专利名称：在乳酸菌中改善流向乙酰乳酸来源产物的流量的制作方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物学和乳酸菌代谢领域。更具体地讲，制备工程化的基因修饰以降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶基因的酶活性，从而提高作为生物合成期望产物(包括异丁醇)底物的乙酰乳酸的可用性。
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背景技术：
已经改变了在乳酸菌的内源生物合成途径中的代谢流量以产生使用丙酮酸作为 起始底物的产物。在乳酸菌中的主要丙酮酸代谢途径是通过乳酸脱氢酶(LDH)的活性将其转化成乳酸。在乳酸菌中使丙酮酸代谢产物从乳酸改为其他产物的代谢工程已经产生不可预知的结果。在表达丙氨酸脱氢酶的LDH缺陷型乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)中产生丙氨酸在Hols等人(Nature Biotech. 17 :588-592(1999))中示出。然而，在表达丙酮酸脱羧酶的LDH缺陷型植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中乙醇的产量是非常有限的，流向乙醇的碳流未显著改善并且仍产生乳酸(Liu等人(2006) J. Ind. Micro. Biotech. 33 1-7)。在乳酸菌中也通过某个途径将丙酮酸转化成乙酰乳酸，然后通过乙酰乳酸脱羧酶将其转化成乙偶姻，随后转化成2，3_ 丁二醇。附加的途径将乙酰乳酸转化成丁二酮、纟颜氨酸或亮氨酸。Monnet 等人(Applied and Environmental Microbiology 66:5518-5520(2000))已经通过化学诱变消除了乙酰乳酸脱羧酶活性并降低了 LDH活性以提高乙酰乳酸、乙偶姻和丁二酮的产量。在美国专利申请公布20100112655中公开了在乳酸菌中通过表达异源丁二醇脱氢酶活性并基本上消除乳酸脱氢酶活性以工程化从丙酮酸转化为2，3- 丁二醇的高流量。在共同未决的美国专利申请公布2010-0081183中公开了通过表达异源DHAD并基本上消除乳酸脱氢酶活性来工程化乳酸菌以获得高二羟酸脱水酶(DHAD)活性。DHAD是在共同未决的美国专利申请公布US20070092957A1中公开的用于合成异丁醇的生物合成途径中的一个酶。在其中公开了用于产生异丁醇的重组微生物的工程化。异丁醇作燃料添加剂是有用的，其可用性可减少对石油化学燃料的需求。在de Vos等人(Int. Dairy J. 8 :227-233 (1998))中公开了在快速生长的乳酸菌细胞中组合灭活编码乙酰乳酸脱羧酶的aldB与灭活编码乳酸脱氢酶的Idh似乎是不可能的。需要改变乳酸菌中流向乳酸和从乙偶姻流向2，3_ 丁二醇途径的代谢流，并且使其流向乙酰乳酸下游的其他生物合成途径，例如产生异丁醇的生物合成途径。发明概沭本文所公开的是经基因修饰以消除乳酸脱氢酶活性并降低或消除乙酰乳酸脱羧酶活性的乳酸菌细胞，所述酶由编码乳酸脱氢酶(Idh)和乙酰乳酸脱羧酶(aldB)的基因内源性表达。所述细胞无可检测到的脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶活性。这些细胞可用于产生异丁醇和利用乙酰乳酸作为中间体的其他产物。因此，提供重组乳酸菌细胞，所述细胞包含降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰。在另一个实施方案中，重组乳酸菌细胞还可包含至少一个降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的基因修饰。也可包括其他基因修饰例如附加的生物合成途径和/或附加的修饰，所述修饰使细胞可利用多种底物或产生其他产物。在另一个实施方案中，提供了制备重组乳酸菌细胞的方法，包括a)提供乳酸菌细胞； b)通过基因工程来修饰(a)的细胞中编码乳酸脱氢酶的至少一个内源性基因以消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性；c)在(b)的细胞中从质粒表达乙酰乳酸脱羧酶活性以产生具有非染色体表达的乙酰乳酸脱羧酶的细胞；(d)通过基因工程来修饰(C)的细胞中编码乙酰乳酸脱羧酶的内源性基因以消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性；以及(e)从(d)的细胞去除表达乙酰乳酸脱羧酶活性的所述质粒；从而制备缺失内源性表达的乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的重组乳酸菌细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了产生异丁醇的方法，包括(a)提供乳酸菌细