专利名称：一种醋酸棉酚降解菌s1的制作方法
技术领域：
本发明一种醋酸棉酚降解菌Si，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解游离棉酚，适用于现代高浓度棉酚含量的棉籽粕的生物处理。
背景技术：
棉籽饼粕是重要的植物蛋白饲料资源，但由于棉籽饼粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡、粗纤维含量高等原因，成为限制其在养殖业中广泛使用的主要因素。饲粮中包含一定量的棉酚(re)可对动物生长、繁殖以及胃肠道和体组织器官产生负面作用，re可与棉仁中的蛋白、糖类、氨基酸、磷脂等结合而被“封闭”，使re失去毒性，其结合后难以被动物消化吸收，但有报道指出结合棉酚在动物消化过程中又能释放出re，产生毒性。有研究表明反刍动物对棉酚具有较大的耐受力；研究者还发现霉变的棉籽粕中棉酚含量非常低， 进一步的研究表明霉菌对棉酚具有降解作用。顾赛红等和^iang等Q006)研究表明，微生物发酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同时提高了蛋白质、氨基酸等营养物质含量及消化吸收率，mi等(1989)和Kornegay等(197 亦有类似的研究结果。近年来发酵棉籽粕的研究主要集中于脱毒菌株的选育及其脱毒效果等的研究，但复合发酵菌株间协同或拮抗作用机理不明，工艺条件尚缺乏充分的理论基础。因此，本研究针对上述问题对发酵棉籽粕菌株做了进一步的筛选，研究了不同菌株的复合发酵及其适宜发酵工艺参数条件，以期为棉籽粕资源的充分利用提供更为有力的理论支持和指导。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的游离棉酚降解菌，使用本发明的微生物可以使高棉酚含量棉粕中的游离棉酚去除率在61. 38%，并且有很好的菌株稳定性。使用该降解菌株可以高效降解棉籽粕中的游离棉酚，使之达到使用标准，把棉籽粕变成可利用的饲料蛋白源，对促进我国饲养业的发展具有重要的意义。技术方案下面为本发明的主要内容一种醋酸棉酚降解菌Si，其特征在于菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2010年11月 26日，菌种保藏号为CGMCC No. 4369。该菌种为根霉菌属米根霉Iihizopus oryzae，主要生物学特性为米根霉(Si)黑色，圆形，孢囊孢子，有假根，无鞭毛，不能运动；马铃薯琼脂培养基中生长，能在查氏培养基中生长，发酵蔗糖；能以0.3%醋酸棉酚为唯一碳源进行生长。该菌株的基因序列为NO. 1。电镜检验结果可见长出孢囊梗的菌丝，并且孢囊梗顶端膨大的孢子囊，孢子囊呈黑色，还有颜色较深的假根，孢子囊内有无数球形、卵形的孢囊孢子。经发酵效果较好的菌株Si发酵，棉籽粕re含量较发酵前极显著降低(ρ < ο. οι)， 粗蛋白(CP)含量亦极显著提高(？<0.01)，其中阳降解率为61.38%，CP提高率为24. 34%。使用上述醋酸棉酚降解菌工艺为保藏菌种-摇瓶种活化-筛选培养基-一级菌种-二级菌种。具体实施步骤为1)霉变棉籽粕稀释制成不同梯度后涂布于0. 醋酸棉酚查氏培养基平板上， 300C，恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0. 2 %、0. 3 %的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株。2)将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml三角瓶得到一级菌种 (条件为30°C，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入Iml于装有IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养48h)。3)将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入到IOOg棉籽粕发酵底物，接种量为5%，30°C培养48h。烘干测定TO及CP含量，分析发酵效果。棉籽粕发酵底物的配方为 将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7 2 1的比例混合均勻构成基础底物。按底物与水为1 0.8的比例加入水分发酵，121°C灭菌30min。分析发酵效果，其中经菌株Sl发酵后，CP提高率达24. %，FG降解率达 61.38%。经菌种鉴定，结果为米根霉(Si)。有益效果用树下土壤、池塘水处理棉籽粕，本发明从霉变的棉籽粕中分离到一株耐高浓度棉酚的优势菌Si，对其生物学特性和耐棉酚机理进行了初步研究，并在棉籽粕的发酵工艺中得到了成功应用。使用该发明生产的高浓度醋酸棉酚降解菌株，具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在动物饲料的发酵工艺中投加使用，可以缩短生化处理系统的启动时间，并提高处理效果。优势菌Sl对棉酚的降解率为61.38%，CP提高率为对.24%。并且菌株有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。
具体实施例方式以下叙述本发明的实施例。将本实验中筛选得到的几株菌株原种在筛选培养基上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml马铃薯液体培养基IOOOml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml三角瓶得到一级菌种 (条件为30°C，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入Iml于装有IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养48h)。醋酸棉酚无糖查氏培养基配方为醋酸棉酚 3g/L，NaN03 2g/L，KCl 0. 5g/L,FeS04 0. 01g/L，MgS04 ·7H20 0. 5g/L, K2HP041. 