专利名称：一种羰酰还原酶在生产(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种羰酰还原酶的应用，尤其涉及一种羰酰还 原酶(Carbonyl Reductase CR)在以4_氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原反应生产 (S) -4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
背景技术：
(S)-4-氯-3 羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE) 是一种重要的手性中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloroacetoacetate，C0BE)作为还原反应的潜 手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经 济有效的制备途径。迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道，概括起 来主要有化学法和生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂贵的铑、釕等金属，采用化学法合 成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能 高，污染大。微生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimizu等用来自 Sporobolomycessalmonicolor AKU 4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系 [2]和水/有机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应 所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相 比，应用较少。全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S)-CHBE两种， Yasohara等[4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Candida magnoliae，在水/乙酸正丁酯 体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制PH值的条件下产物 (S)-CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L，产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e.e.)达到96%。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化COBE为不同构型 CHBE的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，筛选到高 立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不 对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。Yasohara等[5]从木兰假丝酵母菌Candida magnoliae中分离得到了一个辅酶 NADPH依赖型的羰基还原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定 时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原 (S)-CHBE，其得率和光学纯度分别为85% e. e.和100% e. e. [6]。现有的羰酰还原酶大多为辅酶NADPH依赖型，包括来源于P. stipitis的 PsCRI [7]，来源于 Candida magnoliae 的 S 1[6]等。到目前，仅有来源于 Kluyveromyces
3aestuarii的KaCR为辅酶NADH依赖型，其活力很低，仅3. 06U/mg[8]。综上所述，现有催化COBE为(S) -CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性低、 成本高等问题。本专利中涉及到的还原酶是羰酰还原酶的一种，其包含285个氨基酸，其在 Genbank 中的收录号为 XP_001387285. 1，ACCESSION ΧΡ_001387285 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/XP_001387285. 1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。编码该蛋白的 基因含有 858bp，其在 Genbank 中的收录号为 XM_001387248. 1 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/126256851)，其基因序列如SEQ IDNO 1所示。至今未发现该羰酰还原酶用于 COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。参考文献[IjKaranewsky DS, Badia MC, Ciosek CP Jr, Robl JF, Sofia MJ, Simpkins LM, DeLange B,Harrity Tff,Biller SA,Gorden EM(1990)Phosphorus-containing inhibitors of HMG-CoAreductase. 1.4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl]-3-hydroxybutanoic acids :a new class ofcell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis. J Med Chem 33 :2925_2956。[2]Shimizu S, Kataoka M, Morishita A, Katoh M, Morikawa T, Miyoshi T, Yamada H(1990a)Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl4-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnol Iett 12: 593-596 ο[3]Shimizu S, Kataoka M, Karoh M, Morikawa T, Miyoshi T, Yamada H(1990b) Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutaoate by a microbial aldehyde reductasein an organic solvent-water diphasic system. Appl Environ Microbiol 56 :2374_2377。[4]Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, Takahashi S, Wada M, Kataoka M, Shimizu S(1999)Synthesis of optically activeethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction. ApplMicrobiol Biotechnol 51:847—851。[5]Wada M,Kataoka M,Kawabata H,Yasohara Y,Kizaki N,Hasegawa J,Shimizu S (1998)Purification and characterization of NADPH-dependent carbonyl reductase involved instereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate, from Candida magnoliae. BiosciBiotechnol Biochem 62:280-285。[6]Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, Wada M, Kataoka M, Shimizu S (2000) Molecularcloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbonyl reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate, from Candidamagnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 64
