专利名称：：由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的减小方法
技术领域：
：本发明涉及由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的减小方法。
背景技术：
：在临床检查领域，广泛使用由测定对象成分生成过氧化氢，再通过对该过氧化氢进行定量来测定对象成分的样品中浓度的方法。在这种方法中，由测定对象成分以外的物质所生成的过氧化氢成为测定值误差的主要原因，因此一般采用的方法是通过以下方法来消除由测定对象成分以外的物质所生成的过氧化氢，即、使过氧化氢酶作用而分解成水和氧的方法、或使用过氧化物酶而与酚系或者苯胺系氢供体化合物反应转化成无色醌的方法。例如，在中性脂肪测定用试剂中被用于内源性游离甘油的消除体系、在肌酸酐测定试剂中被用于肌酸和肌氨酸(YA二〉>)的消除体系、在HDL-胆甾醇或LDL-胆甾醇测定用试剂中被用于目标成分以外的脂蛋白中胆甾醇的消除体系。应予说明，迄今为止，作为利用过氧化氢酶的测定体系中所用的过氧化氢酶，一般使用来源于牛的过氧化氢酶。其中，虽常使用基于过氧化氢酶的消除体系，但有时会由于混入抑制过氧化氢酶的成分而受妨碍。特别是叠氮化物的混入即使极微量也会强有力地抑制过氧化氢酶，因此妨碍消除体系、无法充分消除产生自测定对象成分以外的过氧化氢，因而使测定值产生误差。叠氮化钠之类的叠氮化物在临床检查领域被广泛用作防腐剂，混入测定体系的可能性非常高。测定体系中叠氮化物的混入已知以下几种情形测定样品本身所含有的情形、叠氮化物从存在于附近的含叠氮化物试剂中作为叠氮化氢气化而溶入测定试剂中的情形、经由自动分析装置的取样探针从其它含叠氮化物试剂中将叠氮化物带入测定试剂中的情形。专利文献1日本特开平10-14596号公报专利文献2日本特许第3164829号登载公报专利文献3日本特许第3058602号登载公报
发明内容发明要解决的问题因此，本发明的目的在于提供减小由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的方法，其是测定对象成分的定量方法，包含用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢。本发明人进行了深入研究，结果发现与以往使用的来源于牛的过氧化氢酶相比，来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶极难受到叠氮化物的抑制，因而想到通过使用来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶作为测定体系所用的过氧化氢酶，可以减小由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差，从而完成了本发明。即，本发明提供由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的减小方法，其特征在于，用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢，然后，通过将来源于测定对象成分的过氧化氢定量从而对上述测定对象成分进行定量，此时使用来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶作为上述过氧化氢酶。根据本发明，首次提供了减小由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的方法。根据本发明可以比以往更准确地对例如中性脂肪、LDL胆留醇、HDL胆留醇、肌酸酐等测定对象成分进行定量。具体实施例方式如上所述，本发明人得到了以下惊人发现与以往所用的来源于牛的过氧化氢酶相比，来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶极难受到叠氮化物的抑制。本发明基于该新发现。含血红素的过氧化氢酶即单功能过氧化氢酶可以分类为具有小亚基(5569kDa)的过氧化氢酶、和具有大亚基(75kDa以上)的过氧化氢酶。本发明的方法中所用的过氧化氢酶为具有上述大亚基(75kDa以上)的过氧化氢酶。作为本发明的方法中所用的上述过氧化氢酶的来源微生物，是来源于真菌、细菌和一部分古细菌的微生物，更具体而言，可以列举鹅柄孢壳菌(Podosporaanserina)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrossa)、暗黄枝抱(Cladosporiumfulvum)、构巢裸胞壳(Emericellanidulans)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)、耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、恶臭假单胞菌(Psuedomonasputida)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、富氏葡萄孢盘菌(Botryotiniafuckeliana)、紫瘢麦角菌(Clavic^pspurpurea)、烟曲菌(Aspergillusfumigatus)、荚膜组织胞菜菌(Ajellomycescapsulatus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑色曲霉(Aspergillusniger)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、百脉根中间根瘤菌(MesorhizobiumIoti)、幢虫微孢子虫(Nosemalocustae)、水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)等。