专利名称：一种提纯柑橘果肉有色体的方法
技术领域：
本发明属于植物生物化学技术领域，具体涉及一种应用密度梯度离心技术提纯柑 橘果肉有色体的方法。
背景技术：
质体是仅存在于植物和藻类细胞中的主要细胞器。质体参与光合作用，贮藏各种 各样的产物，以及合成植物细胞基本构架及功能所需的关键分子。和线粒体一样，质体由一 对同心膜组成的被膜包被。质体在半自主性上也与线粒体类似，具有合成一些自身蛋白所 需的遗传机制。质体具有显著的分化、去分化及再分化的能力。质体包括前质体，叶绿体， 白色体，有色体，造粉体。质体是植物特有的细胞器，在生物合成及代谢功能中起着重要作 用，其中包括光合作用的C固定、氨基酸、脂酸、淀粉以及次生代谢物的合成。有色体是一种 特殊的质体，因为它是来自于果实成熟或花粉发育中的叶绿体。有色体的主要功能是类胡 萝卜素合成和贮藏，使果实和花粉呈现各种色彩。叶绿体向有色体的转变总是伴随着叶绿 体的类囊体膜的降解。有色体类胡萝卜素的生化特性在不同植物中有相当大的区别虽然质 体有着重要生物学意义，但我们对质体的了解却是相当有限。因此，为了更好的研究柑橘有 色体，第一要务是分离提纯有色体。梯度离心是质体提纯主要，有效，且节省的方法。一个理想的梯液要具备化学稳 定性好；高溶合度；低渗透性；在溶剂中稳定性；较低的光吸收特性；价廉等。如蔗糖是比 较合适的梯度材料。尽管它在高密度(>30% W/N)时粘性每数较大，但综合比较表明它可 以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时(即使是低密度时也如此)也有较高的渗透性，分 离一些对渗透性敏感的生物体组分时需要选择其他梯度材料，如由Pharmacia公司开发的 Ficoll等等。对细胞，亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。常 用于等密度离心梯度材料见表1所示表1常用于等密度离心梯度材料汇总
权利要求
一种提纯柑橘果肉有色体的方法，其特征在于，用海碘醇配成的溶液为梯度液，进行三次密度梯度离心，得到提纯的有色体；其步骤包括(1)取甜橙果实，剥皮并去掉种子，将果肉切成块状，称重80克样品，加入300ml缓冲液A，用榨汁机榨汁8 10秒，将得到的果肉混合样品通过两层米拉滤布过滤，得到滤液；将滤液倒入离心管中，用离心机以400g离心5min，去沉渣后，得到上清液；将上清液用离心机的水平转头以6000g，离心10min，得到沉淀；将富集的沉淀加入12ml缓冲液A稀释，得到待用的样品Ⅰ，待用；(2)取10ml的离心管，用灭菌过的牛血清将内壁涂匀；用缓冲液A将重量体积比为30％的缓冲液B分别稀释成重量/体积为24％，20％，15％的梯度稀释液，体积分别为1.5ml、2.0ml、2.2ml、2.0ml配制成不连续密度梯度，取步骤(1)待用的样品2ml加到密度梯度上面；用离心机在水平转头下以6750g，离心45min；吸取第一层即重量体积比为15％的有色体层，并将沉淀稀释10倍，用离心机角转头以6000g离心7min得到沉淀，并将沉淀用2ml缓冲液A稀释，得到待用样品Ⅱ，待用；(3)取10ml的离心管，用灭菌过的牛血清将内壁涂匀；用缓冲液A将重量体积比为30％的缓冲液B分别稀释成重量/体积为12.5％，10％，7.5％，5％的梯度稀释液，体积分别为1.3ml，1.7ml，2.5ml，2.0ml配制成不连续密度梯度；取第(2)步待用的样品Ⅱ2ml轻轻加到梯度上面，用离心机水平转头，以离心速度为6750g，离心45min，富集第二层即重量体积比为7.5％的有色体层，将富集的有色体层稀释10倍，用离心机以离心速度6000g离心7min，去上清取并将沉淀稀释5倍，以600g，离心15min，得到待用的样品Ⅲ，待用；(4)将第(3)步富集得到待用的样品Ⅲ为样品，重复第(3)步骤；将富集得到的重量体积比为7.5％的有色体沉淀，稀释10倍，离心6000g，7min以去掉多余的海碘醇，沉淀稀释10倍，再以离心速度为2000g，离心10min，得到最终的有色体；其中缓冲液A、B的配方组成如下缓冲液A1mM 焦磷酸四钠；50mM 羟乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM山梨醇；2mM 乙二胺四乙酸；1mM MgCl2；2mM MnCl2；2mM 二巯基苏糖醇；缓冲液B按照重量/体积计的配方如下30％(W/V) 碘海醇；1mM 焦磷酸四钠；50mM 羟乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM 山梨醇；2mM 乙二胺四乙酸；1mM MgCl2；2mM 二巯基苏糖醇。
全文摘要
本发明属于植物生化领域。具体涉及应用密度梯度离心提纯柑橘果肉有色体的方法。步骤是1)将甜橙果实加缓冲液A榨汁，过滤；滤液离心，取上清，离心，得沉淀；用缓冲液A稀释，得样品；2)取离心管，用灭菌牛血清涂匀内壁；用缓冲液A将30％的缓冲液B稀释为梯度液，取样品Ⅰ加到密度梯度上面，离心；富集重量体积比为15％有色体层，将沉淀稀释，离心得沉淀，沉淀用缓冲液A稀释，得样品Ⅱ；3)取离心管，用灭菌牛血清涂匀内壁；用缓冲液A将30％的缓冲液B稀释成梯度稀释液；取样品Ⅱ加到梯度上面，离心，富集7.5％的有色体层，稀释，离心，去上清并将沉淀稀释，离心，得样品Ⅲ；4)取样品Ⅲ，重复3)；将7.5％有色体沉淀，稀释，离心，得柑橘果肉有色体。
文档编号C12N5/04GK101948796SQ20101026037
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者徐强, 曾云流, 潘志勇, 邓秀新 申请人:华中农业大学