专利名称：增强阿片镇痛剂的镇痛作用的方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及增强阿片镇痛剂的镇痛作用的方法及试剂。
背景技术：
δ阿片受体(DOR)和μ阿片受体(MOR)都属于G蛋白偶联受体超家族的成员，它们在疼痛的调控中起作用。一般认为，DOR在痛觉传入末稍主要介导了脊髄背角神经元分泌的内源性阿片肽的抑制性作用，而MOR是阿片镇痛剂——吗啡的主要药物靶点。受体异源寡聚体的形成在G蛋白偶联受体超家族成员中是普遍存在的，早期药理学研究发现DOR的配体分子能够调控MOR的活性，暗示了 DOR和MOR间的相互关联。利用生物化学的方法，研究者发现不仅在MOR和DOR共转染的細胞而且从脊髄中分离的膜结构都存在二者形成的异源寡聚体。更为重要的是，药理学方法阻断或遗传学方法敲除DOR都能够增强MOR介导的痛觉丧失。然而，MOR和DOR间物理上的相互作用在痛觉调控中的重要性仍然需要进ー步确定。此外，了解DOR激动剂诱导的MOR活性抑制作用机制，可以为增强以MOR为靶点镇痛剂的效用和降低副作用提供一种新的思路和方法。选择性激动剂刺激后，G蛋白偶联受体被激活并内吞，接着通过再循环途径复敏或者进入降解途径导致受体下调。研究表明，内吞后的MOR和DOR经历不同的加工过程。MOR 激动剂DAMGO处理后，内吞的MOR主要通过再循环途径回到細胞膜上复敏，而DOR的激动剂处理后内吞的DOR主要被运输到溶酶体降解。激动剂诱导的阿片受体的磷酸化和泛素化在受体的内吞和降解中起了重要的作用。然而，以前的研究都是在外源単独转染MOR或DOR的細胞上进行的，那么在共表达两种受体的转染細胞或是神经元内MOR的运输是否受到DOR 的调控还不清楚。以前的研究暗示当两种受体共内吞时，它们共享相同的内吞后途径，而这一途径在单独表达其中一种受体时是不被采用的，因此受体的异源寡聚化可能是其中的一种机制。综上，本领域目前对于DOR与MOR两者的相互作用以及它们在細胞中的内吞机制还存在诸多不清楚之处。因此，本领域还有必要对此进行进ー步的研究，从而开发出对于调控痛觉有用的产品。
发明内容
本发明的目的在于提供增强阿片镇痛剂的镇痛作用的方法及试剂。在本发明的第一方面，提供抑制δ阿片受体(DOR)与μ阿片受体(MOR)相互作用的物质的用途，用于制备增强阿片镇痛剂的镇痛作用的制剂。在另ー优选例中，所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质选自δ阿片受体的抑制剂；μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白(MOR TMl)；或羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白。
在另一优选例中，所述到抑制δ阿片受体(DOR)与μ阿片受体(MOR)相互作用 的物质还用于制备治疗疼痛的制剂。在另一优选例中，所述的羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域 蛋白是一融合蛋白，其氨基端为μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白，羧基端为穿膜肽。在另一优选例中，所述的融合蛋白的氨基端为μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋 白，羧基端为反式激活蛋白(Transactivator, TAT), Polyarginine, Penetratin, MAP 或 Transportan0在另一优选例中，所述的δ阿片受体的抑制剂选自naltrindole、ICI 174,864, TIPP, Naltriben0在另一优选例中，所述的阿片镇痛剂是作用在Mu阿片受体上的镇痛药。在另一优选例中，所述的阿片镇痛剂包括但不限于阿片生物碱类(如吗啡、可待 因)或人工合成品(如哌替啶、丁丙诺啡、埃托啡、芬太尼、美沙酮、二氢埃托啡等)。在另一优选例中，所述的阿片镇痛剂是吗啡。在另一优选例中，所述的镇痛作用包括脊髓水平的镇痛作用，热痛，炎性痛以及 机械痛等。在另一优选例中，所述的痛是慢性疼痛，急性疼痛。在另一优选例中，所述的痛是伤害感受器性疼痛，神经病理性疼痛。在另一优选例中，所述的痛包括但不限于头痛，面部痛，颈痛，肩痛，背痛，胸痛， 腹痛，背部痛，腰痛，下肢痛，肌肉与骨骼疼痛，躯体疼痛，血管疼痛，痛风，关节炎疼痛，与躯 体病样精神障碍有关的疼痛，内脏疼痛，感染性疾病(如AIDS和带状疱疹后神经痛)导致 的疼痛，多骨疼痛，镰刀细胞贫血、自身免疫性疾病、多发性硬化或炎症有关的疼痛，急慢性 炎症疼痛，癌性疼痛，神经病性疼痛，损伤或手术引起的疼痛，癌性痛，伤害感受性疼痛，糖 尿病、外周神经病、疤疹后神经痛，三叉神经痛，腰部或子宫颈神经根病，舌咽神经痛，自主 神经反射性疼痛，反射性交感神经营养不良、神经根撕脱、癌症、化学损伤、毒素、营养缺乏、 病毒或细菌感染、烧伤或其联合形式有关导致的神经病理性疼痛，老龄化导致的退行性骨 关节病，或它们的联合形式。在本发明到另一方面，提供抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的蛋白，所述 的蛋白是μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白；或羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白。