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种羰酰还原酶在COBE不对称还原制备 (S) -CHBE中的应用。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下一种氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的羰酰还原酶在4_氯乙酰乙酸乙酯(COBE) 不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4_氯乙酰乙酸乙 酯为底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶I，NADH)为辅因子，不对称还原 制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。具体反应是将表达基因序列如SEQ ID NO 1所示的重组菌，经过破碎后与 200mmol/L 2mol/L葡萄糖、1. 6 320g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脱 氢酶(glucose dehydrogenase, GDH)和0. 05 0. 5mmol/L的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸(氧化型辅酶I，NAD)，在pH6. O 7. 5,20 30°C、150 300rpm条件下反应15 30h， 得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。其中，加入NAD+与⑶H即能再生成NADH，且使反应循环 进行，降低了加入量以减少了生产成本。发明人基于现代生物信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从 毕赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054克隆羰酰还原酶的基因，在大肠杆菌中表达后发现其 在水相中能够高效催化COBE为(S)-CHBE，e. e.值为100%。同时，通过在水/有机相中反 应、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和产物对细胞和酶的抑制作用，显著的提高了 转化效果。通过对羰酰还原酶的基因进行重组表达，获得了具有新型催化功能的酶蛋白，开 发了该条基因的新功能——催化非天然底物COBE为高立体选择性的(S)-CHBE。有益效果本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的羰酰还原酶应用于 COBE不对称还原制备(S) -CHBE中，取得很好的效果，其酶活高达15U/mg，而Yamamoto从海 洋酵母菌Kluyveromyces aestuarii中分离得到的羰基还原酶，其酶活只有3. 06U/mg[8]。 氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的羰酰还原酶对底物COBE的得率高(大于91 % )，产物 CHBE的光学活性高(e.e.为100% )，且产量高，大大降低了生产成本。本专利中涉及的辅酶NADH-依赖羰基还原酶是除了 NADPH依赖羰基还原酶之外， 在已报道还原酶中活力最高。而NADH比NADPH更为廉价，NADH价格约为300元/克，而 NADPH约为8000元/克。氧化型辅酶NAD+价格约100元/克，NADP+价格约1500元/克。 因此，使用本发明的羰酰还原酶应用于COBE不对称还原制备(S) -CHBE中，无疑可以极大的 降低生产成本。
图1为羰酰还原酶基因的构建图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。实施例1 羰酰还原酶基因的获取毕赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054 (购于 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre)，培养基 YPD (g · L-1)酵母提取物 10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，补蒸馏水至IL0将毕赤酵母Pichia Stipitis CBS 6054接种于5mLYPD液体培养基中30°C培养至 对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试 剂盒)提取基因组。构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下上游引物(CRII-sense含 Nde I)为5， -GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC-3‘下游引物(CRII-anti含 BamH I)为5’ -CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT-3‘所有引物均由上海申能博彩公司合成。基因的PCR条件94°C变性7min，按如下参数循环30次94°C变性lmin，60°C退火50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 IOmin0实施例2:基因的表达用Nde I 及 BamH I 分别酶切 pET_22b (pET_22b 购于 Novagen (默克中国))及 所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已 双酶切的表达载体pET-22b与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将IOuL的连接产物 pET-22b-PsCRII加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42°C热激 90sec。冰上放置2min。加入预热的0. 45mL培养基。220rpm 37°C C Ih0将200uL菌液加 入分别含有100 μ g/mL的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养12_16h。构建图 谱见图1。实施例3 酶活的测定挑取重组菌E.coli Rosseta(pET-22b-PsCR)及出发大肠杆菌Rosseta(DE3)至含 抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液 中，37°C培养至OD600约为0. 6时，加入IPTG至终浓度0. 8mmol · Λ 25°C，220rpm,诱导表达 IOh后，离心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸钾缓冲(pH7. 0)重悬，超声破碎细胞 (功率300W，超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4°C, 12000rpm, 15min)，测定上清中的酶活。酶反应体系包括IOOmM 磷酸钾缓冲液(pH6. 0)，5mM NADH, 20mM COBE, 30°C，340nm 处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化lymol NADH所需要的酶量为一个酶活单 位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，出发大肠杆菌Rosseta (DE3)的比酶活为0. 13U/mg,而重组菌 E. coliRosseta(pET22b-PsCRII)的比酶活为15U/mg,高于能够催化该底物COBE为(S)-CHBE的羰基还原酶的最高报道(Si的比酶活为13. 7U/mg[6])。实施例4 重组大肠杆菌 Ε. coli Rosseta(pET-22b-PsCRII)的发酵挑取重组菌Ε. coli Rosseta (pET-22b-PsCRII)至含抗生素的LB培养液，37°C振 荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37°C培养至0D_约为0. 