专利名称：一株产苯乳酸的菌株及该菌发酵法制备苯乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及一株能够产苯乳酸的片球菌属乳酸菌，更具体地说，本发明涉及一种戍糖片球菌{PediococcusSK25发酵生物转化制备苯乳酸的方法,属于食品生物技术领域。
背景技术：
随着食品工业的快速发展以及人们对食品安全性要求的提高，天然食品防腐剂的研究与开发已成为食品工业的研究热点之一，也是今后防腐剂发展的主要方向。天然食品防腐剂按其来源的不同可分为植物源天然防腐剂、动物源天然防腐剂以及微生物源天然防腐剂等类型，其中微生物源防腐剂又常被称为生物抗菌剂。现已从微生物中得到的天然防腐剂有细菌素类的乳酸菌素和放线菌类的纳他霉素、霉菌类的米曲霉发酵产生的曲酸以及某些酵母菌、真菌、食用菌和聚赖氨酸等。开发研制来自微生物的天然食品防腐剂是寻求新型防腐剂应用于食品工业的重要方向。目前新型微生物源天然食品防腐剂主要有5种，包括乳球菌肽、溶菌酶、聚赖氨酸、苯乳酸及曲酸。其中苯乳酸(phenyllactic acid)作为一种新型天然抗菌物质，与其它新型防腐剂相比有其独特的优点，它是一种小分子物质，抑菌谱宽、稳定性高。一般常见生物防腐剂如乳酸链球菌素等亲水性差，不易扩散。而苯乳酸的亲水性却较强，能够在各种食品体系中均匀分散。苯乳酸对热和酸的稳定性也较好，熔点为121°C 125°C.并于121°C 条件下可保持20min不被破坏。其可在广泛的pH范围内保持稳定。研究表明苯乳酸对多种食源性致病菌如致病性大肠杆菌r&cAericAia coli 0157:H7),单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌aureus、,腐败菌包括产毒素的丝状真菌如赭曲霉、抚孢青霉和桔青霉，有很强的抑菌作用，其抑菌活性强于常见的防腐剂。乳酸菌能产多种抑菌效果的物质，如乳酸、醋酸、Nisin (乳链球菌素)等，部分已经用于食品工业，如Nisin和纳他霉素，但是存在诸如抑菌谱窄、理化性质差等问题，如Nisin只能抑制除乳酸菌以外的G+细菌，而对绝大部分G—细菌、酵母菌和霉菌没有作用；纳他霉素只对霉菌有抑制作用。与Nisin和纳他霉素相比，苯乳酸安全性高，是一种新型天然抑菌物质、防腐剂，它存在于天然蜂蜜中，对人和动物细胞无毒，作为一种新型生物防腐剂，苯乳酸在乳品工业中具有广阔的应用前景。目前苯乳酸的制备有化学催化合成以及生物转化方法。化学合成法有许多不利的因素，例如产生多种副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使分离、纯化步骤变得复杂。近年来研究人员都在寻找生物转化的方法来制备苯乳酸，由于乳酸菌是GRAS (公认为安全)的微生物，用安全菌株合成苯乳酸成为当前研究的热点。目前关于乳酸菌发酵产苯乳酸的菌种很多，包括Zac tobacillus.、Weissella^ En terococcus^Leuconos toe 等都可以生物合成苯乳酸，然而片球菌属乳酸菌的苯乳酸合成能力至今未知,本发明证明了片球菌(/fet/iococciAs)属中的戍糖片球菌pentosaceus) 5 "具有产苯乳酸的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产苯乳酸的菌株，具体涉及片球菌(I>ediococcus')属的一株乳酸菌戍糖片球菌(PediococcusSK25发酵转化法获得这种新型天然防腐剂，开拓了乳酸菌生物转化制备苯乳酸的研究领域。本发明的技术方案一株产苯乳酸的片球菌属乳酸菌，其分类命名为戍糖片球菌 {Pediococcus pentosaceus) SK25,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO M 2011360。用所述的CCTCC NO M 2011360菌株发酵生产苯乳酸的方法，以CCTCC NO M 2011360作为出发菌种，以添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸的MRS培养基为发酵液，发酵法生物转化制备苯乳酸；工艺为
(1)菌种CCTCCNO M 2011360 ；
(2)培养基，以g/L计
保藏培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙
酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L, pH 6. 2-6. 4;2%琼脂粉，以自来水配制；
f种子培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙
酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L，pH 6. 2-6. 4，以自来水配制；
f发酵培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙
酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L，苯丙氨酸或苯丙酮酸 1-10 mmol/L, pH 6. 2-6. 4,以自来水配制；
(3)制备工艺
t菌种保藏将CCTCC NO M 2011360保藏在保藏培养基上，4°C保存，两周转接一次；
或在活化菌种对数期时按照保藏培养基甘油质量比为1:1将其保藏在_80°C超低温冰箱中；
f种子培养将CCTCC NO M 2011360从保藏培养基接种至种子培养基需活化2代，每次30°C静止培养12 h，即总共24h ；
I发酵培养将种子培养后的种子液按发酵液质量2%接入发酵培养基中，30°C静止培养 36h ；
Z发酵液后处理通过低温离心法和O. 22ΜΠ1微滤法除去发酵液中的菌体，即得产品苯乳酸。
