专利名称：一种快速检测转基因抗虫水稻的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体 说是一种快速检测转基因抗虫水稻的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观
察加入1000 x SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情 况。
背景技术：
转基因工程自20世纪70年代诞生以来，已经取得迅速的发展。在 1996 ~ 1999年全球共有12个国家种植转基因农作物。美国是转基因农作物 种植面积最大的国家，中国居第4位，但种植面积仅占全球总面积的1%。 目前，转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、 抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程 等领域。如抗虫基因工程将Bt基因导入棉花、玉米、水稻、烟草、马铃薯 等作物，毒杀害虫；或将胶蛋白酶抑制剂基因导入作物，干扰害虫消化作 用，而导致害虫死亡。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农 科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育 成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水 母发光基因导入烟草、芽菜、马铃薯等作物，获得发光作物，驱赶害虫。 目前在其它转基因工程方面也取得了许多成果，在此不能——例举。总之 在作物种类方面，大多集中在大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、 木瓜、西葫声七大类作物。
转基因水稻获得成功始于1986年，Uchimiya等首先获得了卡那霉素 抗性的转基因水稻愈伤组织，相隔2年，世界上就有3个实验室分别获得 了转基因水稻植林。纵观转基因水稻的发展历程，利用转基因技术开展水 稻遗传改良主要集中在下列几个方面 1 抗虫性
应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有3种，一是从苏云金杆菌分 离的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因(Bt基因)，二是从植物中分离出的昆 虫蛋白酶抑制剂(PI基因)，三是植物凝集素基因。科学家分别应用基因 枪法、农杆菌介导法、电击法等成功地将cryIA(b)、 cryIA(c)基因导入水 稻中，获得了转基因植林，经抗虫性检测，转基因植林对二化螟、三化螟、 大螟、稻纵巻叶螟等具有明显的致死效应。美国康奈尔大学1993年将豇 豆胰蛋白酶抑制剂基因CPT导入水稻获得转基因植林，对二化螟、三化螟 具有一定的抗性。Vain等将半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因导入水稻所得的 转基因植林使线虫的孵化率下降了 55 %。浙江大学应用Bt基因转化育成 的"克螟稻"已通过了浙江省科技厅的鉴定，1999年获准开展环境释放试 验。
2 抗病小生
曰本国家农业环境所成功地将水稻条紋叶枯病毒外壳蛋白基因RS V CP导入水稻获得转基因植林，接种后2 ~ 3周发现转基因植林只有2% - 3 % 发病，而对照则有95%~ 100%发病。
Christou等将Xa21基因导入水稻后，显著提高了水稻对白叶枯病和 稻瘟病的抗性。何迎春等将烟草几丁质酶基因导入水稻获得了高抗紋枯病 和稻瘟病转基因植林。四川农业大学将抗病和抗虫基因导入杂交稻的恢复 系中，获得了转基因的双抗杂交稻等。
3 抗除草剂
20世纪80年代，美国孟山都公司以其拥有广谱、高效除草剂农达(草 甘膦)的优势，率先开展除草剂抗菌性基因的转移研究与抗性品种的开发， 随后，美国艾格福公司(AgrEvo)抗广谱除草剂草铵膦转基因水稻和美国氰 胺公司的抗咪唑啉酮类除草剂转基因水稻相继问世。中国用于水稻抗除草 剂的基因主要是PPT乙酰转移酶基因，即抗Basta基因(bar)，目前也已 获得抗Basta水稻。
4 抗逆性
由于有关水稻抗逆基因的定位、克隆和分离工作难度较大，抗逆转基
因水稻的研究报道还不多。目前已经导入水稻的抗逆基因主要有烟草中的
CMO基因、甜菜碱生物合成酶基因codA和水稻耐淹能力有关的基因(pdc ， pdc , pdc)，将其转入水稻中分别获得了具有抗旱、耐碱、耐盐和耐渍的 转基因水稻植林。
5高产和优质性状
产量和品质是由多基因控制的综合性状，个别外源基因的导入只能使
其组成成分中单一因子的水平获得提高，而对其综合水平没有明显的影 响。目前提高水稻产量的基因工程主要设想是将高光效C4植物的磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和二磷酸核酮糖羧化酶基因(RuB pC)导入水稻 中，在水稻叶片的叶绿体中表达以提高水稻光合效率，达到增加产量的目 的。虽然Ku等将PEPC基因导入水稻，获得了光合效率提高近50 %的转基 因水稻，但离获得高产品种还相距甚远，只是为水稻大幅度增产带来了新 的希望。在品质改良方面，富脯氨酸基因、富甲硫氨酸和赖氨酸基因、八 氩番茄合成酶及其脱氢酶基因、大豆球蛋白基因和高赖氨酸基因等都已被 成功地导入水稻并获得了转基因植林，对于开发特用稻米产品具有非常重 要的意义。
随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的 食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常
规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植 物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA
导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以 更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍 然很有必要。
欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟 的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做 了不同规定，域值从1-5%不等。
我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，
于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管 理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目 录，并于2002年3月20日起正式实施。
转基因成分检测方法有Western blots、 ELISA、试纸条、竟争性PCR、 实时定量PCR和PCR- ELISA等。转基因作物的检测主要是检测样品是否含 有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作 物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试 纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序 抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性， 通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的 核酸检测方法主要有两种核酸分子杂交技术(Sourthern blot) , PCR 检测:技术。
