专利名称：葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法。
背景技术：
苷类亦称为苷或配糖体，是糖或糖的衍生物与另一非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的化合物，水解后能生成非糖化合物，非糖部分称为苷元或配基。葡萄糖苷为苷类的一种，广泛分布于植物的根、茎、叶、花和果实中，能溶于水，且具有阴离子和非离子表面活性剂的特性，广泛应用于日用化工、生物化工、医药等众多领域。红景天是蔷薇目景天科 (Crassulaceae)红景天属ahodiola)植物的根或根茎。红景天是一种药食兼用植物，其性平，味甘，苦。具有抗缺氧、抗疲劳、保护神经细胞、抗衰老、抗心律失常、调节免疫功能、镇静、抗癌等药理作用。其主要成分有红景天苷、对羟基苯乙醇、酪萨维、黄酮类、皂苷类、香豆素类等，其中红景天苷是红景天主要有效成分，也是评价红景天及其提取物的重要指标。目前，红景天苷主要通过提取法、化学合成法、植物细胞培养和酶合成法等技术获得，这些技术存在各自不同的优缺点。红景天是提取红景天苷的主要植物，但是红景天是高寒地带植物，野生资源匮乏，且人工栽培技术尚不成熟，因此难以保证红景天原料的大量供应。又因红景天苷的提取工艺复杂，虽然经过不少研究人员的不断完善，但是红景天苷的产量较低，仍然满足不了市场的需求。1969年俄国化学家Troshchenko等首先采用化学合成法获得红景天苷，后来我国学者纪淑芳、李国青、廖宇等也通过化学合成法合成了红景天苷，但是由于化学合成过程需要经过多步的保护和去保护措施，过程复杂且成本高，副产物较多且难于分离，对环境危害较大，因此至今未投入生产。用于红景天苷合成的酶主要有糖基转移酶、糖苷酶及其定向进化的糖苷合成酶。UDP-葡萄糖基转移酶的糖基供体UDP-糖苷价格昂贵，且对糖基受体具有高度的专一性，使得合成缺乏灵活性；而糖苷酶催化葡萄糖和对羟基苯乙醇直接糖苷化合成红景天苷属于逆水解反应，该反应受热力学控制，朝平衡方向进行，受平衡限制，最终产率低。综上所述，目前葡萄糖苷的合成有的过程复杂，生产成本高，产量太低，无法在工业上推广应用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，将肠膜明串株菌葡萄糖糖基转移酶、蔗糖和醇在含有缓冲溶液的水中反应，分离、收集得到红景天苷或类似物产品。所述的醇为对羟基苯乙醇、对苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、苯乙醇或叶醇中的任意一种。优选为对羟基苯乙醇。
所述蔗糖浓度为0. Γ0. 7mol/L,优选为0. 2 0. 4moL/L ；醇浓度为0. 3 0. 9mol/L, 优选为0. 7 0. 8mol/L ；所述缓冲液为pH5. 2醋酸缓冲液，缓冲液浓度为20mmoL/L ；反应温度为2(T70°C，优选为35 45°C ；反应时间为20 30h。产物分离纯化采用常规的分离方法，旋转蒸发浓缩反应液，大孔树脂柱层析和硅胶柱层析等，即可从反应液中收集到本发明所提到的各类葡萄糖苷。本发明采用的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶由肠膜明串株菌接种到培养基中诱导产酶，离心除去菌体，发酵液上清经硫酸铵沉淀、膜透析得糖苷转移酶液。将浓缩后的酶液与蔗糖和醇的混合液在一定条件下进行酶促反应。上面所述的肠膜明串株菌购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。上面所述的培养基种子培养基MRS培养基蛋白胨IOg ；牛肉膏IOg ；酵母粉5g ； 葡萄糖20g ；吐温801mL ；氯化钙2g ；乙酸钠5g ；柠檬酸铵2g ；磷酸氢二钾2g ；MgS04 7H20 0. 5g ；MnS04 H200. 05g ；蒸馏水 lOOOmL，pH 值 6. 2 6. 4 ； 121 °C 灭菌 20min。发酵培养基蔗糖5g ；蛋白胨0. 17g ；磷酸氢二钠0. 15g ；蒸馏水IOOmL ；pH值8. 0 ； 本发明利用具有较强的葡萄糖糖基转移能力的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶(右旋糖
酐蔗糖酶)，在水相中高效催化合成红景天苷，此外，还可以合成一系列红景天苷类似物。利用该酶催化合成糖苷类化合物不仅避免繁琐的反应步骤，而且反应条件温和、反应时间短、 底物选择性高，具有广阔的发展空间。本发明与现有技术相比，所具有的优点为如下，本发明所公开的酶催化反应工艺是在水相中完成的，操作方便简单，产量较高，产品易于分离纯化，环境污染小，生产成本较低，经纯化后得到的葡萄糖苷纯度较高，该工艺的工业应用潜力巨大，可以满足医药，香料
等产业的需要。
具体实施例方式实施例1