已知细菌等生产多种过氧化氢酶，而具有大亚基(75kDa以上)的过氧化氢酶是本发明的方法中所用的过氧化氢酶。但是，上述具有大亚基的过氧化氢酶中即使混入了上述具有小亚基的过氧化氢酶也不会影响本发明的实施。上述微生物生产的过氧化氢酶中，作为具有大亚基(75kDa以上)的过氧化氢酶中公知的过氧化氢酶，可以列举鹅柄孢壳菌CatA(PodosporaanserinaCatA)、烟曲菌CatA(AspergillusfumigatusCatA)、构巢裸胞壳CatA(EmericellanidulansCatA)、荚膜^ΜΜΜCatA(AjellomycescapsulatusCatA)、；胃KatE(EscherichiaColiKatE)、大肠埃希氏菌K12(EscherichiacoliK12)、恶臭假单胞菌CatC(PseudomonasputidaCatC)、枯草芽孢杆菌过氧化氢酶2(Bacillussubtiliscatalase2)、枯草芽孢杆菌KatE(BacillussubtillisKatE)、坚强芽孢杆菌KatA(BacillusfirmusKatA)、鸟分枝杆菌KatE(MycobacteriumaviumKatE)、烟曲菌CatB(AspergillusfumigatusCatB)、荚膜CatB(AjellomycescapsulatusCatB)、丰勾CatA(Aspergi1lusnidulansCatA)、！IfeffiCatR(AspergiIlusnigerCatR)>IH±ff^CatC(AgrobacteriumtumefaciensCatC)、苜蓿中华根瘤菌CatC(SinorhizobiummelilotiCatC)、幢虫微孢子虫(Nosemalocustae)、7_K稻黄单胞菌KatX(XanthomonasoryzaeKatX)、野油菜黄单胞菌KatE(XanthomonascampestrisKatE)。在‘‘BacterialCatalaseintheMicrosporidianNosemalocustaeImplicationsforMicrosporidianMetabolismandGenomeEvolution”NaomiM.Fast等，EUKARYOTICCELL，Oct.2003，p.1069-1075中记载了这些过氧化氢酶在基因上近缘，此外，已知这些过氧化氢酶具有血红素d。众所周知，在基因上近缘的酶具有类似的特征。因此，本发明的方法中使用的过氧化氢酶不仅限于上述列举的过氧化氢酶，只要是在基因上近缘、具有血红素d、并具有75kDa以上亚基的过氧化氢酶即均可用于本发明的方法中。关于大亚基的分子量的上限，有取84kDa的报道或取90kDa的报道，但在基因上近缘的过氧化氢酶均可用于本发明的方法中。应予说明，“在基因上近缘”是指，通过基于氨基酸序列的常法进行系统分析，近缘者被分类至同一组中，例如将根据上述Fast等的文献中记载的方法而分类至组II中的过氧化氢酶彼此称为在基因上近缘。过氧化氢酶可以仅使用一种过氧化氢酶，也可以将两种以上的过氧化氢酶混合使用。另外，使用两种以上的过氧化氢酶时，可以是来源于同一种类微生物的过氧化氢酶，也可以是来源于不同种类的微生物的过氧化氢酶。这些来源于微生物的各种过氧化氢酶已有市售，可优选使用市售品。另外还可以通过用本领域技术人员公知的方法培养微生物，再从该培养物中纯化而得到。在混入测定体系抑制过氧化氢酶的叠氮化物中，成为各种成分的定量测定中的问题的主要是多用作防腐剂的叠氮化钠之类的叠氮化金属、或来源于它们的叠氮化氢等，但不仅限于此。本发明的方法可适用于以下所有定量方法，所述定量方法用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢，然后通过对来源于测定对象成分的过氧化氢进行定量从而测定上述测定对象成分。在本领域中这类定量方法本身各个方面广为人知。作为测定对象成分，可列举中性脂肪(甘油三酯)、HDL(高密度脂蛋白)胆留醇、LDL(低密度脂蛋白)胆留醇和肌酸酐等，但不仅限于此。应予说明，本发明的方法除了使用来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶作为过氧化氢酶之外，还可以通过直接实施现有的各测定对象成分的定量方法来实施。本发明的方法包括用来源于微生物的过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢后，再添加叠氮化物。本发明的方法中使用的过氧化氢酶不易受到叠氮化物的抑制，但可以通过使足够量的叠氮化物发挥作用来停止过氧化氢酶的过氧化氢分解反应。根据该方法，可以使定量反应中生成的过氧化氢不被过氧化氢酶分解。以上列举的各种测定对象成分的、使用过氧化氢酶的测定方法本身是众所周知的，不需要在此说明，但为了明确起见，在以下进行简单记载。中性脂肪(甘油三酯)例如可通过以下方法进行定量使甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶和过氧化氢酶作用于体液中所含的甘油，将由甘油生成的过氧化氢除去后，接着使脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶和色原作用于体液中的甘油三酯，由甘油三酯生成甘油、由甘油生成甘油-3-磷酸、由甘油-3-磷酸生成过氧化氢、再使该过氧化氢发色，然后通过测定其发色强度来进行定量(专利文献1)。HDL胆留醇例如可通过以下方法进行定量在维持pH58的缓冲液中、以及在2价金属离子的存在下，使胆留醇酯酶和胆留醇氧化酶作用于被测样品，用过氧化氢酶将生成的过氧化氢除去，由此消除被测样品中除高密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆留醇，然后向上述第1工序的产物中加入特异性作用于高密度脂蛋白的、HLB为1314的表面活性齐U，将由胆留醇酯酶和胆留醇氧化酶的作用而生成的过氧化氢定量从而对高密度脂蛋白中的胆留醇进行定量(专利文献2)。