目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包 括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竟争性定量PCR方法、荧光 定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法
定性PCR方法技术成熟，稳定，但反应体系和操作过程比较复杂，需 要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2-3小时，扩增结果 电泳时间需l小时左右；电泳常用染料EB是强致癌物，有较强毒性。实时 荧光定量PCR技术先进，灵敏度更高，扩增时间在l小时左右，扩增结果实 时在电脑上显示；能检测出样品中外源基因的数量信息(拷贝数)稳定性、 体系和操作同定性PCR相当，但仪器和耗材价格较高； 一台定量PCR在50万 元左右，不宜大范围推广。
发明内容
本发明的目的在于公开一种快速检测转基因抗虫水稻的方法及根据 外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观 察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判 断扩增情况。
本发明的^支术方案如下一种用于检测转基因抗虫水稻的特异性引物，其中外引物正向序列 AGGATTCACTGGTGGAGA，外引物反向序列GATTATCCAAGGAGGTAGCT;内引物 正向序列TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC ，内引物反 向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。
每条引物分别配制成浓度为IOOmM的母液，然后取外引物各lpL， 内引物各8pL,灭菌去离子水2iuL，充分混合，为引物混合溶液。
本发明采用上述一套$I物进行快速检测转基因抗虫水稻的方法，其特 征在于包括如下步骤
(1)采用权利要求1所述的4条特异引物及一种具有链置换活性的 DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65 。C进行45-60min，并且在80"C持续 2min， 4XM呆存;
其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25uL,其各种成分分别 为10 x Buffer 2. 5jiL, 4M甜菜碱6. 25)liL, 0. 2M MgS04 0. 25 yL，混 合引物ljiL， 10jiM dNTPs 3.5nL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5 UL，模板DNA l-5jaL,用灭菌去离子水补齐到25pL;
(2)扩增反应结束，取体系液3-25jiL，采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green,通过颜色变化观察有无扩 增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反
应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。'
本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为
8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2uL。
本发明所述的嵌入剂IOOO倍SYBR Green加入量为1-2 pL。 本发明所述的检测方法，模板DM指的待测样品采用CTAB法提取纯
化得到的DM。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法 做以详细的说明。 1、原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及
一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63r;-65匸对核酸进行扩增，短时间 扩增效率可达到10'-1(T个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易 检测等特点。
2、 引物设计
本研究依据转基因抗虫水稻外源基因与内源基因结合处序列设计了4 条引物。引物由大连宝生物公司合成。
表l引物序列表如下:_
引物名称 碱基数_序列(5'to3')_
Bt-F3 18 AGGATTCACTGGTGGAGA
Bt-B3 20 GATTATCCAAGGAGGTAGCT
Bt-FIP 44 TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC
Bt-BIP 47 TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA
3、 反应条件
反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因抗虫水稻特异性引 物、甜菜碱、MgS04和反应緩冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据 引物的效率和模板DNA质量变化， 一般为lh或更少。加入模板DNA，在63-65 X:进行45-60min,并且在8(TC,持续2min而终止。
这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行 的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等 昂贵的仪器。 材料与方法
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液；特异性引物;甜菜碱溶液；MgS(^溶液;dNTPs;
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25fiL，其各种成分及终浓度 分别为10xBuffer 2.5pL， 4M甜菜碱6.25jiL， 0. 2M MgS04 0. 25 n L, 引物混合液ljLiL， 10 pM dNTPs 3. 5pL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 l-2jiL，模板DNA l-5uL,用灭菌去离子水补齐到25 n L。
(3) 扩增反应过程在63-65 。C进行45-60min，并且在80lC持续2min,(4 )扩增反应结束，取体系液3-25 ja L用不同的检测方法判断扩增与否。
4、扩增结果，见察 有三种观察方法，适合不同情况下进行
1) 使用2%琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min,在紫外灯下 观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱 中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图l。