在另一优选例中，所述的羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域 蛋白是一融合蛋白，其氨基端为μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白，羧基端为穿膜肽。在另一优选例中，所述的穿膜肽是反式激活蛋白，Penetratin, polyarginine, MAP 或 Transportan0在另一优选例中，所述的羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域 蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO :4中第9_39位连接50_60位所示的蛋白；氨基酸序列如SEQ ID NO :4中第9_60位所示的蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的蛋白。
在本发明到另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的蛋白。在本发明到另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备增强阿片镇痛剂的镇痛作用的制剂。在本发明到另一方面，提供ー种质粒载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明到另一方面，提供一种遗传工程化的宿主細胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明到另一方面，提供一种所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主細胞；(b)从培养物中分离出所述的蛋白。在本发明到另一方面，提供一种用于镇痛的药物组合物，所述的药物組合物含有(1)有效量的选自下组的物质所述的蛋白或δ阿片受体的抑制剂；和(2)药学上可接受的载体。在另ー优选例中，所述的药物組合物还含有(3)有效量的阿片鎮痛剤。在另ー优选例中，所述的阿片镇痛剂是吗啡。在本发明到另一方面，提供还提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的用于镇痛的药物组合物。在本发明到另一方面，提供ー种筛选增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质的方法，所述的方法包括(1)将候选物质与δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系接触；(2)检测候选物质对δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的影响；若所述候选物质可抑制(减弱、阻断或解离)δ阿片受体与μ阿片受体相互作用，则表明该候选物质是增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质。在另ー优选例中，在测试组中，将候选物质加入到δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中δ阿片受体与μ阿片受体相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系；如果测试组中δ阿片受体与μ阿片受体的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱干，如弱20%以上，较佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)对照組，就表明该候选物质是增强阿片镇痛剂的镇痛作用的的潜在物质。在另ー优选例中，所述的体系选自細胞体系(或細胞培养物体系)、亚细胞体系、 溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在另ー优选例中，所述方法还包括对获得的潜在物质进行进ー步的細胞实验和 /或动物试验，以从候选物质中进ー步选择和确定对于增强阿片镇痛剂的镇痛作用有用的物质。在本发明到另一方面，提供一种增强阿片镇痛剂的镇痛作用的方法，所述方法包括抑制对象中δ阿片受体与μ阿片受体的相互作用。在本发明到另一方面，提供一种镇痛的方法，所述方法包括先给予需要镇痛的对象有效量的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质；之后给予需要镇痛的对象有效量的阿片鎮痛剤。在本发明到另一方面，提供穿膜肽的用途，用于引导跨膜蛋白的跨膜区域(包括含该跨膜区域的跨膜蛋白或其片段)在細胞膜上以与野生型跨膜蛋白相同的方向插入。在另ー优选例中，所述的穿膜肽选自反式激活蛋白，Penetratin, polyarginine, MAP nJc TrEinsportEin0本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.受体特异性的激动剂诱导DOR和MOR的共同内呑。(A)将氨基端带有HA标签的MOR (HA-MOR)和氨基端带有Myc标签的DOR (Myc-DOR) 的质粒共转入HEK293細胞中。为了标记在細胞膜上的受体，先将培养的細胞在带有兔抗HA 抗体和小鼠抗Myc抗体的混合物中孵育半个小吋，在激动剂处理以后固定细胞进行免疫荧光双标(M0R为绿色，DOR为红色)。在对照组(control)的细胞质中，只能看到很少的囊泡状结构上有阳性标记，这些是进行持续内吞的受体。