LDL胆留醇例如可通过以下方法进行定量在含有胺的缓冲液、以及作用于低密度脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂的存在下，使胆留醇酯酶和胆留醇氧化酶发挥作用，用过氧化氢酶除去生成的过氧化氢，由此消除被测样品中的高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒中的胆留醇，然后，将被测样品中的残留胆留醇定量从而对LDL胆留醇进行定量(专利文献3)。肌酸酐例如可通过以下方法进行定量使肌酸脒基水解酶(creatineamidinohydrolase)、肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶作用于体液中所含的肌酸，将由肌酸生成的过氧化氢除去后，接着使肌酸酐酰胺水解酶(creatinineamidehydrolase)、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶和色原作用于体液中的肌酸酐，由肌酸酐生成肌酸、由肌酸生成肌氨酸、由肌氨酸生成过氧化氢、再使该过氧化氢发色后，通过测定其发色强度来进行定量(专利文献1)。以下、基于实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明不受下述实施例的限定。实施例比较例1、实施例1作为内源性游离甘油消除中性脂肪测定用试剂，配制具有下列组成的第1试剂和第2试剂。(比较例1)第1试剂PIPES缓冲液、pH6.550mmol/L甘油激酶1000U/L甘油-3-磷酸氧化酶5000U/L过氧化氢酶(来源于牛肝脏)300000U/LN-(2-羟基磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺0.3mmol/L腺苷5'-三磷酸1.6mmol/L氯化镁7.5mmol/L聚乙二醇单对异辛基苯基醚0.3%第2试剂PIPES缓冲液、pH6.550mmol/L脂蛋白脂肪酶3000U/L过氧化物酶3000U/L4-氨基安替比林4.2mmol/L叠氮化钠0.1%氯化镁7.5mmol/L聚乙二醇单对异辛基苯基醚0.3%另一方面，将上述比较例1中第1试剂的过氧化氢酶改为来源于黑色曲霉(黑色曲霉CatR，RocheDiagnosticsGmbH社制)，配制第1试剂(实施例1)。在4iiL添加了00.1%叠氮化钠的样品(人血清)中，混合300uL预先在37°C下加热的第1试剂，在37°C下反应5分钟后，再加入100yL第2试剂反应5分钟，测定600nm处的吸光度。由测得的吸光度算出中性脂肪量，求出样品中的中性脂肪量。比较例1和实施例1的结果如表1所示。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比较例1中，由于样品中叠氮化钠的添加量增加，因此妨碍了内源性游离甘油的消除，测定值上升。另一方面，实施例1中，即使叠氮化钠的添加量增加，测定值也几乎不上升，表明几乎不妨碍消除体系。因此，根据本发明，即使混入叠氮化物，也不会妨碍基于过氧化氢酶的消除体系，可以进行准确的测定。权利要求由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的减小方法，其特征在于用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢，然后，通过将来源于测定对象成分的过氧化氢定量从而对所述测定对象成分进行定量，此时使用来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶作为所述过氧化氢酶。2.权利要求1所述的方法，其中所述过氧化氢酶为具有血红素d的过氧化氢酶。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物为选自柄孢壳菌(Podospora)属、脉孢菌(Neurospora)属、枝抱(Cladosporium)属、裸胞壳(Emericella)属、侧耳(Pleurotus)属、异常球菌(Deinococcus)属、±矣希氏菌(Escherichia)属、沙门氏菌(Salmonella)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属、葡萄孢盘菌(Botryotinia)属、麦角菌(Clavic印s)属、曲霉(Aspergillus)属、组织胞浆菌(Ajellomyces)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、中华根瘤菌(Sinorhizobium)属、中间根瘤菌(Mesorhizobium)属、小孢子虫(Nosema)属和黄单胞菌(Xanthomonas)属的微生物中的至少一种微生物。4.权利要求3所述的方法，其中所述微生物为曲霉属菌。5.权利要求1至4中任一项所述的测定方法，其中所述测定对象成分为中性脂肪、HDL胆甾醇、LDL胆留醇或者肌酸酐。全文摘要本发明公开了减小由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的方法，其是测定对象成分的定量方法，包含用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢。由过氧化氢酶受叠氮化物的抑制引起的测定误差的减小方法，是用过氧化氢酶分解来源于测定对象成分以外的成分的过氧化氢，然后，通过将来源于测定对象成分的过氧化氢定量从而对上述测定对象成分进行定量，此时使用来源于具有75kDa以上亚基的微生物的过氧化氢酶作为过氧化氢酶。文档编号C12Q1/60GK101809163SQ20088010688公开日2010年8月18日申请日期2008年9月11日优先权日2007年9月12日发明者平尾裕子申请人:电化生研株式会社