专利名称：一种利用表面增强拉曼光谱鉴别饮用水致病菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种饮用水致病菌的检测方法，尤其涉及一种利用表面增强拉曼光谱 和聚类分析对饮用水致病菌进行鉴别的方法。
背景技术：
水源水、城市供水和饮用水等水质监测中，污染指示菌的检测结果通常是评价水 体质量的重要指标。大肠菌群普遍存于人和其它温血动物的肠道中，通过肠道排泄物进行 传播，可引起疾病，因此，国家标准中一般通过检测大肠菌群的数量来评估水质受到粪便污 染的状况。但是近年来，有关研究表明大肠菌群的数量与粪便污染的实际状况并没有很 好的相关性，在各种淡水和海洋水中，粪链球菌引起的疾病已超过了大肠菌群。为此，已 代替了 GB 8537-1995的GB8537-2008《饮用天然矿泉水》在微生物指标中增加了粪链球 |if (Enterococcus faecalis) > fIl§ j[xIfi lif Pseudomonas aeruginosa) > Zfe^IM lif (Clostridium perfringens)的检测，同时在GB/T 8538-2008《饮用天然矿泉水检验方法》 中均采用滤膜法测定以上三种致病菌。该检测过程包括培养试验和确证试验，结果可靠，但 是操作复杂，检测周期较长。现有的常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴 别实验，或者是通过聚合酶链式反应(PCR)实现的。虽然这些检测方法十分专业和经典，但 其步骤复杂、耗时较长，成本高，且其最主要的不足之处在于必须进行预增菌，而从取样到 确定是定性还是定量鉴别微生物，最低需要一天以上的时间，因此难以适应飞速发展的现 代食品生产和流通的需要。
发明内容
本发明的目的在于提出一种的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其灵 敏度高，易于操作，检测速度快，成本低廉，可实现大规模的在线检测，从而克服了现有技术 中的不足。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案一种饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法为采用金 或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对饮用水致病菌进行检测，经对检测结 果进行聚类分析，实现对饮用水致病菌的鉴别。进一步地讲，该方法具体为取饮用水致病菌中的至少一种制成活化菌株标准样品，并将活化菌株标准样品与 金或银纳米溶胶充分混合后以拉曼光谱进行检测，其后将检测结果进行聚类分析，并由此 鉴别饮用水致病菌的种属；所述饮用水致病菌包括粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌；所述金或银纳米溶胶的使用量与致病菌的用量在1毫摩尔100活菌数 1毫摩 尔30000活菌数之间。
该方法包括如下步骤(1)活化菌株标准样品的制备取饮用水致病菌中的至少一种的菌种在LB固体培养基上划线培养，30-37°C下培 养M-4 !，用无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，而后在5000-10000rmp 离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成活化菌株标准样品，所述饮用水致病菌包括 粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌；(2)拉曼光谱检测将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品以1毫摩尔100活菌数 1毫摩尔30000活菌数的用量比例混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检 测；⑶数据处理将标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此鉴别饮用水致病菌的种属。步骤O)中拉曼光谱仪的测定条件设为激光功率范围20-300mw，扫描时间 2-20so步骤O)中活化菌株标准样品与增强试剂混合、振荡的时间为2-60s。步骤(3)中是通过比对饮用水致病菌的拉曼光谱图中各峰峰值来鉴别饮用水致 病菌种属的。所述金纳米溶胶的制备方法为将0. 30-1. 50mg/mL氯金酸钾溶液置入温度为105_135°C的条件下煮沸，加入的柠 檬酸钠溶液浓度为0. Iwt % -IOwt %，煮沸5-95min，制得金纳米溶胶。更进一步地讲，该方法包括如下具体步骤(1)活化菌株标准样品的制备取粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌的菌种分别在LB固体培养基上划线 培养，30-37°C下培养M-4 !，用无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，而后 在5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成三种活化菌株标准样品；(2)拉曼光谱检测将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品混合、振荡，使两者充分结合， 而后以拉曼光谱进行检测；(3)数据处理将各标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此建立可用于鉴别和区分饮 用水致病菌的种属的聚类分析图；(4)参照步骤O)的操作，以拉曼光谱检测一种以上未知菌种样品，将所得拉曼光 谱检测结果与步骤( 所得上述标准样品的拉曼光谱检测结果和步骤C3)所得聚类分析图 进行比对，从而鉴定未知菌种的种属。
