专利名称：一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)主要引起母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍 等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV， 命名为Lelystad病毒(LV)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为 VR-2332。该病毒1996年传入中国并长期存在，成为危害我国养猪业的主要猪病病毒之一。近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-la、Si、HB-I和HB_2等毒 株。2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，给养猪业造成 了巨大的经济损失，中请人在研究该病的过程中，发现了其主要病原——高致病性PRRSV变 异株，这一类的高致病性PRRSV变异株以Nsp2基因第1594 1680位核苷酸连续缺失为特 征，并分离鉴定了代表性病毒株——NVDC-JXAl株(分类命名繁殖与呼吸综合征病毒；保 藏编号CGMCC No. 1964)。2006年，申请人针NVDC-JXAl病毒株建立了特异性的RT-PCR检测方法，用于检 测该病毒感染。但是2009年以来，通过在自然界中不断演化，我国高致病性PRRSV变异株 已经在基因组序列上发生了一些变化；同时，由于CHl-R疫苗等毒株逐渐推广使用，对原有 RT-PCR检测方法造成了非特异性的干扰。这些情况的出现，使得原有的RT-PCR检测方法和 试剂盒已经不能有效地鉴别检测田间流行的高致病性PRRSV变异株。本发明基于对2006年至2010年分离的多个高致病性PRRSV变异株基因序列分 析，针对分离毒株Nsp2基因序列的共同特征，设计了一系列PCR引物，并经过优化和试验 筛选，获得了一对PCR引物。采用该引物组装的RT-PCR试剂盒，可以检测出当前发现的全 部高致病性PRRSV变异株，并且不受经典PRRSV (是指Nsp2基因未发生第1594 1680位 核苷酸连续缺失的毒株)和CHl-R疫苗毒株的干扰，从而能够特异、敏感地检测出高致病性 PRRSV变异株。因此，该试剂盒能对高致病性PRRSV诊断和监测起到重要作用。
发明内容
本申请涉及针对高致病性PRRSV变异株NSP2基因片断设计的RT-PCR引物对，用 于检测高致病性PRRSV变异株(本发明中特指Nsp2基因第1594 1680位核苷酸连续缺 失为特征的毒株)。该引物对包括上游引物SEQ ID NO :1和下游引物SEQ ID NO :2的核苷 酸序列为SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3‘SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘本申请还提供一种能够特异、敏感地检测出高致病性PRRSV变异株的RT-PCR试剂盒，包含如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物对。试剂盒的其他组分均按照常规方 法配制，具体为1. RNA提取试剂由醋酸钠溶液350 μ 1，酚/氯仿/异戊醇混合液3. 5ml，异丙醇 3. 5ml，75%乙醇12ml，无菌DEPC水450 μ 1，RNA酶抑制剂24 μ 1组成。2. RT-PCR反应试剂由RT反应液200 μ 1 (含反转录引物序列RT引物 5，-TCgCCCTAAT-3，) ,RNA 酶抑制剂 24 μ 1.AMV 反转录酶 12 μ 1、PCR 反应液 200 μ 1,0. 5U/ μ LTaq DNA聚合酶25 μ 1、矿物油300 μ 1组成。3.电泳检测试剂包括50ΧΤΑΕ电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100 μ 1、上样缓 冲液50 μ 1。4.阴性对照350 μ 1、阳性对照350 μ 1,变性液7ml。
图 1:SEQIDN0:1图 2:SEQIDN0:2图3 RT-PCR检测部分PRRSV病毒样品的电泳结果。注1.高致病性PRRSV NVDC-JXAl株；2.高致病性PRRSV TJ-F92疫苗；3.高致病性PRRSV HuM-Fl 12疫苗；4.混 样1 (勃林格MLV疫苗+高致病性PRRSV JXAl-R疫苗)；5.高致病性PRRSV 2009当阳分离 毒株；6.经典PRRSV NM191病毒株；7.经典PRRSV DX F5病毒株；8.经典PRRSV VR2332病 毒株；9.经典PRRSV HB2病毒株；10.经典PRRSV CH-I R疫苗；11.经典PRRSV勃林格MLV 疫苗；12. SPF猪血清LOl ；13.阴性对照；14.阳性对照；15. DNA Marker0
具体实施例方式实施实例1RT-PCR引物合成与筛选根据2006年至2010年分离鉴定的高致病性PRRSV的NSP2基因序列，设计一系列 上游引物BUl BU34，设计一系列下游引物BDl BD27。引物由相关公司按常规方法合成。 用这些引物两两组成引物对，分别进行RT-PCR试验，检测各种有代表性的病毒样品，包括A 高致病性PRRSV NVDC-JXA1株阳性对照；B 高致病性PRRSV变异株阳性组织； C 经典PRRSV CH-IR疫苗；D 经典PRRSV勃林格疫苗；E 阴性组织；F 阴性对照(纯水)。通过多次测试，并比较检测结果，最终确定了特异性最好，检出率最高的引物对 BU21&BD16，作为RT-PCR试剂盒的引物。具体核苷酸序列为SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3 ‘ (BU21 序列)SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘ (BD16 序列)表1上游引物备选序列
BUlCCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTCBU3AGTGAGCCCGTACTTGTGCCCBU4AGTGAGCCCGTACTTGTGBU5ATGAGTGAGCCCGTACBU6GCGACGTGTCCCCAAGCTGBU7GACGTGTCCCCAAGCTGABU8GCGAGAACTCCCCAAGCTGBU9GCGAGAACTGCCCAAGCTGBUlOGACGTGGAACCAAGCTGABUllGACGGAACTGCAAGCTGABU12GAGTGAGCCCGTACTTGTGCBU13CTATGAGTGAGCCCGTACTTGBU14CCTATGAGTGAGCCCGTACBU15GCAGAACAAAGTCTGTCAMAGBU16TTGGAAGAGGTTGTCCTGGBU17GCACCCTGGTCCCTCCCBU18GTCAACTCATGCTGCACCCBU19GCCAGAGGACAAGCCTGTCBU20AMGCTTGCCAGAGGACAAGCCBU21CGCAGAACAMGTCTGTCMAAGBU22CMCCTCGCAGAACAAAGTCTGBU23GAGTTCAACCTCGCAGAACAAAGBU24GGGCGGCTGAGCAGGTCGBU25CCAGGCGACTTCAGAAATGATGBU26CTGCTAAAACTAGCCAACACCCBU27CTCATGTCCACTGGACTTGGC
权利要求
1.一种用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的RT-PCR引物对，其特征 在于其引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.一种如权利要求1所述的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的RT-PCR 试剂盒，其特征在于包含如权利要求1所述的引物对。
全文摘要
本发明涉及一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RT-PCR引物对和RT-PCR试剂盒，可以特异、敏感地检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病毒株。
文档编号C12N15/11GK102140526SQ20101060212
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者乔明明, 孙明, 曲萍, 王传彬, 田克恭, 遇秀玲, 陈曦, 陈西钊 申请人:中国动物疫病预防控制中心