗酶溶液的蛋白质浓度。
测定谷氨酰胺酶活性是将粗酶溶液加入含100mM pH8.0 Tris-HCL和75mM L-谷氨酰胺溶液中，在30℃反应30分钟或者60分钟后加SDS至终浓度为0.5％中止反应，测定L-谷氨酸的量。测定结果如表1所示，表明黄色短杆菌中存在具有谷氨酰胺酶活性的酶。
表1棒状杆菌的GLS活性
(2)克隆谷氨酰胺酶基因已知在生物合成核酸、氨基酸等时，L-谷氨酰胺是NH3的供体，氨甲酰磷酸合成酶的亚单元表明谷氨酰胺的活性。此外，最近在Rhizobium etli中克隆到编码谷氨酰胺酶的基因glsA，具有与核酸和氨基酸的合成不相关的谷氨酰胺酶活性(Biochem.Biophys.Acta.，1444(3)451-6，1999)。因此，发明人搜索棒状杆菌谷氨酰胺基因以获得glsA的同源基因，最终，他们发现可能是编码GLS的基因。然后，根据所假定的GLS的基因的核苷酸序列，克隆到同源的基因并在黄色短杆菌中扩增，也证实了增强的谷氨酰胺酶活性。克隆到的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示(下文将具有SEQ IDNO1所示核苷酸序列的基因称为“gls”)。
用SEQ ID NOS5和6所示引物PCR扩增，黄色短杆菌ATCC14067的染色体DNA为模板，PCR扩增目标序列。SEQ IDNOS5和6分别和SEQ ID NO1中1-20和2100-2081核苷酸对应。黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体DNA用细菌基因组DNA纯化试剂盒提取(Advanced Genetic Technologies Corp.)。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)PCR30个循环，每个循环94℃30秒、55℃15秒、72℃3分钟。
用常规的方法纯化PCR产物，并用平端试剂盒(Takara Shuzo)将其末端补平，用连接试剂盒(Takara Shuzo)连接该平端PCR产物与已经用SnaI消化的棒状杆菌和大肠杆菌的穿梭载体pHMK2。连接混合物转入大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)感受态细胞。细胞在L培养基(其中含10μg/ml IPTG，40μg/ml X-Gel，25μg/ml卡那霉素)中培养过夜。挑选白色克隆、分离单克隆获得转化细菌。碱法抽提转化细菌的质粒，这样就获得了含目的PCR片段的质粒。获得的质粒命名为pHMKGLS5。
前述的pHMK2是按如下的方法获得具有来源于在棒状杆菌中自动复制的质粒pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903，1984)的复制起始位点的质粒pHK4(日本专利特开No.5-7491)用限制性酶BamH和SmaI酶切获得含复制起始位点的片段。用DNA平端试剂盒(Takara Shuzo)处理所获得的片段，然后插入E.coli的克隆载体pK1(日本专利特开No.2000-262288)的BsaAI中而获得pHMK2质粒。pHMKGLS5的构建过程如图1所示。
(3)构建gls过量表达的菌株步骤(2)获得的pHMGLS5质粒转入一种棒状杆菌中获得gls扩增菌株。用电脉冲的方法将pHMGLS5转入黄色短杆菌ATCC14067中(日本专利特开No.2-207791)，然后在含25μg/ml卡那霉素的CM2G板上(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l氯化钠、1g/l葡萄糖、KOH调pH7.0)铺板培养，31.5℃培养两天。出现的克隆分离并命名为2247/pHMKGLS5。同时构建了含pHMK2的菌株，所获得的转化体命名为2247/pHMK2。按照步骤(1)中的方法培养这些转化体，并且测定GLS的活性。结果证明在pHMKGLS5导入的菌株中谷氨酰胺酶的活性增强(表2)。转化体的质粒锚定比率是100％。
表2GLS扩增菌株的GLS活性
实施例2构建gls-缺陷菌株(1)构建gls断裂的质粒为了证实是否存在除了gls而编码棒状杆菌谷氨酰胺的基因，构建gls-缺陷菌株。方法如下所述。
首先，以黄色短杆菌ATCC14067的染色体DNA为模板、合成如SEQ ID NOS5和7所示的合成DNA为引物，PCR获得gls基因氨基端的扩增产物。接着以黄色短杆菌ATCC14067的染色体DNA为模板、SEQ ID NOS6和8所示的合成DNA为引物，PCR获得gls基因羧基端的扩增产物。SEQ ID NOS7和8部分互补。SEQ IDNOS7、8、9和10分别和SEQ ID NO1的1245-985、983-1245、414-438和1869-1845位核苷酸相对应。SEQ ID NOS7和8缺失SEQ ID NO1的1003-1230位核苷酸。Z-Taq(Takara Shuzo)PCR总共30个循环，每个循环94℃30秒、55℃15秒、72℃30秒。