图1是三种饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱比较图；图2是未知的M株细菌样品拉曼光谱数据的聚类分析图；以上图中所示I为粪链球菌(Enterococcus faecal is)、II为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、III 为产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
具体实施例方式本案发明人经长期研究和实践发现，由于不同的细菌种类在它们的细胞生物化学 成分方面有所不同，每个分子都有一个特征光谱，可以通过拉曼光谱仪检测出分子的特征 电磁波。利用拉曼光谱能同时获得完整活细胞内4种主要生物大分子结构及其变化的直接 证据，包括核酸的磷酸骨架，脱氧核糖(或核糖)和碱基蛋白质的主、侧链；脂膜的脂肪酸 碳链氢链的反式和扭曲构象以及各种不同构象的碳水化合物等。因而，可以根据它们的拉 曼光谱就可以鉴别出细菌的种类。根据上述发现，本案发明人提出了基于表面增强拉曼光谱的饮用水致病菌鉴别方 法，其技术方案大致如下(1)微生物样品的制备活化饮用水致病菌菌株，培养后将菌体在蒸馏水中洗涤，制成活化饮用水致病菌 菌株标准样品，完毕后待进样。(2)增强试剂制备条件的优化本发明可选取金纳米溶胶、银纳米溶胶或其它类似试剂作为增强试剂。其中，金纳 米溶胶及银纳米溶胶可采用本领域技术人员习知的方法制备。例如，金纳米溶胶可采用柠 檬酸钠还原氯金酸或其盐类的方法制备，而银纳米溶胶可采用以NaBH4还原可溶性银盐的 方法制备。(3)拉曼光谱仪进样条件的设定(4)被测菌种拉曼光谱的收集将步骤(1)中制备的活化菌株标准样品与步骤( 中的增强试剂按合适比例(这 个比例以获得较好的拉曼光谱表面增强率为宜)混合，振荡结合一定时间(至样品中的细 菌与纳米粒子充分结合为宜)，置于拉曼光谱仪之中按照步骤(3)进行测定，扫描得到的光 谱图经处理后转换为可供数据处理的数据表待后续数据处理。(5)数据处理将拉曼光谱图的数据进行聚类分析，通过各饮用水致病菌标准样品的拉曼光谱图 各峰峰值鉴别不同种属的饮用水致病菌。前述的步骤可分别优选为微生物样品的制备菌种在LB固体培养基上划线培养，30-37°C下培养对-4他，用 无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，5000-10000rmp离心5-30min，重复 三次操作，而后以水洗涤，完毕。增强试剂制备条件的优化采用纳米金作为增强试剂，油浴升温至105_135°C左 右加入0. 30-1. 50mg/mL氯金酸钾溶液待沸腾，加入的柠檬酸钠溶液浓度为0. -10% (质量百分比)，煮沸反应时间为5-95min。进样条件拉曼光谱仪测定条件设定为激光功率范围20-300mw，扫描时间 2-20秒。各细菌样品与金溶胶混合体积比为1 1-1 5，二者混合时间保持一致，为 2-60so数据处理方法采用SPSS (SPSS公司)、SAS软件(SAS Institute Inc.)或其他类似软件对拉曼光谱图数据通过聚类分析，从而进行饮用水致病菌的鉴别。下面结合附图及 若干较佳实施例对本发明的技术方案做详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。实施例1 利用表面增强拉曼光谱鉴别三种饮用水致病菌粪链球菌 (Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens),其过禾呈为取上述三种致病菌的冻存菌种接种至TSB离心管中活化，在30_37°C活化至少 Mh，待TSB浑浊，接种至LB固体培养基中划线培养，在37°C培养24h 48h，用无菌接种环 挑取分散的单一菌落，置于离心管的蒸馏水中振荡，于冷冻离心机8500rmp离心5min，重复 3次以上，取沉淀以水洗涤完毕待进样。取按照前述优化条件制备的金纳米溶胶500 μ L与 300 μ L前述菌体标准样品分别于进样瓶中混合10s，拉曼测定250mw，IOs得到光谱图，按照 上述操作每株细菌样品，收集图谱，进行数据处理得到图1，该图中，500CHT1左右的峰是蛋 白质肽类的S-S键伸缩振动1330(3!^1左右的峰应是腺嘌呤的特征峰——类似于DNA的谱 图；1125cm—1特征峰的出现表明纳米颗粒可能进入细菌细胞壁后造成DNA的变性；其余大部 分的峰可能是细胞壁中蛋白质、肽类和氨基酸；最强的730cm—1左右的峰归属于肽聚糖结构 中NAG成分，也有可能是FAD的倍频峰；粪链球菌和产气荚膜梭菌是革兰氏阳性菌，其细胞 壁结构相似，比铜绿假单胞菌细胞壁更厚更粗糙，由1330cm—1峰的强度相吻合；铜绿假单胞 菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁比阳性菌更薄，其脂质双分子层的振动峰强度较小。实施例2 利用表面增强拉曼光谱鉴别未知的饮用水致病菌样品本实施例按照上述方法取未知的M株饮用水致病菌样品分别进样，收集所得拉 曼光谱图谱，将光谱数据进行SPSS软件处理得到聚类分析结果，再将光谱数据及聚类分析 结果与前述标准样品的光谱图及聚类分析结果比对，并由此确定了其中标号为1、10、21、M 的样品，2、3、4、6、7、13、14、15、16、17、21、22 的样品，5、8、11、12、18、19、20、23 的样品分别 为粪链球菌、产气荚膜梭菌和铜绿假单胞菌，从而实现了未知饮用水致病菌样品种属的鉴 定。当然，本实施例的过程仅用以说明本发明的技术方案，本领域技术人员根据本发 明的启示，亦可很容易想到对除上述三种饮用水致病菌之外的其他多种细菌以类似的方法 进行区分和鉴定。但是，凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或 等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于，该方法为采用金 或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对饮用水致病菌进行检测，经对检测结 果进行聚类分析，实现对饮用水致病菌的鉴别。