在ΙμΜ Delt I，SNC_80，Delt II或者 DAMGO的刺激下，本来位于細胞膜上在活细胞状态被标记的DOR和MOR内吞进入共存的囊泡状结构中(箭头所示)。根据内吞的受体信号和表面标记法标上的总受体信号之间的比值而做出的统计表明，由Delt I和DAMGO导致的DORs和MORs的共同内吞可以分别被5 μ M 的NTI，naloxone (NLX)或者CTOP所减弱(下图)。(B, C)将羧基端带有Flag标签的MOR(MOR-Flag)和Myc-DOR质粒共转入HEK293 細胞中，在Delt I处理后細胞膜表面的蛋白被生物素所标记，这些标记上的蛋白被固定在小珠上的StRptavidin所收集。在1 μ M Delt I或者SNC-80处理30分钟后，在細胞膜表面的DOR和MOR的水平显著下降。免疫印迹的实验表明，30分钟的Delt I处理只能提高 DOR的磷酸化水平，对MOR的磷酸化水平并没有影响。而DAMGO只能影响MOR的磷酸化。(D)在表达 MOR-Flag 和 DOR 突变体(Τ352Α, Τ353Α, Τ358Α, Τ361Α 和 S363A) [Myc-DOR(M)]的ΗΕΚ293细胞中，两种受体在細胞膜表面的表达在ΙμΜ Delt I和SNC-80 刺激下没有变化。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验，统计的数据均以对照组的百分数表示，**表示与不给予Delt I处理的細胞相比P < 0.01。图2.激动剂诱导的MOR和DOR内吞后分拣途径。(A，B)将HA-MOR和Myc-DOR共转入HEK293细胞中，用抗HA抗体和抗Myc抗体进行预标记，溶酶体结构使用LysoTracker进行标记(红色)。在90分钟的Delt I或者是 DAMGO的刺激下，固定细胞进行免疫荧光双标。在Delt I处理过的細胞中，内吞的DOR和 MOR共同进入LysoTracker标记的结构中(箭头所示)，而受到DAMGO刺激内吞的两类受体并不ネ皮LysoTracker Mホ示i己。ホ示/^为8 μ m。(C)将MOR-Flag和Myc-DOR共转入HEK293细胞中，免疫共沉淀的实验表明，Delt I的刺激可以增加DOR和MOR的泛素化水平，而DAMGO则降低。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验。(D)在药物处理之前表达DOR和MOR的HEK293细胞被生物素所标记，在经过90分钟ΙμΜ Delt I或者DAMGO的处理下，裂解細胞，被生物素标记的蛋白通过固定在小珠上的 streptavidin所收集。免疫印迹的实验表明，在DeltI刺激下被标记上的DOR和MOR数量显著降低。ΙΟΟμΜ的Leup印tin+MG132可以抑制这ー过程。统计的数据均以对照组的百分数表示，**表示与不给予Delt I处理的細胞相比P < 0.01。图3.在小鼠脊髄激活DOR可以下调MOR的水平并降低吗啡的镇痛作用。(A)双标的原位杂交表明，DOR和MOR的mRNA在小鼠DRG小神经元中共存(箭头)。 小箭头指向的是仅表达MOR的小神经元。标尺为8μπι。(B)使用DOR13—17的抗体在Oprdl第一外显子敲除的小鼠脊髄组织样品中检测不到免疫印迹的信号。(C)使用DOR抗体在野生型小鼠脊髄切片I和II层的神经纤维上检测到的免疫染色信号在Oprdl第一外显子基因敲除小鼠的切片中消失了，并且这一染色信号同时也可以被相应的抗原所吸收掉。(D)免疫荧光三标记的实验表明，MOR (红色)、DOR (绿色)和CGRP (蓝色)在脊髓背角的I和II层共存。高倍放大的图显示三者在神经纤维终末有共存。标尺为8μπι。￠)免疫共沉淀的实验表明，在鞘内注射2yg的Delt I 15分钟以后DOR和MOR 之间的相互作用显著增強。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验。(F)在免疫共沉淀实验中使用的DOR的抗体在Oprdl第一外显子敲除的小鼠脊髄组织样品中也检测不到免疫印迹的信号。(G)而使用5 μ g的Delt I或者是L-ENK和SNC-80刺激15分钟后，可以使脊髓背角的MOR泛素化水平显著提高。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验。(H)小鼠在鞘内注射(5x1 μ g，每15分钟1次)Delt I处理后，免疫荧光标记显示在小鼠脊髄I和II层MOR的染色明显降低。依据3只小鼠和每只小鼠3-5切片进行定量分析，**表示与给予盐水组的小鼠相比P < 0. 01。(I，J，K)小鼠52°C水浴甩尾实验显示，鞘内预先给予Delt I可以显著降低鞘内给予吗啡的镇痛作用，而且这ー效应具有剂量依赖性。DOR的拮抗剂NTI，可以阻止DOR激动 M Delt I对吗啡的镇痛作用降低的效用(J)。SNC-80也有和Delt I同样的效果(J)。** 表示与给予盐水组的小鼠相比P < 0. 01 (每组10只小鼠)。图4. MOR的第一个穿膜结构域介导了 MOR和DOR的相互作用。(A)图示各种MOR或变体的结构(其中灰色区段表示跨膜结构域)，包括野生型 MOR ；用MOR的第三个跨膜结构域取代第一跨膜结构域的MOR突变体[MOR(M)]；含TMl的 MOR 突变体[M0R (63-93)]。(B,C)免疫共沉淀实验显示，DOR可以和MOR上的第一个穿膜结构域相互作用，DOR 只与野生型的MOR存在相互作用，而与的突变体之间没有相互作用，MOR第一个跨膜结构域的过量表达可以显著降低DOR和MOR之间的相互作用。(D)在共转了 DOR和MOR突变体的细胞中，ΙμΜ Delt I可以减少DOR在細胞膜上的表达，而对MOR的突变体没有作用。