为了获得缺失中间序列的gls基因片段，将上面所述的N-和C-端的片段以等摩尔量混合作为模板，以SEQ ID NOS9和10所示的合成DNA为引物，PCR获得有突变的gls基因的扩增产物。Z-Taq(TakaraShuzo)PCR总共30个循环，每个循环94℃30秒、55℃15秒、72℃30秒。此gls基因产物具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其中第110-185位氨基酸被缺失。
用常规的方法纯化PCR产物，然后用SmaI消化后插入pNEL的SmaI位点。转入感受态的大肠杆菌DH5α(Takara Shuzo)中，在L培养基(其中含40μg/ml X-Gel，25μg/ml卡那霉素)中培养过夜。挑选出现的蓝色克隆，分离单克隆获得转化体。从转化体中抽提质粒，含有目的PCR产物的此质粒命名为pNELΔgls。
pNEL是通过以pNEOL(WO00/18935)为模板，以SEQ ID NOS11和12所示的合成DNA为引物，SmaI消化PCR获得产物然后自连获得的。质粒pNEL不含任何在棒状杆菌的细胞中能自动复制的位点。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)PCR30个循环，每个循环98℃20秒、退火和延伸都为68℃总共6分钟。pNEL的构建如图2所示，pNELΔgls的构建如图3所示。
(2)构建gls-缺陷菌株如(1)所获得的pNELΔgls不含在棒状杆菌的细胞中能自动复制的位点。当用这一质粒转化棒状杆菌时，虽然存在的频率极低，但获得了通过同源重组在染色体中掺人质粒的转化体形式的菌株。用电脉冲的方法将高浓度的pNELΔgls转入黄色短杆菌ATCC14067中，将转化产物在含25μg/ml卡那霉素的CM2G板上(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l氯化钠、1g/l葡萄糖、KOH调pH7.0)上铺板，31.5℃培养两天。分离出现的克隆即为转化体。此转化体在含40μg/ml X-Gel的CM2G板上形成蓝色克隆。然后，此转化体在不含卡那霉素的CM2G板上传代培养，适当稀释后铺板于含40μg/ml X-Gel的CM2G板上。从出现的大量克隆中挑选出白色并且卡那霉素(Km)敏感的克隆。
以Km敏感的菌株的染色体DNA为模板，以SEQ ID NOS5和6所示的合成DNA为引物PCR所得的产物比以ATCC14067染色体DNA为模板PCR所获得的产物要短。此菌株运用在以下的实验中就是gls-缺陷菌株(2247Δgls)。
(3)gls质粒导入2247gls实施例1的(2)部分中所述的质粒pGLS5，用电脉冲的方法导入(2)中获得的2247Δgls菌株中，然后用卡那霉素抗性的标识选出所要的转化体。所获得的转化体命名为2247Δgls/pGLS5。单独地将pHMK2也导入，所获得的转化体命名为2247Δgls/pHMK2。
(4)测定gls-缺陷菌株的GLS活性如实施例1中的(1)部分描述的方法测定GLS活性，包括黄色短杆菌ATCC14067、2247Δgls、pHMK2和pHMKGLS导入的菌株，如表3所示。结果表明在2247Δgls菌株中L-谷氨酰胺的降解的活性几乎消失。而且消失的活性可以通过导入pHMKGLS5而获得。因此可以推导出在棒状杆菌中gls是主要的具有谷氨酰胺酶活性的基因。
表3GLS-缺陷菌株和质粒补充的菌株的GLS活性
实施例3通过gls-缺陷菌株产生L-谷氨酰胺(1)评价gls-缺陷菌株的培养物用黄色短杆菌ATCC14067和2247Δgls按以下方法生产L-谷氨酰胺。CM2B培养基平板上所获得的黄色短杆菌ATCC14067和2247Δgls的细胞各自接种到葡萄糖100g、(NH4)2SO460或40g、KH2PO42.5g、MgSO4·7H2O 0.4g、FeSO4·7H2O 0.01g、VB1·HCL 100μg、生物素4μg、大豆水解物200mg、尿素1.5g、CaCO350g溶于1L纯净水中配制的培养基中(用NaOH调pH6.8)，在31.5℃震荡培养直到培养基中的糖份消耗完。
培养结束后，适宜的稀释培养物后用液相层析分析L-谷氨酰胺的总量。所采用的柱子是CAPCELL PAK C18(Shiseido)，洗脱液为0.095％磷酸、3.3mM庚磺酸、5％乙氰溶于1L无菌水配制而成。根据在210nm时不同的吸收值来测定L-谷氨酰胺(Gln)的积累量。而且所积累的L-谷氨酸(Glu)的量通过Biotech分析仪AS210(AsahiChemical Industry)测定稀释的培养物来确定。表4((NH4)2SO460g/l)和表5((NH4)2SO440g/l)列出相应的测试数据。
就2247Δgls菌株而言，与母本菌株ATCC14067相比在相同条件下，产量提高了大约3％。实验结果表明GLS活性的降低或消除有利于L-谷氨酰胺的产生。
表4GLS活性降低菌株的L-谷氨酰胺产量(1)
表5GLS活性降低菌株的L-谷氨酰胺产量(2)