00g/L，琼月旨 17g/L, PH 自然，121°C灭菌 30min。具体步骤为1)霉变棉籽粕稀释制成不同梯度后涂布于0. 醋酸棉酚查氏培养基平板上， 300C，恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0. 2 %、0. 3 %的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株。2)将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml三角瓶得到一级菌种 (条件为30°C，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入Iml于装有IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30°C，200r/min摇床培养48h)。3)将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入到IOOg棉籽粕发酵底物，接种量为5%，30°C培养48h。烘干测定TO及CP含量，分析发酵效果。棉籽粕发酵底物的配方为 将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7 2 1的比例混合均勻构成基础底物。按底物与水为1 0.8的比例加入水分发酵，121°C灭菌30min。分析发酵效果，其中经菌株Sl发酵后，CP提高率达24. %，FG降解率达 61.38%。经菌种鉴定，结果为米根霉(Si)。用本发明的微生物按5%的接种量接种到发酵底物中，进行发酵，48小时后分别取样测定发酵底物中的游离棉酚的去除率，从表2可以看出，优势菌株对游离棉酚的降解率为61. 38%，并且有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。试验表明，用本发明生产的降解菌株能显著降低棉籽粕的毒性，提高棉籽粕的营养价值，丰富了优良菌种资源。本发明成功地解决了饲料工业和养殖业中棉籽粕饲用率低、 蛋白质饲料资源紧缺的问题。表1醋酸棉酚无糖查氏培养基筛选菌株生长情况
培养基
Sl S2 S4 S5 S7 S8
0.1%醋酸棉酚无糖查氏培养基 0.2%醋酸棉酚无糖查氏培养基
++++ +++ ++++ +++ +++
+++ ++++ +++ ++ +++ +++
0.3%醋酸棉酚无糖查氏培养基
+++ +++ +++ +++ +++ +++
注“ + ”表示菌种的生长情况，“ + ”越多表示生长状况越好。“_”表示不生长。表2不同菌种及组合发酉
孝对发酵效果的影响组别棉酚含量棉酚降解率粗蛋白含量粗蛋白提高率底物554.81±9.94aA一31.40%±0.20ff一Sl214.25±3.51cD61.38%±0.78eE39.01%±0.15aA24.24%±0.50aAS2237.08±6.67cC57.27%±1.49ff37.04%±0.07bB17.96%±0.25bBS4261.33±0.89iF52.900/(^0.19^1038.95%±0.23aA24.04%±0.76aAS5137.53±4.45gG75.21%±0.99cC35.02%±0.42dD11.53%±0.75deDS7106.98±3.06hH80.72%±0.68bB36.05%±0.32cC14.81%±1.43cCS8218.73+15.011/1360.58% 士 3.35eEF34.99%±0.50dD11.43%±1.02deD
注同行上标，不同大小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01)和差异显著(P < 0. 05)。
权利要求
1.一种醋酸棉酚降解菌Si，其特征在于菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2010年11月沈日，菌种保藏号为CGMCC No. 4369。
2.一种用权利要求1所述的醋酸棉酚降解菌Si，其特征在于是通过以下方法获得1)发酵棉籽粕菌种的筛选用树下土壤和池塘水处理棉籽粕，然后将霉变棉籽粕稀释不同梯度后涂布于0. 1%醋酸棉酚查氏培养基平板上，30°C恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0. 2%、0. 3%的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株；2)试验种子培养制备及方法斜面保存菌种接入20ml马铃薯液体培养基于IOOml三角瓶得到一级菌种条件为30°C， 200r/min摇床培养48h，取一级菌种接入Iml于装有IOOml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种，其条件为30°C，200r/min摇床培养48h ；3)单菌发酵效果研究将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入IOOg到棉籽粕发酵底物，接种量为5%， 30°C培养48h ；烘干测定re及CP含量，分析发酵效果，对优势菌株进行菌种鉴定；棉籽粕发酵底物的配方为将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7 :2 1的比例混合均勻构成基础底物；按底物与水为1 :0. 8的比例加入水分发酵，121°C灭菌30min。
全文摘要
本发明提供一种能降解游离棉酚的一种醋酸棉酚降解菌S1，经鉴定为毛霉菌目毛霉菌科根霉菌属稻根霉菌(Rhizopusoryzae)主要生物学特性为稻根霉黑色，圆形，孢囊孢子，有假根，无鞭毛，不能运动；马铃薯琼脂培养基中生长，能在查氏培养基中生长，发酵蔗糖；能以0.3%醋酸棉酚为唯一碳源进行生长。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。
文档编号C12N1/14GK102154120SQ201110004290
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者周光宏, 夏新成, 林海晶, 江芸, 高峰 申请人:南京农业大学