6时，加 入 IPTG 至终浓度 0. 8mmol/L，25°C，220rpm，诱导表达 IOh 后，8000rpm，4°C离心 lOmin，弃上 清，沉淀备用。实施例5 取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗涤两次，称取0. 5g (湿 重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH6. 5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超 声 5s，间歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 200mmol/L，COBE 1. 5g/L, GDH 50U, NAD 0. 05mmol/ L，20°C，180rpm，16h。产物(S)-CHBE的产量为1. 38g/L，产物的得率为92. 0%，光学纯度 e. e.为 100%。实施例6:取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 7. 5)洗涤两次，称取Ig (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH 7.5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超 声 5s，间歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 500mmol/L，COBE 25g/L(0、l、2、8、14h 各 5g/L)，GDH 200U，NAD 0. lmmol/L，25°C，220rpm，24h。产物(S)-CHBE 的产量为 23. lg/L，产物的得率为 92. 4%，光学纯度e. e.为100%。实施例7 取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 7. 0)洗涤两次，称取2g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于50mL的pH 7.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s， 间歇 5s，共 5min)，加入葡萄糖 600mmol/L, COBE 35g/L (0、1、2、8、14h 各 7g/L)，GDH500U, NAD 0. 15mmol/L，30°C，240rpm，28h。产物(S)-CHBE 的产量为 32. 3g/L，产物的得率为92. 3%, 光学纯度e. e. %为100%。实施例8 取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 6. 0)洗涤两次，称取4g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于50mL的pH 6.0磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声5s， 间歇5s，共5min)，加入葡萄糖1. 5mol/L, 50mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底 物和产物对酶和细胞的抑制作用)JnACOBE 100g/L(0、2、4、6、10各20g/L)，⑶H 3KU，NAD 0. 3mmol/L，20°C，240rpm，28h。产物(S)-CHBE 的产量为 95. 2g/L，产物的得率为-.95.2%, 光学纯度e. e为100%。实施例9 取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗涤两次，称取2g (湿重) 的大肠杆菌菌泥，悬浮于15mL的pH 6. 5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W，超声 5s,间歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产物对酶 和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖Imol/L,C0BE 50g/L (0、2、4、6、10各10g/L)，⑶H 2KU，NAD 0. 2mmol/L,20°C,240rpm,28ho 产物(S)-CHBE 的产量为 46. 9g/L，产物的得率为-.93.8%, 光学纯度e. e为100%。实施例10
7
取实施例4的沉淀用磷酸钾缓冲(lOOmmol/L，pH 6. 5)洗涤两次，称取IOg(湿 重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于200mL的pH 6. 5磷酸钾缓冲中。超声处理细胞(功率300W， 超声5s，间歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促进COBE的溶解并解除底物和产 物对酶和细胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L，COBE 300g/L(0、2、4、6、10各60g/L)，⑶H 5KU，NAD 0. 5mmol/L，25°C，280rpm，32h。产物(S)-CHBE 的产量为 276. 6g/L，产物的得率为 92. 2%，光学纯度e. e.为100%。实施例11 产物的检测方法对于水相反应反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡IOmin然后放置两小 时，SOOOrpm离心IOmin分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保
存测样。对于水/有机两相反应反应结束后SOOOrpm离心IOmin分离有机层和水层。小 心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为检测器FID，温度210°C，汽化室温度 210°C，柱温 1500C，柱头压 0. 03MPa,氢气 0. 05MPa,空气 0. IMPa,尾吹 0. 08MPa。用 HPLC 对 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱Chiralcel 0B,4. 6X 250mm ；Daicel Chemical Industries，日本)，检测条件流动相为正己烷正己烷(9 1)，波长214nm， 流量为0. 8mL/min, R型和S型CHBE的出峰时间分别为10. 5min和11. 6min。
权利要求
一种氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶在4 氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S) 4 氯 3羟基丁酸乙酯中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以氨基酸序列如SEQID N0:2所示的 羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备 (S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于表达基因序列如SEQID NO :1所示的重组 菌，经过破碎后与200mmol/L 2mol/L葡萄糖、1. 6 320g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU 的葡萄糖脱氢酶和 0. 05 0. 5mmol/L 的 NAD，在 pH6. 0 7. 5、20 30°C、150 300rpm 条件下反应15 30h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
全文摘要
本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰还原酶应用于4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高达15U/mg，其对底物的得率高达91％，产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
文档编号C12P7/62GK101962661SQ20101021372
公开日2011年2月2日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者叶齐, 应汉杰, 张月圆, 曹厚, 栗西木, 熊健, 王艳, 陈勇 申请人:南京工业大学