实施例4构建gls-缺陷菌株和GS活性增强的菌株(1)构建含增强表达的GS基因的质粒棒状杆菌的GS基因的核苷酸序列已经公开(Genbank登录号Y13221)。根据此序列，构建增强表达的GS基因(增强型GS基因)。在此将详细描述构建的方法。首先，以黄色短杆菌ATCC14067的染色体DNA为模板，SEQ ID NOS13和18所示的DNA为引物，PCR扩增N-端序列；同样的，SEQ ID NOS15和17所示的DNA为引物，PCR扩增C-端序列。SEQ ID NOS14、15、16、17和18的序列分别与Genbank登陆号Y13221的核苷酸序列的487-507、523-549、1798-1775、1770-1745、1118-1169和1169-1118位相对应。SEQ ID NOS17和18的核苷酸序列互补。PCR所用的酶是Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)，总共30个循环，每个循环94℃30秒、55℃15秒、72℃60秒。
为了获得增强型GS基因片段，上述步骤扩增的GS基因的上游和下游片段等摩尔混合作为模板，以SEQ ID NOS14和16所示的合成DNA为引物，PCR获得有突变的GS基因的扩增产物。PCR用Z-Taq酶(Takara Shuzo)总共30个循环，每个循环94℃30秒、55℃15秒、72℃2分钟。
接着以常规的方式纯化PCR产物，然后用SmaI消化后插入pNEL的SmaI位点。转入感受态的大肠杆菌DH5α(Takara Shuzo)中，在L培养基(其中含40μg/ml X-Gel，25μg/ml卡那霉素)中培养过夜。挑选出现的蓝色克隆，分离单克隆获得转化体。从转化体中抽提质粒，对glnA表达调控区测序。插入目的突变产物的此质粒命名为pNELglnA14。pNELglnA14的构建如图4所示。所得到的pNELglnA14质粒上的glnA基因片段上，GS基因的-35区的3bp的下游区的序列ATTATA(FEMS Microbiogy Letters，205(2001)361-367)改为TATAAT，-10区序列TTTTGA改为TTGCCA。
(2)构建GS活性增强的菌株如(1)所获得的pNELglnA14不含在棒状杆菌的细胞中能自动复制的位点。当用这一质粒转化棒状杆菌时，虽然存在的频率极低，但获得了通过同源重组在染色体中掺人质粒的转化体形式的菌株。用电脉冲的方法将高浓度的pNELglnA14转入黄色短杆菌2247Δgls中，转化混合物包被在含25μg/ml卡那霉素的CM2G板上(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l氯化钠、1g/l葡萄糖、KOH调pH 7.0)，31.5℃培养两天。分离出现的克隆即为转化体。此转化体在含40μg/ml X-Gel的CM2G板上形成蓝色克隆。然后，此转化体在不含卡那霉素的CM2G板上传代培养，适量稀释后包被在含40μg/ml X-Gel的CM2G板上。从出现的大量克隆中挑选出白色并且卡那霉素(Km)敏感的克隆。
以Km敏感的菌株的染色体DNA为模板，以SEQ ID NOS14和16所示的合成DNA为引物PCR。表达调控区测序。Km敏感的菌株中分离出含目的突变插入表达调控区的菌株。所获得的菌株运用在以下的实验中，并命名为2247Δgls glnA14。
(3)测定GS活性黄色短杆菌ATCC14067接种到含葡萄糖30g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O 0.4g、FeSO4·7H2O 0.01g、VB1·HCL 100μg、生物素3μg、大豆水解物350mg、尿素3.0g、防泡沫剂GD-113 0.02ml溶于1L纯净水中配制的培养基中(用KOH调pH 7.0)，在31.5℃震荡培养。方法参见发酵和生物工程杂志(Journal of Fermentation andBioengineering，vol.70，No.3，182-184，1990)，测定GS活性具体如下粗酶液加入含100mM咪唑-HCL(pH 7.0)、90m MKCL、0.1mMNH4CL、1mM MnCL2、1mM烯醇丙酮酸磷酸、0.3mM NADH、10U乳酸脱氢酶、25U丙酮酸激酶、1mM ATP和10mM MSG的溶液中，在30℃测定340nm的不同的吸收值。所用的空白对照是上面所述的溶液，不含MSG。利用小牛血清白蛋白作为标准样品，用ProteinAssay(Bio-Rad)定量粗酶溶液的蛋白质浓度。实验结果表明GS活性在GS活性增强的菌株中提高了大约3倍。
表6在GLS-缺陷菌株和GLS-缺陷、GS-增强的菌株中GLS和GS的活性
(4)评价GLS活性降低菌株和GS活性增强的菌株的培养物按如下的步骤培养黄色短杆菌ATCC14067、2247Δgls和2247ΔglsglnA14以产生L-谷氨酰胺。CM2B培养基平板上所获得的黄色短杆菌ATCC14067、2247Δgls和2247Δgls glnA14的细胞各自接种到葡萄糖100g、(NH4)2SO460g、KH2PO42.5g、MgSO4·7H2O 0.4gFeSO4·7H2O 0.01g、VB1·HCL 350μg、生物素4μg、大豆水解物200mg和CaCO350g溶于1L纯净水中配制的培养基中(用NaOH调pH6.8)，在31.5℃震荡培养直到培养基中的糖份消耗完。
培养结束后，是当地稀释培养物后用液相层析分析L-谷氨酰胺的总量。根据在210nm时不同的吸收值来测定L-谷氨酰胺(Gln)的积累量。而且所积累的L-谷氨酸(Glu)的量通过Biotech分析仪AS210(Asahi Chemical Industry)测定稀释的培养物来确定。表7列出相应的测试数据。
