虫草属真菌的栽培方法

专利名称：虫草属真菌的栽培方法
技术领域：
本发明涉及真菌的人工栽培，具体涉及虫草属真菌的人工栽培技术。
背景技术：
虫草属真菌是一类寄生于昆虫体的特殊微生物，属子囊菌亚门(Ascomycotina)，核菌 纲(Pyrenonycetes)，麦角菌目(Clavicipitales),麦角菌科(Clavicipitaceae)。包括冬虫夏 草(Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.)，蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)，蛑花(Cordyceps sobolifera(Hill)Berk.)， 古尼虫草(Cordyceps gunnii(Berk.) Berk.)等多种食药用真菌， 具有较高的经济价值和药用功能。对于冬虫夏草和蛹虫草，至今已积累了较多的药学、药 理和临床研究的文献资料，证明了虫草在抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫系统疾病等领域的特 殊功效。由于虫草属真菌野生资源稀缺，国内外研究人工栽培虫草也成了一个热点，并取 得了可喜的成绩。从冬虫夏草以蝙蝠蛾幼虫为寄主的全人工培养，冬虫夏草、蛹虫草、蝉
花无性型菌丝体的液体发酵与固体发酵，到蛹虫草、古尼虫草的大米固体培养基代料子实 体栽培，都已取得了成功。菌丝体发酵和代料栽培都有较多产业化的成功例子。以蝙蝠蛾 幼虫为寄主的冬虫夏草全人工栽培是一种非常接近冬虫夏草生态环境的栽培方法，不过由 于多方面的原因，该工艺的产品至今未能产业化。而发酵的产品和代料栽培的产品，和野 生虫草比较，在功效方面存在着较大的差距。这是因为真菌作为一种微生物，其生理代谢 活动与生长的环境、营养密切相关，发酵和代料培养过程的生长环境与野生环境下的真菌、 昆虫特殊结合体的生长环境差异很大，从而导致两者所积累和转化的次生代谢产物的种类 和数量存在较大的差异。
虫草属是一类子囊菌，其生活史中具备了无性世代的菌丝生长繁殖阶段和有性世代的 子实体阶段，虫草属的子实体又称为子座，即所谓的"草"。不同种的虫草，其子座单生或 者多生，冬虫夏草的子座一般只有一根。虫草属真菌的发酵培养属于无性型菌丝体阶段， 以蝙蝠蛾幼虫为寄主的全人工培养，蛹虫草的大米培养基代料栽培包括了无性型和有性型 二个阶段。在蛹虫草菌丝体无性繁殖阶段的末期，受外部环境，主要是温差和光照的诱导， 长出子座原基，由无性世代转入有性世代。很多虫草属真菌在人工培养条件下，很难长出 子座，所以虫草属的研究，大多集中在无性型。

发明内容
本发明的目的是提供一种虫草属真菌的栽培方法，旨在用简易的人工方法培养出更加 接近野生虫草功效的产品。
本发明的虫草属真菌的栽培方法为在封闭或半封闭的培养腔内填满培养基和虫草属
真菌菌种的混合料，其中，培养腔的容积为0.3ml-10ml之间。培养腔可以完整闭合，或者 有一到数个开口。将培养腔放置于适合虫草属真菌生长的培养条件下进行培养，待真菌长 满培养腔后，即可收获和腔体形态一致的虫草属真菌产品。
本发明的原理为通过对培养腔的设计，模拟了虫草属真菌无性生长阶段寄生在昆虫体 内时期缺氧和空间受限的生态特点，培养出的虫草属块状菌丝体(菌丝块)更加接近野生 状态下的真菌体。
上述培养腔的形状包括但不限于野生虫草属真菌寄主的形状，如蝙蝠蛾幼虫的形状、 蚕蛹的形状、家蚕的形状；规则的长方体、球体、圆柱体；不规则的空间。优选的为野生 虫草属真菌寄主的形状。
构成培养腔的材料包括但不仅限于透明或不透明的高分子材料，如聚乙烯、聚丙烯、 聚四氟乙烯等。为便于观察，可选择透明的材质。
上述封闭的培养腔是指四周完整封闭的培养腔。
上述半封闭的培养腔是指开有一个到三个用于真菌有性阶段生长子实体的开口的培养 腔。培养腔上的开口用于菌丝体生长完全后，在开口的位置，通过改变局部位置的环境刺 激(如光照)，诱导虫草属真菌从无性世代转入有性世代，诱导子座形成和定位生长。开口 的大小和数量依据不同野生虫草属真菌子座的粗细和数量情况，开口的总面积一般占培养 腔内腔总表面积的0.1%-2%。
