专利名称：一种分离植物或微生物总rna的试剂组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，涉及一种细胞总RNA的制备方法，具体涉及一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的试剂组合物及其制备方法。
背景技术：
RNA是参与细胞基因表达的主要成分，在整个遗传信息的维持和表达过程中扮演着十分重要的角色。在现代分子生物学研究中，RNA分离已成为许多试验不可或缺的技术手段。分离得到的RNA质量的高低也将直接影响后续试验的进行。而RNA由于其自身的生物学特性，存在易降解、难保存的特点。提取过程中也容易被蛋白质、DNA和其他细胞代谢物污染。因此一种能够分离得到完整高纯度RNA的方法一直是分子生物学工作者所希望实现的目标，其对分子生物学研究亦具有重要意义。有关RNA的提取方法很多，依据RNA分离原理大致可以分为密度梯度离心，化学沉降和介质吸附三大类。密度梯度离心法对离心设备要求高，操作繁琐且处理的样品非常有限，已经基本不再使用；化学沉降类方法中主要包括CTAB法、SDS-酚法、异硫氰酸胍-酸酚-氯仿法。其中CTAB法和SDS-酚法在对植物、真菌等样品的RNA提取中使用较多，其提取原理主要是利用CTAB、SDS等阴/阳离子去污剂裂解细胞膜，释放核酸，同时抑制RNA酶的活性。TriS-HCl、EDTA缓冲体系维持溶液pH值，稳定核酸。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)则能有效与多酚类物质结合，防止其氧化产物——醌类物质对核酸的破坏。随后经乙醇和LiCl两轮沉降得到RNA。由于LiCl对RNA的沉降具有一定特异性，绝大部分多糖、次生代谢物等杂质便在沉降过程中被除去，从而得到较纯的RNA。该方法在处理富含多糖多酚类复杂样品时仍然可以得到令人满意的结果，然而对于大量样品的处理，此类方法仍嫌繁琐， 操作时间也较长。并且CTAB法和SDS-酚法均无法用于动物组织总RNA的提取。异硫氰酸胍的应用使这一状况得到改观，由于异硫氰酸胍具有极强的蛋白质变性能力，能够在裂解细胞的同时使RNA酶迅速失活，从而克服了以上方法裂解能力不足的问题，极大地保证了核酸的完整性。异硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法就是在此基础上发展起来的一种快速分离 RNA的方法，首先由Chomczynski及其同事于1987报道，并历经数次改进。该方法适用大多数动植物样品，得到的RNA完整性好，并可在短时间内完成操作，几乎成为常规RNA提取的标准方法，使用也最为广泛。商业化的TRIzoI试剂及其分离方法就建立在此基础之上， 它比常规的异硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法更为快捷和高效，然而其价格也较为昂贵，不利于常规大量样品的处理。介质吸附类方法是近年来迅速崛起的RNA分离方法，其主要原理是利用核酸在高盐低PH溶液环境下与硅胶膜表面-OH基团形成盐桥从而使核酸结合于硅胶膜表面。经一系列洗涤过程除去蛋白质和溶液中的盐，最后在低盐高PH条件下将核酸从硅胶膜上洗脱，从而分离得到RNA。这种方法可在极短时间内完成RNA的分离，并且得到的 RNA纯度高、质量好，因而得到越来越广泛的应用。然而此种方法难以避免DNA的污染。由于是利用硅胶膜吸附溶液中的RNA，硅胶膜的吸附能力和吸附面积成为影响RNA得率的重要因素，不可避免的损失使得这种方法的得率并不优于化学沉淀类方法。而且这种损失对于分子量小的RNA来说尤为严重。限制了其在一些生物学实验中的应用，如小分子RNA干扰等。到目前为止，针对特殊样品的RNA提取方法的研究从未终止，一种简便、高效、廉价而又能够适应广泛样品的RNA提取技术一直是研究者们所追求的目标。
发明内容
本发明的目的在于克服传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点，提供一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的试剂组合物及其制备方法。本发明的核心是建立一种快速、高效而又廉价的RNA提取方法。该方法适合分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的方法，由于该方法向RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，故与同类型试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能够有效分离得到。同时使核酸沉降过程在短时间内即可完成，免除了 -20°C沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法适用样品广泛，且比商业化TRIzol试剂更为廉价。样品勻浆后若不立即进行RNA提取可放于-20°C保存至少3天。申请人:经过大量研究和对比试验，优选出满足本发明目的的RNA提取试剂组合物及方法。本发明的RNA纯化试剂组合物包括以下组分
1)溶液A
a.按重量/体积计异硫氰酸胍50% ；
b.醋酸钠0. lmol/L
C.氯化钠 0. 25mol/L ；
d.氯化镁IOmmol/L ；
e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0. 7% ；
f.糖原 60 μ g/ml
g·按体积/体积计β -巯基乙醇0. 5%
2)溶液B 水饱和酚(ρΗ4· 0-5. 0)；
3)裂解液
a.按体积/体积计，溶液A 50% -55% ；
b.按体积/体积计，溶液B 50% -45% ；
C.按重量/体积比计甲基红0. 2%ο ；
将溶液A和溶液B按照体积比1 1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰
红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。2、申请人建立了一种从柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌中提取总RNA方法，其步骤包括按照前述的配方量制备RNA纯化试剂组合物(配方见上所述)，备用。(1)样品裂解根据样品称重，按照每0. Ig样品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于离心管中，将样品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的离心管中剧烈震荡，样品勻浆后在室温下放置5min，然后置于冰上直至所有样品勻浆完成。不立即进行RNA提取的样品可将勻浆置于-20°C保存；(2)抽提