2247ΔglsglnA14菌株与2247Δgls菌株相比产量有很大的提高。实验结果表明除了GLS活性的降低或消除，GS活性的增强有利于L-谷氨酰胺的产生。
表7GLS-缺陷菌株和GLS-缺陷、GS-增强的菌株的L-谷氨酰胺产量
参考实施例(1)已知的产生L-谷氨酰胺的菌和2247ΔglsglnA14菌的谷氨酰胺酶活性的测定获得维生素P抗性的菌株AJ11576和AJ11577(日本专利特开No.56-164792)，获得α-酮丙二酸抗性的菌株AJ11573和AJ11574(日本专利特开No.56-151495)，获得含谷氨酸多肽抗性的菌株AJ12418和AJ12419(日本专利特开No.2-186994)等等都是产L-谷氨酰胺的菌株。这些产L-谷氨酰胺的菌株和实施例4所获得的2247ΔglsglnA14菌株按照实施例1中的方法测定GLS活性。实验结果如表8所示。所有这些已知的产L-谷氨酰胺的菌株都有重要的GLS活性。
表8已知的产生L-谷氨酰胺的菌和2247ΔglsglnA14菌的GLS活性
尽管用本发明的优选实施方案对本发明进行了详细描述，但是本领域技术人员显然明白，在不脱离本发明范围的前提下，可以对本发明进行各种改动，得到等同方案。上述的每一篇文献以及外国优先权文本JP2002-342287作为一个整体在此引入作为参考。
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<221>CDS<222>(674)..(1999)<400>1cacaaaatcc ggcgaatcca ccgaaatcgt cttcatcttt ggcttgatca aatgcctcat60tcggcccggc tgcaccgtca cgcttcgaga aatagaaata gcgcttgtcg acgccacccc120actctcaacg gcagccgcca gcgcgtggca tcagcccagg atttattagg accggcgata180taggtaatgg agtggcaccc ctgatccacc aaatgcacca cagccttcgc cgtaccgtcg240tagttatcca ccatcacgct gggaatacct tgcacttcac ggctcattaa tacagtggga300atttcccgcg cgactttgtg gatctcacca gaatccatcc ttgaagcagc gagcaataag360ccatcggcgt gggggacgat cttgtccagc acctccctgg acttaatcgc cgactcccgg420gcgtcgacaa gcgcaaccgt atagccctga gtgcttgcgg catgctgcgc gccctggaaa480atttccaaga agaagggatt cgatgcatcg gtggcaacca tagcgatgat accggtgttt540tggcgctgaa aagcctgagt ttccacacgc gttgcggatt ttctccgcag tggaaaaact600cactcgccca ggctgcgaaa acgcccgcga cacagtggaa ggggagacgc cagcgacttt660tgcgacatca taa atg gtg gct ttt gag tcg ctg tgg ccc cag aat ctg 709Met Val Ala Phe Glu Ser Leu Trp Pro Gln Asn Leu1 5 10tca tgc aca aga gta tat agc gca aaa gaa atc act agt ctt gat tct 757Ser Cys Thr Arg Val Tyr Ser Ala Lys Glu Ile Thr Ser Leu Asp Ser15 20 25atg ttg acg atg ccg ata ccc gag tac ctg cac gaa att tta gat gat 805
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ggc atg tac gac gag gca ggg cag tgg ctc tcc acc gta ggc atc ccc1525Gly Met Tyr Asp Glu Ala Gly Gln Trp Leu Ser Thr Val Gly Ile Pro270 275 280gcg aaa tca gga gtc gcc ggc gga ctc atc ggc att ctg cca ggt cag1573Ala Lys Ser Gly Val Ala Gly Gly Leu Ile Gly Ile Leu Pro Gly Gln285 290 295 300ctg ggc atc gcc aca ttt tcc cca cgc ctg aac ccc aaa ggc aac agc1621Leu Gly Ile Ala Thr Phe Ser Pro Arg Leu Asn Pro Lys Gly Asn Ser305 310 315gtg cgc ggc gta aaa ata ttc aaa cag ctt