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验。(E)在三转(同时转入HA-M0R，Myc-D0R，MOR(63-93))的细胞中，由激动剂刺激导致的DOR和MOR共同内吞可以被过量表达的MOR的第一个跨膜结构域所阻止。每组统计的细胞数为30个，**表示与不共转MOR第一个跨膜结构域的细胞相比P <0.01。标尺为4 μ m0(F)免疫组化实验，过量表达的MOR的第一个跨膜结构域可以干扰由Delt I或者使DAMGO引起的受体共内吞。图5.用TMl-TAT融合蛋白打断DOR和MOR之间的相互作用。(A)图示四种含有TMl和TM3的融合蛋白，TAT在TMl和TM3的氨基端或羧基端。培养的小鼠背根神经节神经元经过TAT融合蛋白的处理后，透膜后GST抗体标记细胞显示所有的TAT融合蛋白都主要位于细胞膜上，用非穿透膜方法GST的抗体标记的是暴露在细胞膜外的GST蛋白，表明只有TAT肽在跨膜段的羧基端的融合蛋白插入到神经元细胞膜上的方向与野生型MOR —致，而TAT肽在跨膜段的氨基端则插入的方向相反。标尺为8 μ m。anti-GST表示抗GST抗体。(B)小鼠在TMl-TAT蛋白处理2. 5个小时以后进行包埋前免疫金标-银加强标记。在光镜下，TMl-TAT蛋白主要分布在脊髓背角浅层的神经纤维终末中，而电镜图片显示TMl-TAT蛋白主要分布在脊髓突触球的神经纤维终末的膜上。箭头表示的是突触后区域。(C，D)免疫共沉淀的实验显示，在2. 5小时的TMl-TAT蛋白处理以后，DOR和MOR之间基础水平的相互作用显著降低，而由鞘内注射5yg Delt I使MOR的泛素化水平的增加也可恢复到基础水平。统计中加入了 α 2A-AR和NKl-R与MOR的免疫共沉淀信号，在MORTMl-TAT蛋白处理的情况下并不受影响这一结果。每个免疫印迹的结果代表三次独立的实验。图6.用TMl-TAT融合蛋白可以提高吗啡的镇痛效果。(A)小鼠52°C水浴甩尾实验显示，皮下注射吗啡的镇痛效果可以被腹腔注射TMl-TAT蛋白(在2. 5h/day内，10mg/kg/每次或者5mg/kg/每次，共注射三次)显著增强，而注射TAT-TMl和TM3-TAT则没有影响，这一效应也具有剂量依赖性。另外，鞘内注射DeltI 2. 5 μ g/kg的镇痛效果不能被腹腔注射TMl-TAT蛋白增强(B)。(C)在小鼠皮下注射5mg/kg的吗啡，在5天过后吗啡的镇痛效果完全消失，表明吗啡耐受效应的产生。而如果每天小鼠在注射吗啡前都先经过TMl-TAT的处理(在2. 5h/day内，10mg/kg/每次，共注射三次)，则吗啡的耐受情况会得到缓解。而同样条件下使用TM3-TAT对小鼠进行处理对吗啡的耐受效应没有影响。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，发现δ阿片受体(DOR)与μ阿片受体(MOR)之间的相互作用与MOR对于阿片镇痛剂的敏感性直接相关，阻断或弱化DOR与MOR的相互作用可增强阿片镇痛剂的镇痛作用。在此基础上本发明人还找到了可增强阿片镇痛剂的镇痛作用的试剂。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，术语“疼痛”或“痛”是指机体对损伤组织或潜在的损伤产生的一种不愉快的反应，是一种复杂的生理心理活动，也是临床上最常见的症状之一。疼痛可分为身源性(somatogenic)疼痛和心因性(psychogenic)疼痛。身源性疼痛又可分感受性疼痛(如伤害感受性疼痛，nociceptive pain)与神经病理性疼痛(Neuropathic Pain)。疼痛根据其发生和持续的时间和进程可分为急性疼痛和慢性疼痛，慢性疼痛也包括慢性感受性疼痛或慢性神经病理性疼痛。如本文所用，“神经病理性疼痛”是由于中枢或周围神经系统的损伤或病理改变引起，包括但不限于腰背痛(lower back pain)、神经痛(neuralgia)、纤维性肌痛(Fibromyalgia)、糖尿病相关的神经痛(diabetic neuropathic pain，DNP)、多发性硬化相关的神经痛(pain associated with multiple sclerosis)、带状疱疹后神经痛(PHN)和HIV有关联的(神经病理性)神经痛(HIVNP)等。如本文所用，“伤害感受器性疼痛”是由于人体内的伤害感受器受到机械、热、化学刺激或损伤引起，可分为躯体伤害感受器性疼痛和内脏伤害感受器性疼痛，包括但不限于(cancer-related pain) >(arthritic pain) > T^jp ^ (post-operativepain)和HIV有关联的(伤害感受器性)神经痛(HIVNP)等。其中，神经痛(neuralgia)包括但不限于三叉神经痛(Trigeminal neuralgia)、坐骨神经痛(sciatic neuralgia)等。疼痛根据其发生和持续的时间和进程可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛是一群随损伤或各种急症等明显刺激因素迅速发生的复杂而不愉快的感受、知觉和情感上的体验，伴有自主的、心理的和行为的反应，其包括手术后、创伤后疼痛、烧伤和各种内外科急症，例如心梗，急性胰腺炎，胆绞痛，肾绞痛，急性阑尾炎、病理性骨折，急性肠梗阻患者出现急性疼痛等。急性疼痛的治疗方法包括病房开展自控镇痛(PCA)，将局麻药和/或阿片类药于硬膜外腔输注等。在机理或动物试验中常采用甲醛法、热板法等模型或方法造成动物的急性疼痛，并立即给予待测药物，以观察待测药物对急性疼痛的缓解作用。