2.根据权利要求1所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于， 该方法具体为取饮用水致病菌中的至少一种制成活化菌株标准样品，并将活化菌株标准样品与金或 银纳米溶胶充分混合后以拉曼光谱进行检测，其后将检测结果进行聚类分析，并由此鉴别 饮用水致病菌的种属；所述饮用水致病菌包括GB 8537-2008《饮用天然矿泉水》中规定的三种致病菌粪链 球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)；所述金或银纳米溶胶的使用量与致病菌的用量在1毫摩尔100活菌数 1毫摩 尔30000活菌数之间。
3.根据权利要求1或2所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在 于，该方法包括如下步骤(1)活化菌株标准样品的制备取饮用水致病菌中的至少一种的菌种在LB固体培养基上划线培养，30-37°C下培养 M-4 !，用无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，而后在5000-10000rmp离 心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成活化菌株标准样品，所述饮用水致病菌包括粪 链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌；(2)拉曼光谱检测将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品以1毫摩尔100活菌数 1毫摩 尔30000活菌数的用量比例混合、振荡，使两者充分结合，而后以拉曼光谱进行检测；(3)数据处理将标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此鉴别饮用水致病菌的种属。
4.根据权利要求3所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于， 步骤O)中拉曼光谱仪的测定条件设为激光功率范围20-300mw，扫描时间2-20s。
5.根据权利要求3所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于， 步骤O)中活化菌株标准样品与增强试剂混合、振荡的时间为2-60s。
6.根据权利要求3所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于， 步骤(3)中是通过比对饮用水致病菌的拉曼光谱图中各峰峰值来鉴别饮用水致病菌 种属 的。
7.根据权利要求1或2所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在 于，所述金纳米溶胶的制备方法为将0. 30-1. 50mg/mL氯金酸钾溶液置入温度为105_135°C的条件下煮沸，加入的柠檬酸 钠溶液浓度为0. Iwt % -IOwt %，煮沸5-95min，制得金纳米溶胶。
8.根据权利要求3所述的饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法，其特征在于， 该方法包括如下具体步骤(1)活化菌株标准样品的制备取粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌的菌种分别在LB固体培养基上划线培养， 30-37°C下培养Μ-4 !，用无菌接种环挑取分散的单一菌落，置于蒸馏水中振荡，而后在 5000-10000rmp离心处理5-30min，离心沉淀物经洗涤后，制成三种活化菌株标准样品；(2)拉曼光谱检测将拉曼光谱表面增强试剂与上述活化菌株标准样品混合、振荡，使两者充分结合，而后 以拉曼光谱进行检测；(3)数据处理将各标准样品的拉曼光谱检测结果进行聚类分析，由此建立可用于鉴别和区分饮用水 致病菌的种属的聚类分析图；(4)参照步骤O)的操作，以拉曼光谱检测一种以上未知菌种样品，将所得拉曼光谱检 测结果与步骤( 所得上述标准样品的拉曼光谱检测结果和步骤( 所得聚类分析图进行 比对，从而鉴定未知菌种的种属。
全文摘要
本发明涉及一种饮用水致病菌的表面增强拉曼光谱鉴别方法。该方法为采用金或银纳米溶胶作为增强试剂，以表面增强拉曼光谱对GB 8537-2008《饮用天然矿泉水》中规定的三种致病菌粪链球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)进行检测，经对检测结果进行聚类分析，实现对饮用水致病菌的鉴别。本发明方法灵敏度高，选择性好，易于操作，检测速度快，成本低廉，可实现饮用水致病菌的大规模在线检测，适于在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
文档编号C12Q1/04GK102121042SQ201010579950
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者姚卫蓉, 孙莹莹, 汪仕韬, 汪朋, 纪丽君, 黄玉坤 申请人:江南大学