上述封闭或半封闭培养腔的腔壁材质可以是不透气的实体，使培养腔和外界完全隔绝。 也可以在培养腔腔壁上设透气小孔与外界相通，小孔直径在50um以下。根据不同的加工工 艺，最小孔径可以为水的分子直径，即水分子可以透过小孔，而分子量大于18 (水分子量) 的分子，如氧气分子等，则无法通过。孔径越小，透气性越差，腔体保持水分的能力越强。 孔径增大，透气性增强，水、溶液和菌丝体容易渗透入小孔。封闭式或半封闭式培养腔的作用在于为真菌的培养提供一个无氧或者缺氧的环境，而 培养腔体积的限定，使得真菌的生长空间受到限制，营造代谢产物在微环境内富集的内环 境，进而影响真菌在此特定环境下所表达的各种次生代谢产物的种类和数量。这与虫草属 真菌在寄主体内的状况非常相似。研究表明，培养腔对生长空间的制约，将直接对最终产 物的品质产生影响。基于本发明的原理，培养腔的体积不宜过小或过大，优选的培养腔体 积为0.3ml-10ml。体积太小则产量太低。当培养的体积超过10ml，菌丝块不易形成较致密 的粘结结构的菌丝块。
所述培养基可根据不同虫草属真菌的营养要求，配制合适的培养基。如冬虫夏草适合 使用添加蚕蛹粉的培养基，蛹虫草使用PDA添加蛋白胨的培养基或大米固体培养基。根据 一定比例与菌种混合均匀， 一次性装填并充满整个培养腔，培养过程中，可以根据菌丝生 长状况，补加液体营养物质。 一般而言，接种量较液体发酵和固态发酵高，菌丝体的重量 占培养基和菌种混合料总重量的40%以上。由于各类虫草属真菌的营养需求不同，培养基 的配方有很多选择，也有大量已知的培养基配方资料。
接种用菌种的制备为常规的实验流程。
上述适合虫草属真菌生长的培养条件主要指温度、光照、水分控制在适合虫草属真菌 生长的条件，如冬虫夏草的培养温度一般在18'C以下。蛹虫草的培养温度一般低于28'C。 整个培养过程属于静态培养。
本发明的栽培方法制备的虫草与以昆虫幼虫为寄主的全人工栽培虫草的方法相比，具 有操作简便、接种量大、得率高、生产周期短、低成本、易于产业化放大的特点。幼虫为 寄主的人工栽培冬虫夏草，很大程度的模拟了野生冬虫夏草的自然生长过程，包括寄主昆 虫的釆集、繁殖和饲养，菌丝体的侵染，感染后的寄主饲养等，过程很长，操作繁琐。幼 虫的感染率，感染后的成活率低。虫体内接种量受限制，菌体在虫体内生长时间长。整个 培养过程中，繁殖饲养大量昆虫幼体，需要大量的硬件设备投入，投资成本高。也是以上 种种原因，该项技术虽然已有很多报导，却一直没有实现产业化。
本发明的栽培方法制备的虫草与人工液体发酵培养虫草相比，更加接近野生的天然虫 草，保持了完整的营养和药效的组分。中药学中，有一个重要的概念是关于道地药材。相 同的品种，在不同地域栽培，功效差别很大。从现代科学的观点来解释，是基因遗传和栽 培环境相互影响作用的结果。本发明的栽培方法，模拟虫草生长过程中无氧或者缺氧，生 长空间受到限制，内部代谢产物累积的生长内环境，初步的实验证明，本方法栽培的冬虫夏草，比人工液体发酵培养的冬虫夏草菌丝体在化学组成上更加接种野生冬虫夏草。本发 明栽培出的虫草，所有的代谢产物都保留在培养腔内，而在液体发酵过程中，很多水溶性 的营养组分都随着发酵液一起排弃，或者需要增加较多的工序，对发酵液中可能的有效成 分进行回收处理。


图l:实施例l的培养腔结构图 图2:实施例2的培养腔结构图 1、 开口
具体实施例方式
在下面的实施例中进一步说明本发明，这并不限制本发明的范围。 实施例1
1. 制备出内部为冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫形状的培养腔，如图1所示。由上、下二部 分组成，为透明的无孔隙的聚乙烯材料制作的模具。上、下二部分各有蝙蝠蛾幼虫 上、下二部分形状的凹槽，封闭合拢后围出蝙蝠蛾幼虫的形状。培养腔长30mm，直 径约4mm，总体积约0.4ml。该培养腔为真菌的培养提供一个无氧，生长空间受到限 制，代谢产物在微环境内富集的内环境。