慢性疼痛是是指疼痛持续较长时间(如超过数周 1个月)，超过一般急性病的进展，或者超过伤口愈合的合理时间，或与引起持续疼痛的慢性病理过程有关，或者经过数月或数年的间隔时间疼痛复发。在机理或动物试验中常采用完全弗氏佐剂等诱导造成动物的慢性疼痛，并在诱导数日乃至数周后给予待测药物，以观察待测药物对慢性疼痛的缓解作用。慢性疼痛的病程长、病因复杂；中枢和外周神经系统的不同结构和功能的异常；自主神经系统和情绪的变化；以及社会适应能力、生活或/和工作能力的降低；精神、家庭多方面的心理障碍的特点，决定了康复治疗手段对于慢性疼痛治疗的重要意义。慢性疼痛不缓解，会从心理上、生理上给患者造成不良影响；不能缓解的疼痛将延迟患者的恢复，延长住院日期，给患者和家属增加负担，加大医疗保险费用，使之丧失工作、家庭、尊严，引起抑郁、焦虑、自杀，使心理残废的群体扩大。不仅如此，还增加了社会的不安定因素。相比较而言，现在一般认为急性疼痛是疾病的一个症状，而慢性疼痛是一类疾病。
慢性疼痛包括但不限于①软组织、关节和骨疼痛各种骨关节炎、创伤后畸形性疼痛、骨骼肌疼痛、腰痛、肌筋膜疼痛综合征、头痛、烧伤后疼痛。②深部组织和内脏痛心血管疼痛、眼痛、口面部疼痛、慢性妇科疼痛、性交痛、泌尿生殖系统慢性疼痛。③神经和神经根损伤性疼痛截肢后幻肢痛、周围神经性疼痛、反射性交感神经营养不良和交感神经持续痛、三叉神经痛和非典型性面部痛、神经根损伤和蛛网膜炎、带状疱疹后神经痛。④中枢性疼痛脑、脊髓的血管损伤，如出血、梗塞、血管畸形；多发性硬化；外伤性脊髓损伤，脑损伤；脊髓空洞症和延髓空洞症；肿瘤；帕金森病。⑤儿童疼痛生长痛。⑥老年人疼痛各种颈椎病、腰椎间盘突出症、腰椎滑脱等所致疼痛。⑦癌性疼痛。本发明中所述的“痛”包括但不限于头痛，面部痛，颈痛，肩痛，背痛，胸痛，腹痛，背部痛，腰痛，下肢痛，肌肉与骨骼疼痛，躯体疼痛，血管疼痛，痛风，关节炎疼痛，与躯体病样精神障碍有关的疼痛，内脏疼痛，感染性疾病(如AIDS和带状疱疹后神经痛)导致的疼痛，多骨疼痛，镰刀细胞贫血、自身免疫性疾病、多发性硬化或炎症有关的疼痛，急慢性炎症疼痛，癌性疼痛，神经病性疼痛，损伤或手术引起的疼痛，癌性痛，伤害感受性疼痛，糖尿病、外周神经病、疤疹后神经痛，三叉神经痛，腰部或子宫颈神经根病，舌咽神经痛，自主神经反射性疼痛，反射性交感神经营养不良、神经根撕脱、癌症、化学损伤、毒素、营养缺乏、病毒或细菌感染、烧伤或其联合形式有关导致的神经病理性疼痛，老龄化导致的退行性骨关节病，或它们的联合形式。DOR、MOR 及其片段DOR和MOR是本领域技术人员熟知的，它们都属于G蛋白偶联受体超家族的成员，在疼痛的调控中起作用。其中，MOR是阿片镇痛剂(如吗啡)的主要药物靶点。一般地，人的DOR蛋白具有SEQ ID N0:2所示的序列或参见GenBank登录号AAA18789. 2所示的序列，其编码序列参见GenBank登录号NM_000911. 3所示的序列。一般地，人的MOR蛋白具有SEQ ID NO :1所示的序列或参见GenBank登录号AAH74927. 1所示的序列，其编码序列参见GenBank登录号AY521(^8. 1所示的序列。DOR或MOR的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的变异形式也包括在本发明中。其变异形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。本发明还提供一种来源于MOR的生物活性片段，其是MOR的第一跨膜结构域蛋白片段(M0R TMl)。本发明人的研究发现，激活DOR能够使D0R-M0R复合体中的MOR与DOR —起进入到内吞后降解途径，从而导致了 MOR相对于其激动剂如吗啡的脱敏作用。这些过程依赖于MOR通过其第一个穿膜结构域与DOR的相互作用。表达的MOR TMl蛋白片段能够竞争性地减弱DOR与MOR的相互作用。因此，所述的MOR TMl蛋白片段可通过减弱DOR与MOR的相互作用而促进阿片镇痛剂如吗啡的镇痛效果。所述的MOR的第一跨膜结构域蛋白片段的序列如SEQ ID NO 3所示。此外，本发明还涉及来源于MOR蛋白的、具有SEQ ID NO :3所示序列的蛋白片段。也即包含有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列且一端或两端还带有其它氨基酸的MOR蛋白片段也是可用的，只要其也具有竞争性结合DOR的功能。MOR TMl的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的变异形式也包括在本发明中。其变异形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson ^ MolecularBiology of The Gene，第四片反，1987，The Beniamin/Cummings Pub.Co. P2240一旦分离获得了所述MOR TMl蛋白或其变异体的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，对于较短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。本发明还包括了编码所述的MOR TMl蛋白或其变异体的分离的核酸，其可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的核酸序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白。