专利名称：一种羰酰还原酶在生产(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种羰酰还原酶的应用，尤其涉及一种羰酰还原酶 (Ccarbonyl Rreductase CR)在以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原反应生产(S)-4-氯-3羟 基丁酸乙酯中的应用。
背景技术：
(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate， (S)-CHBE)是一种 重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶垸酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。
以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作为还原反应的潜手性底物， 易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效 的制备途径。
迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括 起来主要有化学法和生物法。
化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂的贵铑、釕等金属，采用化学法合 成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗 能高，污染大。
微生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimizu等用来自S/wo6o/owyce;y m/附o"!'co/oMA:C/ W"的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系[2]和水/有 机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的 酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比， 应用较少。全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S)—CHBE两种， Yasohara等[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Ca"&由wag o//ae，在水/乙酸正丁 酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的 条件下产物(S) -CHBE在有机相的积累浓度可达90 g/L，产物的光学纯度对映体过 量值(enantiomeric excess e.e)达到96%。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化 COBE为不同构型CHBE的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活 性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着 重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。 Yasohara等[5] 从木兰假丝酵母菌Om^/a ;m^zo//ae中分离得到了 一个辅酶NADPH依赖型的羰基还 原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶
NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原(S)-CHBE，其 得率和光学纯度分别为85%和100%e.e. [6]。
综上所述，现有催化COBE为(S)-CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性底、 成本高等问题。
本专利中涉及到的还原酶是羰酰还原酶的一种，其包含282个氨基酸，其在Genbank 中的收录号为XP—001387287 ， ( http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=protein&id=
126273732)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。编码该蛋白的基因含有849bp碱 基，其在Genbank中的收录号为XM—001387250， (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi val= XM—001387250.1),其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。至今未发现该 羰酰还原酶用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。参考文献
Karanewsky DS, Badia MC， Ciosek CP Jr, Robl JF, Sofia MJ, Simpkins LM, DeLange B， Harrity TW, Biller SA， Gorden EM (1990) Phosphorus-containing inhibitors of HMG陽CoA reductase. 1. 4画[2誦arylethyl]陽hydroxyphosphinyl]-3-hydroxybutanoic acids: a new class of cell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis. J Med Chem 33:2925—2956。 [2] Shimizu S, Kataoka M，Morishita A Katoh M, Morikawa T, Miyoshi T,Yamada H(1990a) Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl 4-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnol lett 12:593-596。' Shimizu S, Kataoka M, Katoh M, Morikawa T，Miyoshi T,Yamada H(1990b) Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate by a microbial aldehyde reductase in an organic solvent-water diphasic system. Appl Environ Microbiol 56: 2374-2377。 [4] Yasohara Y， Kizaki N， Hasegawa J， Takahashi S， Wada M, Kataoka M， Shimizu S (1999) Synthesis of optically activeethyl 4-chloro-3- hydroxybutanoate by microbial reduction. Appl Microbiol Biotechnol 51:847—851 。 Wada M， Kataoka M, Kawabata H， Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, Shimizu S (1998) Purification and characterization of NADPH-ependent carbonyl reductase involved in stereoselective reduction of .ethyl 4-ehloro-3-oxobutanoate， from Candida magnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 62:280-285。 Yasohara Y， Kizaki N, Hasegawa J, Wada M, Kataoka M, Shimizu S (2000) Molecular cloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbonyl reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate, from Candida magnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 64:1430-1436。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种羰酰还原酶在COBE不对称还原制备 (S)-CHBE中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下