tcc gac gac atg ggc ctc1669Val Arg Gly Val Lys Ile Phe Lys Gln Leu Ser Asp Asp Met Gly Leu320 325 330cac ctt atg tcc acc gag cag gta tcc ggc cac gca gta cga tcc att1717His Leu Met Ser Thr Glu Gln Val Ser Gly His Ala Val Arg Ser Ile335 340 345acg cgg gac ggc gac acc acc ttc atc caa atg cag ggc gcc atg aac1765Thr Arg Asp Gly Asp Thr Thr Phe Ile Gln Met Gln Gly Ala Met Asn350 355 360ttc tca gcc agc gaa agc ttc ctc cac gcc atc gtg gaa cac aac ttt1813Phe Ser Ala Ser Glu Ser Phe Leu His Ala Ile Val Glu His Asn Phe365 370 375 380gaa ggc acc gaa gtt gtt ctt gat ctc acc cga gta ctt agc ttc cac1861Glu Gly Thr Glu Val Val Leu Asp Leu Thr Arg Val Leu Ser Phe His385 390 395ccc gta gcc atc cgc atg atc aaa gaa ggc ctc aaa cgc atc cgc gac1909Pro Val Ala Ile Arg Met Ile Lys Glu Gly Leu Lys Arg Ile Arg Asp400 405 410gca ggc ttt gag gtg ttc atc ctc gac cca gat gac gta ctg ccc gat1957Ala Gly Phe Glu Val Phe Ile Leu Asp Pro Asp Asp Val Leu Pro Asp415 420 425ttc atg ttt tcc gac ggc acc atc tgc aaa gaa cga gtg tga1999Phe Met Phe Ser Asp Gly Thr Ile Cys Lys Glu Arg Val430 435 440ccggtagctt tatggtctga acaattcgaa ggagattaat cggtgaaaaa gaagcttatg 2059ttgcctttga ttgttgcagc tttgggatta agtgcctgca g 2100<210>2<211>441<212>PRT<213>黄色短杆菌<400>2Met Val Ala Phe Glu Ser Leu Trp Pro Gln Asn Leu Ser Cys Thr Arg1 5 10 15
Val Tyr Ser Ala Lys Glu Ile Thr Ser Leu Asp Ser Met Leu Thr Met20 25 30Pro Ile Pro Glu Tyr Leu His Glu Ile Leu Asp Asp Val Arg Asp Thr35 40 45Thr Ser Gly Glu Leu Ala Asp Tyr Ile Pro Glu Leu Lys Ser Ala Asp50 55 60Pro Asn Pro Leu Ala Val Ala Leu Cys Thr Val Asn Gly His Ile Tyr65 70 75 80Ser Ala Gly Asp Asp Asp Ile Glu Phe Thr Met Gln Ser Ile Ser Lys85 90 95Pro Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Gln Glu Cys Gly Phe Asp Glu Val100 105 110Ser Ala Ser Val Ala Leu Glu Pro Ser Gly Glu Ala Phe Asn Glu Leu115 120 125Ser Leu Asp Gly Glu Asn Arg Pro Met Asn Pro Met Ile Asn Ala Gly130 135 140Ala Ile Ala Ile Asn Gln Leu Ile Asn Gly Ser Asp Ser Thr Val Glu145 150 155 160Asp Arg Val Glu Lys Ile Arg His Tyr Phe Ser Glu Leu Ala Gly Arg165 170 175Glu Leu Thr Ile Asp Arg Val Leu Ala Glu Ser Glu Leu Ala Gly Ala180 185 190Asp Arg Asn Leu Ser Ile Ala His Met Leu Arg Asn Tyr Gly Val Ile195 200 205Glu Asp Glu Ala His Asp Ala Val Leu Ser Tyr Thr Leu Gln Cys