按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻浆中加入氯仿，剧烈震荡使溶液呈乳浊状，冰上静置5min后于4°C下离心，离心后吸取上层水相于新离心管中并加入等体积氯仿再次抽提，离心，除去水相中残余的酚；(3)沉降 RNA吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇，冰上至室温25°C放置IOmin后， 离心回收RNA ；(4)洗涤溶解RNA在室温条件下，用浓度为75%的乙醇使RNA沉淀悬浮，洗涤1_2次后，将其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的去离子水中。本发明的特点在于以异硫氰酸胍、苯酚为主要成分，以NaCl、MgC12等提供阳离子，以醋酸钠-醋酸缓冲系统稳定溶液PH值，经氯仿简单抽提后，即可得到高质量的RNA。 由于本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，故与同类型试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能够有效分离得到。同时使核酸沉降过程在短时间内即可完成，免除了 -20°C沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法快捷、高效，适用样品广泛，且比商业化TRIzol试剂更为廉价。克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。且操作更为灵活，样品勻浆后可于_20°C保存3天再进行RNA的提取。本发明的效果是1、能够在短时间内从样品中分离得到高纯度的RNA。2、操作步骤简单，易于大量样品的处理。3、适用样品广泛，对大部分植物、微生物及部分动物样品均有较好的提取效果。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO :1是来源于毛果杨(Populus trichocarpa)的Actin 9基因的 mRNA片段，序列全长为17^bp。序列表SEQ IDNO 2和SEQ IDNO 3是扩增Actin 9基因的引物对。序列表SEQ ID NO :4是来源于毛果杨(Populus trichocarpa)的Actin 1基因的 mRNA片段，序列全长为1819bp。序列表SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是扩增Actin 1基因的引物对。图1为墨西哥株檬(Citrus aurantifolia)叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，图中1为分子量标准(TIANGEN, MD103-02)，2-5为实验重复。图2为本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果 (1ΧΤΑΕ，1·2% )，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2-3为实验重复。图3为梨腐烂病菌(Valsa ambiens (Pers)Fr)菌丝总RNA非变性琼脂糖电泳效果(ΙΧΤΑΕ,Ι. 2% )，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2-5为实验重复。图4为不同方法提取得到的墨西哥株檬叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，图中 1 为分子量标准(TIANGEN, MD103-02) ,2 为=CTAB-LiCl 法得到的总RNA，3为本方法得到的总RNA，4为使用RNAisoReagent试剂(TaKaRa，D312)得到的总RNA，5为SDS-酚法得到的总RNA，6为使用Trizol试剂得到的总RNA，7为异硫氰酸胍-酸酚法得到的总RNA图5为=RT-PCR扩增墨西哥株檬Actin基因片段琼脂糖电泳效果(1XTAE，2% )， 图中1为分子量标准(TIANGEN，MD109-02)，2-5为引物β-Actin(T52)扩增产物，6_9为 引物β -Actin(Τ60)扩增产物图6为试剂性状，左为Iml溶液于1. 5ml离心管中效果，右为加入氯仿分层后的效果。
具体实施例方式实施例1本发明的应用实施例应用RT-PCR扩增墨西哥株檬(Citrus aurantifolia) Actin S13Jn S本实施例中墨西哥株檬叶片采集于华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心，墨西哥株檬植株为温室盆栽植株。该品种为商业化品种和生产上广泛应用的品种 (材料)，公众如果需要，华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心可以对外发放该品种的材料。一、RNA提取使用的试剂组合物的配制1)糖原溶液(10mg/ml)用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的去离子水将糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。 依次先后用DNA酶(购自宝大连生物工程有限公司，即TaKaRa公司)、RNA酶(购自宝生物工程大连有限公司)及蛋白酶K(购自宝生物工程大连有限公司)进行消化处理，除去药品中的DNA、RNA及蛋白质污染。使用等体积水饱和酚抽提一次，用等体积氯仿异戊醇(体积比为M 1)抽提两次后，用DEPC处理过的去离子水将糖原溶液稀释至10mg/ml，分装于小份，-20°C保存。2)溶液 A a.按重量/体积计异硫氰酸胍50 % ；b.醋酸钠 0. lmol/L ；c.氯化钠 0. 25mol/L ；d.氯化镁 IOmmol/L ；e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0. 