胞，该细胞包含i)消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个基因修饰；和ii)异丁醇生物合成途径以及(b)在其中产生异丁醇的条件下培养(a)的细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了乳酸菌的整合载体，其包含a)可操作地连接至在LAB细胞中有活性的启动子的Tn_5转座酶编码区；b)邻接在乳酸菌细胞中有活性的选择标记和被靶向用于整合的DNA片段的Tn5IE和TN50E元件；c)在大肠杆菌细胞中有活性的选择标记；d)大肠杆菌细胞的复制起点；e)温度敏感型的乳酸菌细胞的复制起点；其中所述Tn5IE和TN50E元件指导b)的DNA片段的随机整合。在另一个实施方案中，本发明提供了将DNA片段随机整合到LAB细胞基因组的方法，包括a)提供载体，该载体包含(i)可操作地连接至在乳酸菌细胞中有活性的启动子的Tn-5转座酶编码区；(ii)邻接在大肠杆菌和乳酸菌细胞中有活性的选择标记的Tn5IE和TN50E元件；
(iii)在乳酸菌细胞中有活性的第二选择标记；(iv)大肠杆菌细胞的复制起点；(V)条件性有活性的乳酸菌细胞的复制起点；b)将用于整合的DNA片段置于步骤a (ii)的元件之间以产生整合构建体；c)将所述整合构建体转化到乳酸菌细胞中，从而制备转化的细胞；d)使用步骤a(ii)的选择标记,在允许条件下培养并选择步骤(C)的转化的细胞 以制备选择的转化子；以及e)在非允许条件下培养步骤(d)的选择的转化子；其中从所述乳酸菌细胞中去除所述载体并将所述用于整合的DNA片段随机整合到所述乳酸菌细胞的基因组中。附图
和序列简沭从下文的发明详述、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施方案，它们形成本专利申请的一部分。图I示出乳酸菌中起始于丙酮酸的生物合成途径的图表。图2示出生物合成异丁醇的生物合成途径。下列序列符合37C. F. R. I. 821-1. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25 (2009)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5. 2和49. 5 (a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § I. 822中所列出的规定。表I :乳酸脱氡酶编码区和蛋白质的SEQ ID NO
权利要求
1.重组乳酸菌细胞，包含降低或消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰。
2.权利要求I的细菌细胞，包含消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个工程化基因修饰。
3.权利要求I的细菌细胞，其中每个工程化基因修饰是去除编码乙酰乳酸脱羧酶或乳酸脱氢酶的基因的至少一部分。
4.权利要求3的细菌细胞，其中所述编码乙酰乳酸脱羧酶的基因选自aldB、aldC和aid。
5.权利要求4的细菌细胞，其中所述编码乙酰乳酸脱羧酶的基因编码蛋白质，所述蛋白质具有的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:24、26、28、30、32、34、36和38的序列具有至少约.95%同一性。
6.权利要求3的细菌细胞，其中所述基因编码乳酸脱氢酶并选自ldhL、ldhD、ldhLl和ldhL2。
7.权利要求6的细菌细胞，其中所述编码乳酸脱氢酶的基因编码蛋白质，所述蛋白质具有的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22的序列具有至少约95%同一1f生。
8.权利要求I的细菌细胞，其中所述细胞是选自下组的属的成员乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、酒球菌属、片球菌属和链球菌属。
9.权利要求I的细菌细胞，还包含降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的至少一个基因修饰。
10.权利要求9的细菌细胞，其中所述基因修饰在编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因中、在编码丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的基因中、或在上述两种基因中。
11.权利要求10的细菌细胞，其中所述编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因选自pfl、PflBl和pf 1B2，并且所述编码甲酸C-乙酰转移酶激活酶的基因选自pf 1A、pflAl和pflA2。