一种氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE) 不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)中的应用。
即以氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙 酯为底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(还原型辅酶II， NADPH)为辅因 子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
具体反应是将表达基因序列如SEQ ID NO: 1所示的重组菌，经过破碎后与 200mmol/L~2mol/L葡萄糖、1.5~300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脱氢 酶(glucose dehydrogenase, GDH)和0.05 0.5mmol/L的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 磷酸(氧化型辅酶II ， NADP)，在pH6.0~7.5、 20~30°C、 180~280rpm条件下反应16~32h， 得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。其中，加入NADP与GDH即生成NADPH，且使反应循 环进行，降低了加入量以减少了生产成本。
发明人基于现代生物信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从毕 赤酵母户/cA&S/^z'他CBS 6054克隆羰酰还原酶的基因，在大肠杆菌中表达后发现其在 水相中能够高效的催化COBE为(S)-CHBE， e.e值为100%。同时，通过在水/有机相中 反应、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和产物对细胞和酶的抑制作用，显著的 提高了转化效果。通过对羰酰还原酶的基因进行重组表达，获得了具有新型催化功能的 酶蛋白，开发了该条基因的新功能——催化非天然底物COBE为高立体选择性的 (S)-CHBE。
有益效果本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的羰酰还原酶应用于 COBE不对称还原制备(S)-CHBE中，取得很好的效果，其酶活高达32U/mg，而Yasohara 从木兰假丝酵母菌Om^fo wflgno^e中分离得到的羰基还原酶，其酶活只有 13.7U/mg[6]。氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的羰酰还原酶对底物COBE的得率高(大 于95%)、产物CHBE的光学活性高(e.e。/。为100%)，且产量高，大大降低了生产成本。
图l为羰酰还原酶基因的构建图。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会
限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例.l:重组大肠杆菌Eco/iRosseta (pET22b-PsCR)的构建
1、 羰酰还原酶基因的获取
毕赤酵母尸/c/H'fl S印/泡CBS 6054 (购于Centraalbureau voor Schi腿elcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre),培养基YPD (g七")酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄 糖20g,补蒸馏水至1L。
将毕赤酵母i>/c/ 'a CBS 6054接种于5mLYPD液体培养基中30'C培养至对数
生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试 剂盒)提取基因组。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下
上游引物(CR-sense含Nde I)为5' GGAATTCCATATGACCAACAACCCGAGCAT 下游引物(CR-anti含BamHI)为CGCGGATCCCTATGGCGCACAGTAGCCTCC
所有引物均由上海申能博彩公司合成。
基因的PCR条件
94 。C变性7 min，按如下参数循环30次94 'C变性1 min， 60 。C退火50 s， 72 °C 延伸1.5 min。最后72 。C延伸10 min。
2、 基因的表达
用Nde I及BamH I分别酶切pET-22b (pET-22b购于Novagen(默克中国))及所扩 增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双 酶切的表达载体pET-22b与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物 pET-22b-PsCR加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min， 42。C热激 90sec。冰上放置2min。加入预热的0.45mL培养基。220rpm 37°C lh。将200uL菌液加 入分别含有100ug/mL的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37'C过夜培养12—16h。 构建图谱见图1。
3、 酶活的测定
挑取重组菌五.co/z'Rosseta (pET-22b-PsCR)及出发大肠杆菌Rosseta (DE3)至含抗 生素的LB液体培养基中，37'C振荡培养过夜。然后按2 %接种量分别接种到新鲜培养 液中，37 。C培养至OD6oo约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8 mmol'L/1， 25°C， 220rpm， 诱导表达10h后，离心(4。C， 5000rpm， 15min)，菌泥用100mM磷酸钾缓冲(pH7.0)重
悬，超声破碎细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4。C， 12000rpm， 15min)，
测定上清中的酶活。
酶反应体系包括lOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)， 5mMNADPH， 20mM COBE， 30'C， 340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化ltimolNADPH所需要的酶量为 一个酶活单位u。蛋白采用Brandford法进行测定。
结果显示，出发大肠杆菌Rosseta (DE3)的比酶活为0.12U/mg，而重组菌E.coli Rosseta (pET22b-PsCR)的比酶活为32U/mg，高于能够催化该底物COBE为(S)-CHBE 的羰基还原酶的最高报道(Sl的比酶活为13.7U/mg[6])。
实施例2:重组大肠杆菌￡.co//Rosseta (pET22b-PsCR)的发酵
挑取重组菌￡.co//Rosseta (pET-22b-PsCR)至含抗生素的LB培养液，37。C振荡培 养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37t)培养至OD6()()约为0.6时， 加入1 10至终浓度0.811111101.1/1， 25°C， 220rpm，诱导表达10h后，8000 rpm， 4 。C离 心10min，弃上清，沉淀备用。
实施例3:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(100 mmol丄-l ， pH 6.5)洗涤两次，称取0.5g (湿 重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15 mL的pH 6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W, 超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖200讓ol/L， COBE 1.5g/L， GDH 50U， NADP 0.05mmol/L， 20°C, 180rpm， 16h。产物(S)-CHBE的产量为1.45g/L，产物的得率为 96.7% ，光学纯度e.e。/o为100% 。