7% ；f.糖原 60 μ g/mlg.按体积/体积计β -巯基乙醇0. 5 %将以上固体粉末准确称量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的终浓度达到60 μ g/ml。添加β-巯基乙醇后用冰醋酸调节溶液pH至4. 6左右。最后用DEPC处理过的去离子水定容。3)溶液B 水饱和酚(ρΗ5· 0)4)裂解液 a.按体积/体积计溶液A 50 % -55 %b.按体积/体积计溶液B 50% -45%c.按重量/体积计甲基红0. 2%o将溶液A和溶液B按照体积比1 1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。二、提取墨西哥株檬叶片总RNA1、准确称取0. Ig墨西哥株檬(该品种是一个公开使用的商业化品种)叶片样品， 液氮研磨后迅速加入含Iml裂解液的离心管中，剧烈震荡勻浆。2、室温下放置5分钟后，将离心管置冰上，直至所有样品勻浆完毕。3、在 4°C，12000g 下离心 5 分钟。4、将上清转移至新离心管，弃去管底残渣。5、向每个离心管中加入200 μ 1氯仿，剧烈震荡20秒使溶液呈乳状。6、冰上放置10分钟后于4°C，不低于12000g下离心15分钟。7、小心吸取上层无色水相至新离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次。8、4°C，不低于12000g下离心10分钟。9、小心吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇。冰上放置10分钟。10、在4°C，8000g下离心10分钟后回收RNA沉淀。11、倒掉上清，加入Iml 75%乙醇使沉淀悬浮，洗涤沉淀。12、在8000g室温离心5分钟回收沉淀。13、重复步骤 11-13。14、完全除去上清，室温静置15-20分钟使RNA沉淀干燥。15、将沉淀溶于DEPC处理过的去离子水中，于_80°C下保存本实施例经4次重复得到的总RNA得率平均为3090 μ g/g组织，4次重复分离得到的总RNA其A26(1/28(1值均在2. 06-2. 10之间，其A26(1/23(1比值均在2. 09-2. 19之间，电泳条带正常(见图1)。三、cDNA合成使用DNase I试剂(购自宝生物工程大连有限公司)对提取得到的总RNA进行消化，具体步骤参照该公司的产品说明书进行。利用Oligo dT引物进行cDNA的合成，具体步骤如下1、取2μ g消化后的总RNA，加入1μ 1 Oligo (dT) 12_18 (100 μ Μ)(上述材料或试剂均购自！^ermentas公司产品)引物后，加入DEPC水至总体积10 μ 1。2、70°C水浴IOmin后迅速在冰上急冷5min。3、瞬时离心后在离心管中加入反转录反应溶液5μ 1 5XM-MLV Reaction BufferU μ 1 M-MLV (200U/ μ 1)(购自 Promega 公司产品)、6μ 1 dNTP(10mM.)(购自 Roche 公司产品)、0. 5μ 1 RRI RNase inhibibtor (40U/μ 1)(宝生物工程大连公司产品)、2. 5 μ 1 DEPC-H2O。4、42°C水浴1小时后70°C处理IOmin使反转录酶失活。5、5倍稀释后分装成小分保存于-20°C四、PCR扩增Actin基因片段RT-PCR扩增内参基因Actin片段，根据NCBI数据库中已有的Actin 9基因序列 (基因登录号XM_002331844)设计如下的一对引物，其DNA序列如下β -Actin (Τ52)-F :5，-TCTATTCCAGCCATCTCTC-3，(序列表编号 SEQ ID NO 2)，β -Actin (Τ52)-R :5，-GACCCTCCAATCCAAAC-3，(序列表编号 SEQ ID NO 3)。
序列全长为1726bp，其物种为毛果杨(Populus trichocarpa)，杨属植物，其mRNA 片段如下所示(序列表编号SEQ ID NO 1)CTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCGCACCAGCAACCGCAATACAAACAAGCAATTTAGGCCAGGCCACGTCT ATAGCTAGATTTGGCTTGGTTCGTTCTCTGATTATTCTCTCTTATACTTTTTTTGCACAGAACTTGTAGAAAATGGCCGATTCTGAGGATA TTCAGCCCCTTGTCTGCGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCTGGGGATGATGCTCCCAGGGCAGTGTTTCCAAGTATTGT GGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCTTATGTTGGTGACGAAGCACAATCTAAGAGAGGTATCTTG ACCTTGAAATACCCTATTGAGCATGGTATTGTTAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACACTTTCTACAATGAGCTTCGTG TTGCTCCTGAGGAGCACCCAGTCCTCCTTACAGAGGCTCCTCTTAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACTCAAATCATGTTTGAGAC CTTCAATGTGCCTGCAATGTATGTTGCTATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGCTGGATTCTGGT GATGGTGTGTCTCACACTGTGCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTTCCACATGCCATCCTTCGTTTGGATCTTGCTGGTCGTGATCTCACTG ATGCTTTGATGAAGATCCTCACCGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTGC ATATGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGTAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTATGAGCTACCTGATGGTCAGGTC ATCACCATTGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCATCGGAATGGAAGCTGCTGGTATCCACGAGACTA CTTACAATTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATATCAGAAAGGATCTATATGGTAATATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATGTTCCCTGG TATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAAATCACTGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTTGCACCACCAGAGAGAAAATACAGT GTCTGGATTGGAGGGTCAATCCTTGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGTACGACGAGTCTGGCCCATCCA TCGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCCGAACAGTGCGGTGATGGTGAGTTCTTTCTTTCTATTTAGTTGGCTTTTTTCGTGTCAAGGTGT CATGAACTCAAAGTCCTAGTTGATATGGAGAATTTGTTGAGGTGGGGGTCATTGAAGGAGGGAACATTCTGATATTCAATGTATCGAATAG GCTTGTGATTCGATGTTGTTATTGCTGCTTTTTAAGATGCGCAACTGTAATGGTCCTCCCTCTCGATGTGGTGGTCAGACACTTTGGTAGT CAAGCTCTTTGCTTTCTTCCACATCATCTGTGGTTCAACCTTGCGTCTTTTTAGTAGGATGCTTGTAGACGGAGAGTGGTTGTGATGATGC
rp rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rp rp rp rp rpCCATCTCAACATTTGAAGGTGTTTTTTTCCTTGGGAACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTGTGTTAGTGTCAATTTG根据登录号XM_002^8674报道的Actin 1基因序列作为RT-PCR扩增内参基因 Actin片段，设计了如下另一对引物对，其DNA序列如下β -Actin (Τ60)-F :5，-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3，(序列表编号 SEQ ID NO 5)，β -Actin (Τ60)-R :5，-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3，(序列表编号 SEQ ID NO 6)。序列全长为1819bp，其物种为毛果杨(Populus trichocarpa)，杨属植物，其mRNA 片段如下所示(序列表编号SEQ ID NO 4)AACCCTTACACTCCTCCATTTTCGTCTCACCCTCTCTCTCGAGCGCAACCACCAGCTAGCAAGTCAGGC AGGCCACATCTTTCGCTAGACTTGGCTTGGTCTGTTTCGCTCTCTGTCTCTAGATATCTCCTCTGTCTCCGACTTCAAAAGAATTTGTAGA AAATGGCCGATGCCGAGGATATTCAACCCCTTGTCTGTGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCAGGTGATGATGCACCCAG GGCAGTGTTTCCCAGTATTGTGGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCCTATGTTGGTGATGAAGCA CAATCTAAAAGAGGTATCTTGACCTTGAAATACCCCATTGAGCACGGTATTGTAAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACA CTTTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCTCCTGAAGAGCACCCAGTCCTCCTGACTGAGGCTCCCCTCAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGAT GACTCAAATTATGTTTGAGACCTTCAATGTTCCTGCAATGTATGTTGCCATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACT GGTATTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGTGAGTCACACTGTGCCAATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCACACGCCATCCTTCGTTTGGATC TTGCTGGTCGTGACCTCACCGATGCTTTGATGAAGATTCTGACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCG TGATATGAAGGAGAAACTTGCGTATGTTGCCCTCGACTACGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTAC GAGCTTCCTGATGGTCAGGTCATCACCATCGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCTTCTCTCATTGGAATGGAAG CTGCTGGCATCCACGAGACTACATACAACTCAATCATGAAGTGTGATGTGGATATTAGAAAGGATCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGG TGGTTCCACTATGTTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCA CCACCAGAGAGAAAGTACAGTGTCTGGATTGGAGGATCTATCCTTGCTTCCCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGT ATGATGAGTCTGGCCCATCCATTGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCTACAAGTGCTTTGATGGTGAGTTCTTTTTCCTATTTAGTTGGC TTTTTTCGTGTCAAGGTGTCATGAACTCAAAGTCCTGGTTGATATGGAGAATTTATTGAGGTGGGGGTCACTGAAGGAGAAGGGAACATTC TGATCTTCTATGTATCGAATAG
GCCTGTGATTCAATGTTGATATCGCTGCCATTTGTGAAGCTTAAACTGTAATGGTCCTCCCTCCGGATG TGGTGGGCAGACAGACACTTTGGTAATCAAGTTCTTTGCTTCCCTCACATCATCACCAATGGTTCAACCTTGTGTCTTTTTTAGTAGGATG CTTGTAGTCGGAGAGTGATTGTGATGATGCTTTTCTATTTTTATTTTTTTTCCATCTCGACATTTGAAGGGTTTATTTTTTTTTCCTGGGA ACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTATGTTAGTGTCAATTTGCTTTCATAAACCCTATGGAAATCATATTTAATACTTTTG TTTGAACTTTGAATTGATCTTPCR反应体系如下
权利要求
1.一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌丝体总RNA纯化试剂组合物，其特征在于， 包括以下组分1)溶液Aa.按重量/体积计异硫氰酸胍50%；b.醋酸钠0. lmol/L ；c.氯化钠0. 25mol/L ；d.氯化镁IOmmol/L ；e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7% ；f.糖原60 μ g/ml ；g.按体积/体积计β-巯基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水饱和酚；3)裂解液a.按体积/体积计，溶液A50% -55% ；b.按体积/体积计，溶液B50% -45% ；c.按重量/体积比甲基红0.2%o ；将溶液A和溶液B按体积比1 1混合后，加入甲基红使溶液呈玫瑰红色，即为所述的裂解液。
2.一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌丝体总RNA的方法，其特征在于包含以下步骤(1)、制备RNA纯化试剂组合物1)溶液Aa.按重量/体积计异硫氰酸胍50%；b.醋酸钠0. lmol/L ；c.氯化钠0. 25mol/L ；d.氯化镁IOmmol/L ；e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7% ；f.糖原60 μ g/mlg.按体积/体积计β-巯基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水饱和酚；3)裂解液a.按体积/体积计，溶液A50% -55% ；b.按体积/体积计，溶液B50% -45% ；c.按重量/体积比甲基红0.2%o ；将溶液A和溶液B按体积比1 1混合后，加入甲基红使溶液呈玫瑰红色，即为所述的裂解液；(2)样品裂解根据样品称重，按照每0. Ig样品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于离心管中，将样品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的离心管中剧烈震荡，样品勻浆后在室温下放置5min， 然后置于冰上直至所有样品勻浆完成，不立即进行RNA提取的样品可将勻浆置于-20°C保存；⑶抽提按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻浆中加入氯仿，剧烈震荡使溶液呈乳浊状，冰上静置5min后于4°C下离心，离心后吸取上层水相于新离心管中并加入等体积氯仿再次抽提，离心，除去水相中残余的酚；(4)沉降RNA吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇，冰上至室温25°C放置IOmin后，离心回收RNA ；(5)洗涤溶解RNA在室温条件下，用浓度为75%的乙醇使RNA沉淀悬浮，洗涤1-2次后，将其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯处理的去离子水中。
全文摘要
本发明属于分子生物学方法领域，涉及一种分离植物或微生物总RNA的试剂组合物及制备方法。以异硫氰酸胍、苯酚为主要成分，以NaCl、MgCl2等提供阳离子，以醋酸钠-醋酸缓冲系统稳定溶液pH，经氯仿简单抽提后，即可得高质量的RNA。由于本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，与同类试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能有效分离。使核酸沉降过程短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法快捷、高效，适用样品广泛，比商业化TRIzol试剂更为廉价。克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。且操作更为灵活，样品匀浆后可于-20℃保存3天再进行RNA的提取。
文档编号C12N15/10GK102443580SQ201010509840
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者丁芳, 徐文兴, 杨帆, 洪霓, 王利平, 王国平 申请人:华中农业大学