Ala210 215 220Ile Lys Val Thr Thr Arg Asp Leu Ala Val Met Thr Ala Thr Leu Ala225 230 235 240Ala Gly Gly Thr His Pro Ile Thr Gly Lys Lys Leu Leu Asp Ala Arg245 250 255Val Cys Arg Leu Thr Leu Ser Val Met Ala Ser Ala Gly Met Tyr Asp260 265 270Glu Ala Gly Gln Trp Leu Ser Thr Val Gly Ile Pro Ala Lys Ser Gly275 280 285Val Ala Gly Gly Leu Ile Gly Ile Leu Pro Gly Gln Leu Gly Ile Ala290 295 300Thr Phe Ser Pro Arg Leu Asn Pro Lys Gly Asn Ser Val Arg Gly Val305 310 315 320Lys Ile Phe Lys Gln Leu Ser Asp Asp Met Gly Leu His Leu Met Ser325 330 335Thr Glu Gln Val Ser Gly His Ala Val Arg Ser Ile Thr Arg Asp Gly340 345 350Asp Thr Thr Phe Ile Gln Met Gln Gly Ala Met Asn Phe Ser Ala Ser355 360 365
Glu Ser Phe Leu His Ala Ile Val Glu His Asn Phe Glu Gly Thr Glu370 375 380Val Val Leu Asp Leu Thr Arg Val Leu Ser Phe His Pro Val Ala Ile385 390 395 400Arg Met Ile Lys Glu Gly Leu Lys Arg Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu405 410 415Val Phe Ile Leu Asp Pro Asp Asp Val Leu Pro Asp Phe Met Phe Ser420 425 430Asp Gly Thr Ile Cys Lys Glu Arg Val435 440<210>3<211>2500<212>DNA<213>黄色短杆菌<220>
<221>CDS<222>(874)..(2307)<400>3ctctgtgcgg ggacgaaaat ttgcaactct cgctttgtct agctagatca accccaacca60agcacgaagg gcgtcgatcc ccgcaaagat cggcgcccat aaatttcact caagacaaat120tacccgcgga taactgcagt tcccgttgcc ttgtcgtgga gcccacggcc gtcagcatcc180accatcacgg caggcagaat caaaatggtc agcagtggac gaaccagcgc acgccaccaa240cccacacgct cctctgcatc cacacgcgca aggcccatgc caaacacggc atgacctggg300gtgcgagcaa agatccatcc cgttagccaa cccaggatca cgaaaataat gagcgtggat360gtcgctacat cgcccagcac atccgtgaaa ttggacagca caatagcaat aacccaggaa420acaccccagt ccacgcagac cccgccgata cgacgagcca ctgaggacag agagccggcc480ccttcttgag gaagccccaa cttttcgcca ggccacctgc cgggcgcatc aggatcgtca540aaatcagctg gaatttcggg tccgtcaagc caacttctct tcggctttgc cattgttaca600atcaaatcca aacatgtaga gggcggatac tgcagtcaaa aggcgttgcc tttagacgtc660gcaaagcgca atttcctacc tttaagatcc taatctgttg aggtcagcca caatttttca720gaaaagtttt gatagatcga caggtaatgc attatactga caacgtcgca aggactacat780ttgcagccaa gtctactact tgatcttcaa aggtcagcaa ttgtgaacaa agctacaaat840aaaccgttcc acccatgtca atgaggagtc acc gtg gcg ttt gaa acc ccg gaa 894Val Ala Phe Glu Thr Pro Glu1 5gaa att gtc aag ttc atc aag gat gaa aac gtc gag ttc gtt gac gtt 942Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu Asn Val Glu Phe Val Asp Val10 15 20cga ttc acc gac ctt ccc ggc acc gag cag cac ttc agc atc cca gct 990Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu Gln His Phe Ser Ile Pro Ala25 30 35