2) 由于反应形成大量双链DNA产物，所以可直接向扩增管中加入嵌入 剂SYBRGreen，紫外灯下或肉眼观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增 反应的管子将变为绿色。结果见图2。
3) 检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进 行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可以 用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明用于转基因抗虫水稻检测的扩增方法，具有以下优点
1) 操作简便不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应，不需 要预先进行双链DNA的变性。
2) 高特异性该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高 度特异性。
3) 快速高效整个扩增不到lh即可完成，产量可达到10'-10"个拷贝；
4) 灵敏度高扩增模板可仅为10拷贝甚至更少。
5) 鉴定简便可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过 SYBR Green颜色变化判断扩增与否。
图l为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、阴性对照、 阴性样品l、阴性样品2、阳性对照和阳性样品。
图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。左为阳性对照，右为阴性对照。
图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阳性对照、待测样品、阴性对照。
图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、待测 样品l、阳性对照和待测样品2。
图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左至右DL2000 DNA Marker、待 测样品l、待测样品2、阴性对照、阳性对照。
图6为实施例4，采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫 外灯下观察结果，其中M，DL2000 DNA， Marker; 1,5%; 2， 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5， 0.05%; 6， 0. 01%; 7， 0. 005%; 8，阴性对照。
图7为实施例4，常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫 外灯下观察结果。其中M，DL2000 DNA Marker; 1,5%; 2, 1%; 3， 0. 5°乂； 4,0.1%; 5， 0.05%; 6, 0. 01%; 7， 0. 005%; 8，阴性对照。
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以 详细的说明，在此需加以说明的是
l本发明所述的引物序列见表l。
2水稻模板DNA的提取常规CTAB法提取(见附件)。 实施例l
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0. 2M MgS04溶液；
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25jaL，其各种成分分别为 10 x Buffer 2. 5pL， 4M甜菜碱6.25yL， 0. 2M MgS04 0. 25 pL，混合引 物lyL, 10|aM dNTPs 3.5juL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l n L,才莫 板DNA lpL，用灭菌去离子水补齐到25pL，混合均匀后离心；
(3) 扩增反应程序在63t:进行60min，并且在80^C保温2min， 4'C，
保存；
(4) 扩增反应结束，取体系液10jiL，直接向扩增管中加入嵌入剂l pL 1000 xSYBR Green，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈 橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图3，由图可见，待测样 品为阳性样品，含有转基因抗虫水稻成份。
实施例2
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0. 2M MgS04溶液；
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL，其各种成分分别为 10xBuffer 2. 5yL， 4M甜菜碱6.25pL, 0. 2M MgS04，混合引物0.25p L ， 10 pM dNTPs 3. 5yL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2 p L，模板DNA 2juL,用灭菌去离子水补齐到25y L，混合均匀后离心；
(3) 扩增反应程序在65n进行45min，并且在80。C保温2min, 4t:，
保存；
(4) 扩增反应结束，取体系液15pL,直接向扩增管中加入嵌入剂2 ]LiL 1000 xSYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈 橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图4，由图可以看出，待 测样品l为阴性样品，不含有转基因抗虫水稻成分，样品2含有转基因抗虫 水稻成分。
实施例3
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DM聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0. 2M MgS04溶液；
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL,其各种成分分别为 10xBuffer 2. 5 y L， 4M甜菜碱6.25juL， 0. 2M MgS04，混合引物0.25jLi L , 10 nM dNTPs 3. 5jiL， 8000U/L Bst DM聚合酶大片段2yL,模板DNA 5|iL,用灭菌去离子水补齐到25pL，混合均匀后离心；
(3) 扩增反应程序在63。C进行60min，并且在80C保温2min， 4匸，
保存；
(4) 扩增反应结束，取体系液25ML经2yn琼脂糖凝胶电泳分析，紫外 灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶 梯状条带。结果见图5，样品不含有转基因抗虫水稻成分。
实施例4
'对比实验转基因抗虫水稻的定性PCR测定方法与本发明的测定方法
的对比
(1) 本发明方法试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍Buffer溶液；特异性引物混合液；4M甜菜碱溶液；0.2M MgS04溶液；DNA模板包括含有转基因抗虫水稻成份5"/。、 1%、 0.5%、 0.1%、 0.05%、 0.01%、 0.005%、 0. 001%的样品。