12.权利要求1、2或8的细菌细胞，其中所述细胞产生异丁醇。
13.权利要求12的细菌细胞，包含异丁醇生物合成途径。
14.权利要求13的细菌细胞，其中所述异丁醇生物合成途径包括由下列组成的底物至产物的转化 a)丙酮酸至乙酰乳酸； b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸； c)2，3- 二羟基异戊酸至a -酮异戊酸； d)a-酮异戊酸至异丁醛；以及 e)异丁醛至异丁醇。
15.制备重组乳酸菌细胞的方法，包括 a)提供乳酸菌细胞； b)通过基因工程来修饰(a)的细胞中编码乳酸脱氢酶的至少一个内源性基因以消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性； c)在(b)的细胞中从质粒表达乙酰乳酸脱羧酶活性以产生具有非染色体表达的乙酰乳酸脱羧酶的细胞； (d)通过基因工程来修饰(c)的细胞中编码乙酰乳酸脱羧酶的内源性基因以消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性；以及 (e)从(d)的细胞去除表达乙酰乳酸脱羧酶活性的所述质粒； 从而制备缺失内源性表达的乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的重组乳酸菌细胞。
16.制备重组乳酸菌细胞的方法，包括 a)提供乳酸菌细胞； b)通过基因工程来修饰(c)的细胞中编码乙酰乳酸脱羧酶的内源性基因以消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性； c)在(b)的细胞中从质粒表达乳酸脱氢酶活性以产生具有非染色体表达的乳酸脱氢酶的细胞； (d)通过基因工程来修饰(a)的细胞中编码乳酸脱氢酶的至少一个内源性基因以消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性；以及 (e)从(d)的细胞去除表达乳酸脱氢酶活性的所述质粒； 从而制备缺失内源性表达的乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的重组乳酸菌细胞。
17.权利要求15的方法，其中步骤(b)包括在(c)之前修饰编码乳酸脱氢酶的第一基因，然后在步骤(c)之后通过基因工程来修饰编码乳酸脱氢酶的第二基因。
18.权利要求15、16或17的方法，还包括修饰至少一个内源性基因以降低丙酮酸甲酸裂解酶活性。
19.产生异丁醇的方法，包括 (a)提供乳酸菌细胞,该细胞包含 i)消除内源性表达的乙酰乳酸脱羧酶的酶活性的至少一个基因修饰和消除内源性表达的乳酸脱氢酶的酶活性的至少一个基因修饰；和 ii)异丁醇生物合成途径；以及 (b)在其中产生异丁醇的条件下培养(a)的细胞。
20.权利要求19的方法，其中(a)的乳酸菌细胞还包含降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的至少一个基因修饰。
21.用于乳酸菌的整合载体，包含 a)可操作地连接至在乳酸菌细胞中有活性的启动子的Tn-5转座酶编码区； b)邻接在大肠杆菌和乳酸菌细胞中有活性的选择标记和被靶向用于整合的DNA片段的Tn5IE和TN50E元件； c)在乳酸菌细胞中有活性的第二选择标记； d)大肠杆菌细胞的复制起点； e)条件性有活性的乳酸菌细胞的复制起点； 其中所述Tn5IE和TN50E元件指导b)的DNA片段随机整合到所述乳酸菌细胞基因组中。
22.将DNA片段随机整合到乳酸菌细胞基因组中的方法，包括 a)提供载体，该载体包含 i)可操作地连接至在乳酸菌细胞中有活性的启动子的Tn-5转座酶编码区；ii)邻接在大肠杆菌和乳酸菌细胞中有活性的选择标记的Tn5IE和TN50E元件； iii)在乳酸菌细胞中有活性的第二选择标记； iv)大肠杆菌细胞的复制起点； V)条件性有活性的乳酸菌细胞的复制起点； b)将用于整合的DNA片段置于步骤a(ii)的元件之间以产生整合构建体； c)将所述整合构建体转化到乳酸菌细胞中，从而制备转化的细胞； d)使用步骤a(ii)的选择标记，在允许条件下培养并选择步骤(C)的转化的细胞以制备选择的转化子；以及 e)在非允许条件下培养步骤(d)的选择的转化子； 其中从所述乳酸菌细胞中去除所述载体并将所述用于整合的DNA片段随机整合到所述乳酸菌细胞的基因组中。
全文摘要
本发明开发了工程化方法以允许基因修饰以及缺失乳酸脱氢酶和乙酰乳酸脱羧酶活性的乳酸菌细胞的分离。在具有这些修饰和异丁醇生物合成途径的细胞中，观察到改善的异丁醇产量。
文档编号C12N9/04GK102712912SQ201080053940
公开日2012年10月3日 申请日期2010年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者B·J·保罗, W·苏 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司