产物的检测方法如下(以下实施例中产物的检测方法与实施例3相同) 对于水相反应反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10min然后放置两 小时，8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，力口 入内标，保存测样。
对于水/有机两相反应反应结束后8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心 吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。
PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为检测器FID，温度210'C，汽化室温度 210°C，柱温150。C，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气O.lMPaJl吹0.08MPa。用 HPLC对(S)- 4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱Chiralcel OB，4.6x250mm; Daicel Chemical Industries,日本)，检测条件流动相为正己烷正己烷(9:1),波长214nm， 流量为0.8mL/min， ，R型和S型CHBE的出峰时间分别为10.5min和11.6min。
实施例4:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(100 mmol丄-l， pH 7.5)洗涤两次，称取lg (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于15 mL的pH 7.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W， 超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖50O腿ol/L， COBE 25g/L(0、 1、 2、 8、 14h 各5g/L )， GDH200U， NADP 0.1腿ol/L， 25°C， 220rpm， 24h。产物(S)隱CHBE的产量 为24.1g/L，产物的得率为96.4%，光学纯度e.ey。为100%。
实施例5:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOO mmol七-l， pH 7.0)洗涤两次，称取2g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于50mL的pH 7.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W， 超声5s'，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖600mmol/L， COBE 35g/L(0、 1、 2、 8、 14h 各7g/L )， GDH500U， NADP 0.15腿ol/L， 30。C， 240rpm， 28h。产物(S)-CHBE的产 量为33.5g/L,产物的得率为95.7%，光学纯度e.e。/。为100% 。
实施例6:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOO mmol七-l， pH 6.0)洗漆两次，称取4g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于50 mL的pH 6.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W， 超声5s，间歇5s，共5min)，加入葡萄糖1.5mol/L， 50mL乙酸正丁酯(可促进COBE 的溶解并解除底物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入COBE 100g/L(0、 2、 4、 6、 10 各20g/L )， GDH3KU， NADP 0.3mmol/L， 2(TC, 240rpm， 28h。产物(S)-CHBE的产量 为97.1g/L，产物的得率为97.1%，光学纯度e.e。/。为100%。
实施例7:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOO mmol七-l， pH 6.5)洗涤两次，称取2g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于15 mL的pH 6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W， 超声5s，间歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物 和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖lmol/L, COBE 50g/L(0、 2、 4、 6、 10各 10g/L )， GDH2KU， NADP 0.2mmol/L， 20°C， 240rpm， 28h。产物(S)-CHBE的产量为 47.6g/L，产物的得率为95.2%,光学纯度e.e。/c为100% 。
实施例8:
取实施例2的沉淀用磷酸钾缓冲(IOO mmol七-l， pH 6.5)洗漆两次，称取10g (湿
重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于200 mL的pH 6.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W, 超声5s，间歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底 物和产物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L， COBE 300g/L(0、 2、 4、 6、 10 各60g/L )， GDH5KU， NADP 0.5腿ol/L， 25°C， 280rpm， 32h。产物(S)-CHBE的产量 为288.7g/L，产物的得率为96.2%，光学纯度e.e。/。为100% 。序 列 表
<110>南京工业大学
<120> —种羰酰还原酶在生产(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用
<130> njut080822
<160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 849
<212> DNA
<213>毕赤酵母(PichiastipitisCBS6054)
<220>
<221> CDS <222> (1)..(849)
<400> 1
atg acc aac aac ccg agc atc acc tct cat ate aac get gcc gtg ggt 48 Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
cct etc cct act aag get ccc aaa ctt gcg tct aac gtg ttg gat tta 96 Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu 20 25 30
ttt tct etc aag ggt aag gta get tec att act ggc tct tea gcc ggg 144 Phe Ser Leu Lys Gly Lys VaJ Ala Ser lie Thr Gly Ser Ser Ala Gly 35 40 45
ata ggt ctt get gta gcc gag gca tac get ca_g get ggt get gat gtt 192 lie Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gin Ala Gly Ala Asp Val 50 55 60
gca ate tgg tac aac tec cag cct get aag gaa aag gcc gac aag ata 240 Ala lie Trp Tyr Asn Ser Gin Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys lie 65 70 75 80
gcc aag acg tat ggt gta cgt tgc aga get tat aag tgt aat gtt tea 288 Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95
gat cag cag gat gtt gaa acc act gtg get cag ate gag get gac ttt 336 Asp Gin Gin Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gin lie Glu Ala Asp Phe 100 105 110