本发明还包括了包含编码所述MOR TMl蛋白或其变异体的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。此外，含有编码所述MOR TMl蛋白或其变异体核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。融合蛋白本发明还提供了一种融合蛋白，其从氨基端到羧基端依次包括M0R TMl和穿膜肽。如本文所用，所述的“穿膜肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。作为本发明的优选方式，所述的穿膜肽是反式激活蛋白(Transactivator，TAT)。本发明人发现，TAT蛋白融合TMl后，能够使外源多肽TMl选择性地插入到细胞膜上，在体注射此融合蛋白能够竞争性地抑制脊髓中MOR-DOR的相互作用，从而增强吗啡的镇痛效果。作为本发明的优选方式，所述的TAT的氨基酸序列可以与SEQ ID N0:4中第50_60位所示的序列基本上相同。所述的MOR TMl和穿膜肽之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。连接子本身并不拥有连接以外以的其他功能，因此所属技术领域人员了解可能的氨基酸组成。所述的连接子包括0-20个氨基酸；较佳地为0-15个氨基酸；如10个。所述的连接肽例如是由10个Gly组成。在体注射MOR TMl和TAT的融合蛋白能够被运输到小鼠脊髓背角痛觉传入的末端，阻断DOR-MOR的相互作用，从而促进吗啡镇痛效果。本发明还发现当TAT融合在TMl和TM3的羧基端时，免疫标记试验显示TMl和TM3能于细胞膜上类似于野生型那样的插入，并不会导致这些跨膜蛋白的入胞行为，因此，TAT肽不仅可以作为一个穿膜的载体，而且由于疏水性的跨膜段的存在这一肽段还可以引导跨膜蛋白在细胞膜上的插入方向。所属技术领域人员应该了解，为方便组化的检测，本发明的实施例中融合蛋白TMl-TAT添加了标记蛋白flag，对于执行TMl的功能并不是必需的，所述的标记蛋白flag可以省略或者换成其他的标记，比如Myc、HA等。DOR的抑制剂本发明人发现，DOR的抑制剂可以通过抑制DOR的活性，从而抑制DOR与MOR的相互作用。因此，DOR的抑制剂也可以用于促进阿片镇痛剂的镇痛作用。如本文所用，所述的DOR的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低DOR的活性、降低DOR的稳定性、抑制DOR的表达、减少DOR有效作用时间、或抑制DOR的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进阿片镇痛剂的镇痛作用的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的DOR的抑制剂是(但不限于)maltrindole、ICI174，864，TIPP，Naltriben0药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0. 000001-50wt% ；较佳的0. 00001-20wt% ；更佳的，0.0001-10wt% )的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质，以及药学上可接受的载体。所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质是M0R TMl或其变异体；或MOR TMl与穿膜肽的融合蛋白；或DOR的抑制剂。作为本发明的优选方式，所述的药物组合物还含有有效量(如0. 000001-50wt%；较佳的0.00001-20Wt% ；更佳的，0. OOOl-IOwt % )的阿片镇痛剂。优选地指作用在Mu阿片受体上的镇痛药，如阿片生物碱类(吗啡、可待因)和人工合成品(哌替啶、丁丙诺啡、埃托啡、芬太尼、美沙酮、二氢埃托啡等)。其它一些Mu阿片受体可参见Clin DrugInvestig. 2009；29 Suppl 1 :3-16. Pain treatment with opioids :achieving theminimal effective and the minimal interacting dose. Geppetti P, Benemei S 等文献，这些文献引入本发明，以提供可供选择的Mu阿片受体。更优选地，所述的阿片镇痛剂是吗啡。本发明的药物组合物可直接用于哺乳动物机体的镇痛。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的抑制S阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。筛选方法在得知了所述的DOR与MOR相互作用与MOR对于阿片镇痛剂的敏感性直接相关后，可以基于该机制来筛选抑制DOR与MOR相互作用的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于调增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质的方法，所述的方法包括将候选物质与DOR与MOR相互作用的体系接触；和检测候选物质对DOR与MOR相互作用的影响；若所述候选物质可抑制(包括减弱、阻断或解离)D0R与MOR相互作用，则表明该候选物质是可用于增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到DOR与MOR相互作用的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的DOR与MOR相互作用的体系。