2. 取冬虫夏草菌丝液体发酵液(参考"冬虫夏草深层培养及其多糖的研究与应用"2005 年西北大学硕士学位论文的方法制备)，在无菌操作的条件下过滤获得菌丝体备用。
3. 配置含水量50%的冬虫夏草培养基(葡萄糖60克、甘油15克、酵母膏8克、蚕蛹 粉15克煮汁、麸皮20克煮汁、无糖脱脂奶粉10克、KH2P04 0.5克、MgSO40.5克、
水，含蚕蛹粉和麸皮煮汁中的水共ioo克)，12rc高压湿热灭菌30分钟。
4. 将培养基、菌丝体l: 1.2的比例混合均匀，并研磨粉碎。
5. 将培养基和菌丝体的混合料加在下培养腔模具的凹槽内，填满整个凹槽并堆积较多 的混合料。合上上培养腔模具，确保整个培养腔内充满混合料。
6. 将培养腔放置在密闭的小盒内，避光，18'C条件下培养，35天后，打开培养腔观察 菌丝体是否长满，如未长满，可以继续培养。等腔体内长满菌丝体后即可收获。长出的菌丝块具有与培养腔一致的形态，具有一定的硬度，粘结成一块整体。长出致 密的形态饱满的菌丝块的概率在75%以上。
通过本发明栽培的产品，与野生冬虫夏草和发酵菌丝体(用于制备混合料的同一批次
的菌丝体)，在化学成分比较上，做了初步的探索。应用高压毛细管区带电泳(HPCE)，在 以下试验条件下57cm未涂层内径lOOum毛细管，气动0.5psi上样6S，电压20KV， 50mM pH 8.5硼酸-氢氧化钠缓冲液，检测波长254nm的色谱条件下，测定以上三个样品经真空 干燥后的腺苷、鸟苷和次黄嘌呤核苷的含量。分别为
腺苷含量本发明方法栽培的产品0.51mg/g，野生冬虫夏草0.33 mg/g,发酵菌丝 体2.97 mg/g ;
鸟苷含量本发明方法栽培的产品3.01mg/g，野生冬虫夏草2.59 mg/g,发酵菌丝 体2.84 mg/g ;
次黄嘌呤核苷含量本发明方法栽培的产品0.59mg/g，野生冬虫夏草0.66 mg/g, 发酵菌丝体0.12mg/g。
冬虫夏草中的核苷类一直被认为是有效成分之一，而腺苷在上世纪卯年代初，即被确 认为冬虫夏草发酵菌丝体的一项质量控制指标。随着近期研究中发现野生冬虫夏草中腺苷 的含量远低于液体发酵菌丝体中的含量，腺苷含量的质控意义开始受到怀疑。通过以上试 验反映的差别，证实了在冬虫夏草的核苷类的多种成分上，本发明栽培的产品与野生冬虫 夏草更加接近。野生冬虫夏草和人工发酵菌丝体的功效存在一定的差距，价格也是人工发 酵菌丝体的十倍以上。本发明方法栽培的产品在成分上与野生冬虫夏草的接近，很大程度 上可以预见其功效超过人工发酵菌丝体。
实施例2
1.制备出内部为长方体形状的培养腔，如图2所示。由上、下二部分组成，为透气的 聚四氟乙烯材料的模具。该模具可由聚四氟乙烯粉料，经高温、高压烧结而成。模 具内部分布20um左右的疏水性小孔，气体可以内外扩散，液体和固体则被截留在培 养腔内部。模具的上、下二部分各有长方体上、下二部分形状的凹槽，封闭合拢后 围出长方体的形状，在上、下部分的交界处有一个与外界相连通的圆形开口，直径为3mm。培养腔长40mm，高和宽8mm，总体积约2.5ml。该培养腔为真菌的培养 提供一个缺氧或者少氧，生长空间受到限制，代谢产物在微环境内富集的内环境。
2. 取蛹虫草菌丝液体发酵液(参考"蛹虫草的人工培养及其核苷类化合物的研究"2002 年沈阳药科大学硕士学位论文的方法制备)，在无菌操作的条件下过滤获取菌丝体备用。
3. 配置含水量50%的蛹虫草培养基(大米粉92克，葡萄糖3克，蚕蛹粉15克煮汁， KH2PO4 0.5克，MgSO40.5克，水，含蚕蛹粉煮汁中的水共100克)，12rC高压湿热 灭菌30分钟。
4. 将培养基、菌丝体l: l的比例混合均匀，并研磨粉碎。
5. 将培养基和菌丝体的混合料加在下培养腔模具的凹槽内，填满整个凹槽并堆积较多 的混合料。合上上培养腔模具，确保整个培养腔内充满混合料。
6. 将培养腔在避光，22士2'C条件下培养，20天后，打开培养腔观察菌丝体是否长满， 如未长满，可以继续培养。等腔体内长满菌丝体后，在培养腔的圆形开口位置进行 子座的诱导。