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<210>4<211>477<212>PRT<213>黄色短杆菌<400>4Val Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu1 5 10 15Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu20 25 30Gln His Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Val Glu35 40 45Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile50 55 60Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu65 70 75 80Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His85 90 95Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala100 105 110Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys115 120 125Asn Phe Gly Ala Glu Ala Glu Phe Tyr Leu Phe Asp Ser Val Arg Tyr130 135 140Ser Thr Glu Met Asn Ser Gly Phe Tyr Glu Val Asp Thr Glu Glu Gly145 150 155 160Trp Trp Asn Arg Gly Lys Glu Thr Asn Leu Asp Gly Thr Pro Asn Leu165 170 175Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr180 185 190Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala195 200 205Ser Gly Phe Ala Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln210 215 220Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp225 230 235 240Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly245 250 255Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser260 265 270Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe275 280 285His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr290 295 300
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<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>20ggggtcgacg gatccaccat gatggagga 29
权利要求
1.来源于棒状杆菌的谷氨酰胺合成酶基因，其中基因的-35区的序列被替换成TTGCCA，基因的-10区的序列被替换成TATAAT。
2.权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶基因，其中该基因具有SEQID No.3所示的DNA序列。
3.权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶基因，其中该基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
全文摘要
通过在培养基中培养具有L－谷氨酰胺生产能力并且已经修饰使它的细胞内谷氨酰胺酶活性降低，优选地同时修饰使它的细胞内谷氨酰胺合成酶活性增强的棒状杆菌，在培养基中生产和积累L－谷氨酰胺，并且回收L－谷氨酰胺，来生产L－谷氨酰胺。
文档编号C12P13/14GK101050466SQ20071008817
公开日2007年10月10日 申请日期2003年11月26日 优先权日2002年11月26日
发明者中村纯, 秋山嘉代 申请人:味之素株式会社