所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于增强阿片镇痛剂的镇痛作用真正有用的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于增强阿片镇痛剂的镇痛作用真正有用的物质。本发明的主要优点在于(1)本发明清楚地确立了 DOR激动剂诱导的DOR和MOR共同内吞和共降解是造成MOR脱敏的原因之一，从而提供了一种通过抑制M0R-D0R物理上的相互作用来增强吗啡镇痛效果的新策略。(2)本发明找到了可用于抑制M0R-D0R相互作用的物质，可作为镇痛药物用于临床。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按
重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法表达带有HA标签的MOR(HA-MOR)的质粒参见GuanJS, Xu ZZ, Gao H, He SQ,Ma GQ,Sun T,Wang LH,Zhang ZN,Lena I,Kitchen I,et al Interactionwith Vesicle LuminalProtachykinin Regulates Surface Expression of deIta-OpioidReceptors and OpioidAnalgesia. Cell 2005,122:619-631。表达带有Myc 标签的 DOR(Myc-DOR)的质粒参见 Bao L，Jin SX，ZhangC，Wang LH,Xu ZZ,Zhang FX,Wang LC,Ning FS,Cai HJ,Guan JS,et al :Activation of delta opioidreceptors induces receptor insertion and neuropeptidesecretion. Neuron 2003,37:121-133。表达带有Myc标签的DOR突变体[Myc-DOR(M)]的质粒参见Whistler，J. L.，Tsao, P. , and von Zastrow, Μ. (2001). A phosphoryIation-regulated brakemechanismcontrols the initial endocytosis of opioid receptors but is not requiredforpost-endocytic sorting to lysosomes. J Biol Chem 276,34331-34338。表达带有Flag标签的MOR(MOR-Flag)的质粒的构建以HA-M0R质粒为模板，以表1中M0R2引物进行PCR扩增，获得的扩增产物经HindIII和KpnI酶切后插入到PEGFP-N3 (Clontech)载体中的相应位点中，获得表达带有Flag标签的MOR的质粒。表达带有Flag标签的MOR突变体[MOR(M)]的质粒的构建以HA-MOR质粒为模板，先使用TMl(第一次循环)以及TM3(第一次循环)引物(见表1)进行PCR扩增，再提纯的将扩增产物使用TMl和TM3 (第二次循环)引物分别进行PCR反应，再将产物回收提纯经 HindIII 和 KpnI 酶切，连接入 pEGFP_N3 (Clontecti)载体中。表达带有GFP标志、α -CGRP (1-25) -MOR突变体[M0R (63-9 ]的质粒的构建将α -CGRP1—25寡核苷酸复性，然后连接入经EcoRI，BamHI酶切过的pEGFP_N3载体中。表达MOR TMl-TAT (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建先将TMl寡核苷酸复性，连接入经EcoRI和SalI酶切过的pGEX-KG(GE Healthcare LifeSciences)中，再将复性的编码C端带有10个Gly的TAT肽的寡核苷酸连接入经过MlI和HindIII酶切过的前述质粒中。表达后可以获得如下融合蛋白DYKDDDDKPSMVTAITIMALYSIVCWGLFGNFLVMYVIGGGGGGGGGGYGRKKRRQRRR(其中，TAT肽段位于TMl的羧基末端，在TMl之前带有FLAG标记，在MOR的第一跨膜和TAT肽段之间加入了 10个甘氨酸)。表达TAT-MOR TMl (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建先将TMl寡核苷酸复性，连接入经EcoRI和SalI酶切过的pGEX-KG(GE Healthcare LifeSciences)中，再将复性编码的C端带有10个Gly的TAT肽的寡核苷酸连接入经过BamHI和HindIII酶切过的刚才构建好的质粒中。表达MOR TM3-TAT (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建和M0RTM1-TAT (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建类似，只是将TMl寡核苷酸换成TM3寡核苷酸。
表达TAT-MOR TM3 (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建和TAT-M0RTM1 (带有GST、FLAG标签)的质粒的构建类似，只是将TMl寡核苷酸换成TM3寡核苷酸。表1、质粒构建所用的引物和寡核苷酸
权利要求