离心除菌体后，其上清部分经过微孔滤膜过滤(O. 22Mffl),滤液上HPLC分析。所述的发酵生产苯乳酸的方法，发酵液中添加苯丙酮酸或苯丙氨酸的最终浓度为 5-6mmo1 /I, η检测苯乳酸的方法如下
发酵液离心，弃菌体沉淀，上清液经微孔滤膜过滤(O. 22Mm),滤液上HPLC分析。HPLC
条件了 AgilentllOO 色谱柱Z0RBAX 300SB C18 (5 μ m、4. 6X250mm)，空流动相
- 3-·
(A)O. 05%三氟乙酸/甲醇和(B)O. 05%三氟乙酸/水，f梯度洗脱程序0、18、20、21、24分钟时的洗脱液A/B体积比组成分别为10:90、100: 0,100: 0,10:90、10:90，「|:检测器紫
外检测器波长210nm,道柱温30°C，f流速lmL/min，T进样量10μ ，%苯乳酸标样浓度0. 5mg/mL。本发明的有益效果本发明首次提供了一种利用微生物转化制备苯乳酸的方法， 表明戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) SK25经36h发酵能产苯乳酸、且在MRS发酵培养液中苯乳酸含量可达O. 8mmol/L,是目前报道的产苯乳酸最高的菌种；发酵培养基中添加底物苯丙氨酸(phenylalanine)、或苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)时苯乳酸的产量会提闻。生物材料样品保藏一株戍糖片球菌SK25 {PediococcusSK25,已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M 2011360，保藏日期2011年10月21日。
图I发酵时间对转化产苯乳酸的影响。图2 36h后发酵液中苯乳酸(PLA)的HPLC检测。其中(A)为苯乳酸标样(B)为 36h后发酵液HPLC检测。图3苯丙氨酸、苯丙酮酸对苯乳酸产量的影响。
具体实施例方式通过实验，得到了影响发酵转化合成苯乳酸的主要因素
实施例I发酵时间对苯乳酸产量的影响
按说明书所述的发酵条件，通过对戍糖片球菌(PediococcusSK25在不
同发酵时间产苯乳酸的检测，发现发酵36h苯乳酸含量最高，故确定发酵时间36h为最佳发酵时间。表I发酵时间对转化产苯乳酸的影响
权利要求
1.一株产苯乳酸的片球菌属乳酸菌，其分类命名为戍糖片球菌ipediococcus pentosaceus) SK25，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2011360。
2.用权利要求I所述的CCTCCNO M 2011360菌株发酵生产苯乳酸的方法，其特征在于以CCTCC NO M 2011360作为出发菌种，以添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸的MRS培养基为发酵液，发酵法生物转化制备苯乳酸；工艺为(1)菌种CCTCCNO M 2011360 ；(2)培养基，以g/L计:X保藏培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L, pH 6. 2-6. 4 ;2%琼脂粉， 以自来水配制；2种子培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L，pH 6. 2-6. 4，以自来水配制；.5发酵培养基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氢二钾2，无水乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁O. 58，硫酸锰O. 25，吐温-80 lmL/L，苯丙氨酸或苯丙酮酸 1-10 mmol/L, pH 6. 2-6. 4,以自来水配制；(3)制备工艺X菌种保藏将CCTCC NO M 2011360保藏在保藏培养基上，4°C保存，两周转接一次； 或在活化菌种对数期时按照保藏培养基甘油质量比为1:1将其保藏在_80°C超低温冰箱中；S种子培养将CCTCC NO M 2011360从保藏培养基接种至种子培养基需活化2代，每次30°C静止培养12 h，即总共24h ；.1:发酵培养将种子培养后的种子液按发酵液质量2%接入发酵培养基中，30°C静止培养 36h ；X发酵液后处理通过低温离心法和O. 22Mffl微滤法除去发酵液中的菌体，即得产品苯乳酸。
3.根据权利要求2所述的发酵生产苯乳酸的方法，其特征在于发酵液中添加苯丙酮酸或苯丙氨酸的最终浓度为5-6mmol/L。
全文摘要
一株产苯乳酸的菌株及该菌发酵法制备苯乳酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明公开了一株产苯乳酸的片球菌属乳酸菌，具体涉及筛选获得能产苯乳酸的片球菌属乳酸菌(Pediococcuspentosaceus)SK25，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2011360。本发明以此片球菌为出发菌株，在MRS培养基发酵完成液中，苯乳酸含量达到0.8mmol/L，目前已报道的最高野生菌种MRS培养基发酵液中最高产量仅为0.57mmol/L。当在MRS培养基中添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸时，苯乳酸产量会提高，其中添加苯丙酮酸的效果更为明显，确定其最适添加量为5-6mmol/L。本发明所得产品安全可靠，可用作药用中间体，食品添加剂，具有很强的抑菌防腐功能。
文档编号C12R1/01GK102604858SQ20121000554
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者江波, 沐万孟, 郁书怀 申请人:江南大学