7. 将培养腔的温度控制在白天25'C-28r，晚上12。C-15。C，并在圆形开口处每天光照 12小时以上。连续10天进行以上的温差和光照刺激，在开口位置诱导出蛹虫草子座 原基。
8. 继续25t:温度条件下培养9天，子座长出2cm-3cm后即可收获。培养腔内长出的菌 丝块具有与培养腔一致的形态，并具有一定的硬度。此处不让子座生长成熟，继续 培养更长时间是为了保存菌丝块中的营养不被子座的生长消耗过多。整个过程，从 加混合料，即培养腔内接种开始计，长出子座的概率在90%以上。
通过本发明栽培的产品(子座诱导之前的菌丝块)，和发酵菌丝体(用于制备混合料的 同一批次的菌丝)在蛹虫草的主要生物活性物质上做了含量比较，包括虫草素和虫草多糖 二个组分。由于人工代料栽培的蛹虫草的食用部分，即子座，对于不同的菌种，生物活性 物质含量差别很大，因此此处仅就来源于相同菌株的子座诱导前的菌丝块产品与发酵菌丝 体进行比较。测定含量分别为
虫草素(HPLC方法测定)本发明栽培的产品L32mg/g，发酵菌丝体0.46mg/g;
虫草多糖(紫外吸收法测定)本发明栽培的产品:8.5%，发酵菌丝体6.1%; 本发明栽培的产品，和同一工艺流程中，相同菌种的液体发酵的菌丝体比较，其重要
8的生物活性物质的含量高出很多。因为菌丝在液体培养过程中，分泌大量的虫草素、虫草 多糖到培养液，并随着培养液的滤出而丢失。本发明栽培的产品，则很好的保持了各种营 养组分，具有更好的功效。
实施例3-5
整个过程与实施例2大致相同。不同处在于，实施例3的培养腔为30mm* 15mm* 15mm， 容积约7ml，实施例4的培养腔为40mm* 16mm* 16mm，容积约10ml，实施例5的培养腔 为46mm* 18mm* 18mm，容积约15ml。经20天培养后，培养腔内长满菌丝体。取出菌丝块， 扳断后发现实施例3只有15%左右的菌丝块内部不够致密，菌丝未很好的粘结成一块整体。 实施例4的样品中，有33%左右的菌丝块内部不够致密，菌丝未很好的粘结成一块整体。 而实施例5有近一半的菌丝块致密度不够。说明，如果培养腔体积过大，菌丝就不容易生 长成致密的菌丝块。
权利要求
1. 一种虫草属真菌的栽培方法，为在封闭或半封闭的培养腔内填满培养基和虫草属真菌菌种的混合料，其中，培养腔的容积为0.3ml-10ml，将培养腔放置于适合虫草属真菌生长的培养条件下进行培养，待真菌长满培养腔后，即可收获和腔体形态一致的虫草属真菌产品。
2. 如权利要求1所述虫草属真菌的栽培方法，其特征在于，所述培养腔的形状为野生虫草 属真菌寄主的形状、规则的长方体、球体、圆柱体或不规则的空间。
3. 如权利要求2所述虫草属真菌的栽培方法，其特征在于，所述野生虫草属真菌寄主的形 状为蝙蝠蛾幼虫的形状、蚕蛹的形状或家蚕的形状。
4. 如权利要求1所述虫草属真菌的栽培方法，其特征在于，所述培养腔的材料为透明或不 透明的材料。
5. 如权利要求1所述虫草属真菌的栽培方法，其特征在于，所述封闭的培养腔是指培养腔 四周完整封闭；所述半封闭的培养腔是指开有一个到三个用于真菌有性阶段生长子实体 的开口的培养腔，其中，开口的总面积占培养腔内表面积的O. 1%-2%。
6. 如权利要求5所述虫草属真菌的栽培方法，其特征在于，所述培养腔的腔壁不透气，或 者培养腔壁上设有透气小孔，透气小孔直径在50um以下。
全文摘要
本发明涉及真菌的人工栽培技术，公开了一种虫草属真菌的栽培方法，为在封闭或半封闭的培养腔内填满培养基和虫草属真菌菌种的混合料，其中，培养腔的容积为0.3ml-10ml，将培养腔放置于适合虫草属真菌生长的培养条件下进行培养，待真菌长满培养腔后，即可收获和腔体形态一致的虫草属真菌产品。本发明的栽培方法简单易行，培养出的虫草更加接近野生虫草，具有更高的药用功效。
文档编号C12N1/14GK101481659SQ20091000712
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月3日 优先权日2009年1月20日
发明者郑勇军 申请人:郑勇军