1.抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质的用途，用于制备增强阿片镇痛剂的镇痛作用的制剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在干，所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的物质选自δ阿片受体的抑制剂；μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白；或羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在干，所述的δ阿片受体的抑制剂选自 naltrindole、ICI 174，864，TIPP，Naltriben0
4.如权利要求1所述的用途，其特征在干，所述的阿片镇痛剂是作用在Mu阿片受体上的镇痛药。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在干，所述的阿片镇痛剂是吗啡。
6.抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的蛋白，所述的蛋白是 μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白；或羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白。
7.如权利要求6所述的蛋白，其特征在干，所述的羧基端连接有穿膜肽的μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白是ー融合蛋白，其氨基端为μ阿片受体的第一跨膜结构域蛋白，羧基端为穿膜肽。
8.如权利要求6所述的蛋白，其特征在干，所述的穿膜肽是反式激活蛋白， Penetratin, polyarginine, MAP ^ci Transportan0
9.如权利要求8所述的蛋白，其特征在干，所述的蛋白为 氨基酸序列如SEQ ID NO :4中第9-39位连接50-60位所示的蛋白； 氨基酸序列如SEQ ID NO :4中第9-60位所示的蛋白；或氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的蛋白。
10.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求6-9任一所述的抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的蛋白。
11.权利要求10所述的多核苷酸的用途，用于制备增强阿片镇痛剂的镇痛作用的制剂。
12.—种质粒载体，它含有权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.—种遗传工程化的宿主細胞，它含有权利要求12所述的载体；或其基因组中整合有权利要求10或11所述的多核苷酸。
14.一种用于镇痛的药物组合物，其特征在干，所述的药物組合物含有(1)选自下组的物质权利要求6-9任一所述的蛋白或δ阿片受体的抑制剂；和(2)药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物組合物，其特征在干，所述的药物組合物还含有(3)阿片鎮痛剤。
16.ー种筛选增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质的方法，其特征在干，所述的方法包括(1)将候选物质与s阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系接触；(2)检测候选物质对δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的影响；若所述候选物质可抑制δ阿片受体与μ阿片受体相互作用，则表明该候选物质是增强阿片镇痛剂的镇痛作用的潜在物质。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在干，在测试组中，将候选物质加入到δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中δ阿片受体与μ阿片受体相互作用情況，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的δ阿片受体与μ阿片受体相互作用的体系；如果测试组中δ阿片受体与μ阿片受体的相互作用在统计学上弱于对照組，就表明该候选物质是增强阿片镇痛剂的镇痛作用的的潜在物质。
18.穿膜肽的用途，用于引导跨膜蛋白的跨膜区域在細胞膜上以与野生型跨膜蛋白相同的方向插入。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在干，所述的穿膜肽选自反式激活蛋白， Penetratin, polvarginine, MAP ^ci TransDortan0
全文摘要
本发明涉及增强阿片镇痛剂的镇痛作用的方法及试剂。公开了抑制δ阿片受体(DOR)与μ阿片受体(MOR)相互作用的物质的用途，用于制备增强阿片镇痛剂的镇痛作用的制剂。还公开了用于增强阿片镇痛剂的镇痛作用的蛋白以及药物组合物。
文档编号C12Q1/68GK102580091SQ201110004969
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者何绍球, 张振宁, 张旭, 管吉松, 鲍岚 申请人:中国科学院上海生命科学研究院