(2) 本发明扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL，其各种成分 分别为10xBuffer 2. 5yL, 4M甜菜碱6. 25 n L， 0. 2M MgS04 0. 25 ju L, 混合引物lyL， 10juMdNTPs 3.5juL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2ja L,模板DNA 5yL,用灭菌去离子水补齐到25jaL，混合均匀后离心；
(3) 本发明扩增反应程序在63'C进行60min，并且在80X:保温2niin， 4'C,保存；
(4) 本发明扩增反应结束，取体系液3uL，经2%琼脂糖凝胶电泳分 析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管 子出现阶梯状条带。结果见图6: M，DL2000 DNA, Marker; 1,5%; 2， 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5， 0.05%; 6, 0. 01%; 7, 0. 005%; 8，阴性对照。
PCR方法反应引物采用本发明反应中一对外引物F3和B3。 PCR反应 为25yL体系，10x PCRbuffer(Promega) 2. 5 jiL， 10 mM證Ps ( Promega ) 0. 5 jnL,上游和下游引物(10mM)各O. 5 pL, Taq酶(5 U/yL， Promega) 0.5 )aL， DM模板1jjL，灭菌去离子水19. 5 ju l。反应程序为95 。c预变 性5min， 95匸变性30 s, 58"C退火30 s, 72。C延伸30 s, 72 。C延伸7 min。 PCR产物取IO ML于2 d琼脂糖凝胶电泳，100 V电压下40 min，通过凝胶成 像分析仪观察,结果见图7: M，DL2000 DNA， Marker; 1,5%; 2,1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5, 0.05%; 6， 0. 01%; 7. 0. 005%; 8，阴性对照。
由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的 敏感度，能检测出转基因抗虫水稻含量更低的样品。
附件常规CTAB法提取水稻DNA
(1)取转基因抗虫水稻，约100mg,放入研钵中，加入少量液氮迅速
磨碎。液氮反复加入3~4次，磨碎成粉末为止；
(2) 加入1. 5mL预热至65r;的CTAB提取緩沖液，充分混合、悬浮试样(依 试样不同，可适当增加緩冲液的用量)，651C保育30min,期间不停颠倒 混匀；
(3) 约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入l倍体积的酚 氯仿异戊醇(25: 24: 1 )，充分混合。约12000g离心15min。转移上清 至一新离心管中；
(4) 加入1倍体积的氯仿异戊醇(24: 1),充分混合。约12000g离 心15min。转移上清至一新离心管中；
(5) 加入2倍体积CTAB沉淀緩冲液，室温静置保育60min; 12000g离心 15min，弃上清；加入350 u L氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10 min， 转移上清至一新离心管。
(6) 加入0. 6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。 12000g离心15min。弃上清。加入500 n L70%乙醇溶液，并颠倒离心管数 次。12000g离心10min。弃上清。
(7) 干燥DNA沉淀，加IOO ji L水或TE緩沖液溶解DNA。
序列表
<110>天津巿农业科学院中心实验室
<120> —种快速检测转基因抗虫水稻的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 18bp
<212> 廳
<213> 人工序列
<權> 1
aggattcact ggtggaga 18
<210> 2
<211〉 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gattatccaa ggaggtagct 20
<210> 3 <211> 44bp <212>醒 <213>人工序列 <400> 3
tgggaagtga attggaactt caatacctcg tUgactcaa cage 44
<210> 4 <211> 47bp <212> ■ <213> 人工序列 <400> 4
tctaccagat atagagttcg tgtgagaaga tggatgaatt accccaa 4权利要求
1、用于检测转基因抗虫水稻的特异性引物，其特征在于，包括外引物正向序列AGGATTCACTGGTGGAGA，外引物反向序列GATTATCCAAGGAGGTAGCT；内引物正向序列TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC，内引物反向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。
2、 一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因抗虫水稻方 法，其特征在于包括如下步骤(1)采用权利要求1所述的4条特异引物及一种具有链置换活性的 DNA聚合酶，加入才莫板DNA,在63-65℃进行45-60min，并且在8℃持续 2min, 4℃保存；其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25jliL，其各种成分分别 为10 x Buffer 2.5 ]uL, 4M甜菜碱6.25UL， 0. 2M MgS04 0. 25 n L，引 物混合液lpL, 10pM dNTPs 3.5pL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1-5 mL,模板DM l-5pL，用灭菌去离子水补齐到25yL;(2)扩增反应结束，取体系液3-25nL,采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green,通过颜色变化观察有无扩 增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
3、 如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是 将合成的引物粉末分别配成浓度为100nM的母液，然后取外引物各luL, 内引物各8nL，加灭菌去离子水2uL，充分混合，制得引物混合溶液。
4、 如权利要求2所述的检测方法，其中嵌入剂SYBR Green加入量为l-2 uL。
5、 如权利要求2所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DM聚 合酶为8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2pL。
全文摘要
本发明公开了一种转基因抗虫水稻的快速检测方法。其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。
文档编号C12N15/11GK101343665SQ20081005428
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者兰青阔, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 赵 申请人:天津市农业科学院中心实验室