ggc acc ata gat ate ttt gtt gcc aat gcc ggt gtt ccc tgg act gaa 384 Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
ggc gaa agt gta gaa att gac aac ttt gac tec tgg aaa aag gtc ata 432 Gly Glu Ser Val Glu lie Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val lie 130 135 140
gac tta gac ttg tct ggg get tac tac tgt gca cat gcg get ggt aag 480 Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys 145 150 155 160
ate ttt aag aaa aac ggc aag ggc tec atg att ttc acc get tct atg 528 lie Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met lie Phe Thr Ala Ser Met 165 170 175
tct ggt cac att gtg aat att cct caa ttc cag get cct tac aac get 576 Ser Gly His lie Val Asn lie Pro Gin Phe Gin Ala Pro Tyr Asn Ala 180 185 190
gcc aag get gcg gtg ttg cac ttg age aaa teg ttg get ata gaa tgg 624 Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala lie Glu Trp 195 200 205
get cct ttt gcc aga gtc aat acg att teg cca gga tac att gtc acc 672 Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr lie Ser Pro Gly Tyr lie Val Thr 210 215 220
gag ate teg gac ttt gtc tea gac gac ate aag tec aag tgg tgg cag 720 Glu lie Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp lie Lys Ser Lys Trp Trp Gin 225 230 235 240
ttt att cct ctt ggt aga gag gga gtc aca caa gag ttg gtt ggt gcc 768 Phe lie Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gin Glu Leu Val Gly Ala 245 250 255
tac ttg tac ttt get tct gat gcc tct aca tat act acg gga tea gat 816 Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp 260 265 270
ctt ate gtc gat gga ggc tac tgt gcg cca tag 849 Leu lie Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro 275 280
<210> 2 <211> 282 <212> PRT
<213> 毕赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054) <400> 2
Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu 20 25 30
Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser lie Thr Gly Ser Ser Ala Gly 35 40 45
lie Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gin Ala Gly Ala Asp Val 50 55 60
Ala lie Trp Tyr Asn Ser Gin Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys lie 65 70 75 80
Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95
Asp Gin Gin Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gin lie Glu Ala Asp Phe 100 105 110
Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
Gly Glu Ser Val Glu lie Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val lie 130 135 140
Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys 145 150 155 160
lie Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met lie Phe Thr Ala Ser Met 165 170 175
Ser Gly His lie Val Asn lie Pro Gin Phe Gin Ala Pro Tyr Asn Ala 180 185 190
Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala lie Glu Trp 195 200 205
Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr lie Ser Pro Gly Tyr lie Val Thr 210 215 220Glu lie Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp lie Lys Ser Lys Trp Trp Gin 225 230 235 240
Phe lie Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gin Glu Leu Val Gly Ala 245 250 255
Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp 260 265 270
Leu lie Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro 275 280
权利要求
1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示 的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还 原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于表达基因序列如SEQ ID NO: 1所示 的重组菌，经过破碎后与200mmol/L~2mol/L葡萄糖、1.5~300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、 50U~5KU的葡萄糖脱氢酶和0.05~0.5mmol/L的NADP，在pH6.0 7.5、 20~30°C、 180~280rpm条件下反应16~32h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
全文摘要
本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶应用于4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其对底物的得率高达95％、产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
文档编号C12N9/02GK101372699SQ20081012475
公开日2009年2月25日 申请日期2008年9月2日 优先权日2008年9月2日
发明者明 严, 齐 叶, 应汉杰, 李振江, 柏建新, 健 熊, 琳 许, 勇 陈 申请人:南京工业大学