(1)肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶的提取
将肠膜明串株菌接入新鲜斜面培养基中，培养4(T48 h。斜面活化后菌种接种于种子培养基中，28°C，150 rpm，振荡培养Id。将培养好的种子液接至发酵培养基中，接种量10 %, 28 °C, 150 rpm，振荡培养4 5d。收集发酵液(4°C，6000r/min，15min)离心，去除细胞，发酵液上清采用饱和硫酸铵盐沉淀、膜透析等步骤进行浓缩，浓缩后的酶液置于4°C冰箱冷藏(2)红景天苷的合成
分别称取蔗糖0. 5g，对羟基苯乙醇0. 5g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)， 再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197U/mL),在40°C，150r/min条件下反应30h。反应液经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测。美国Waters高效液相色谱系统；Hyperil 0DS2 色谱柱(4. 6mm*200mm, 5 μ m) ；Waters 1525 型紫外检测器；Waters 2487 型高压恒流泵；检测波长^Onm ；流动相乙腈水=1:9 ；进样量5μ L ；流速lmL/min。经高效液相色谱检测，反应液中对羟基苯乙醇基葡萄糖苷为12. 048g/L。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将对羟基苯乙醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去对羟基苯乙醇，再用乙酸乙酯甲醇=9:1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得对羟基苯乙醇基葡萄糖苷，然后称其干重为55mg， 相对蔗糖转化率为12. 54%.实施例2
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 17g，对羟基苯乙醇0. 207g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L， ρΗ5· 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197IU/mL)，在20°C，150r/min条件下反应28h0反应液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测。美国Waters高效液相色谱系统； Hyperil 0DS2 色谱柱(4. 6mm*200mm，5 μ m);Waters 1525 型紫外检测器；Waters 2487 型高压恒流泵；检测波长280nm ；流动相乙腈水=1:9 ；进样量5 μ L ；流速lmL/min。经高效液相色谱检测，反应液中对羟基苯乙醇基葡萄糖苷为11.06 g/L。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将对羟基苯乙醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去对羟基苯乙醇，再用乙酸乙酯甲醇=9:1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得对羟基苯乙醇基葡萄糖苷，然后称其干重为5;3mg， 相对蔗糖转化率为11. 24%.实施例3
分别称取蔗糖1. 197g，对羟基苯乙醇0. 62g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L, ρΗ5· 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197IU/mL)，在70°C，150r/min条件下反应20h。反应液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测。美国Waters高效液相色谱系统； Hyperil 0DS2 色谱柱(4. 6mm*200mm，5 μ m);Waters 1525 型紫外检测器；Waters 2487 型高压恒流泵；检测波长^Onm ；流动相乙腈水=1:9 ；进样量5μ L ；流速lmL/min。经高效液相色谱检测，反应液中对羟基苯乙醇基葡萄糖苷为13.05 g/L。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将对羟基苯乙醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去对羟基苯乙醇，再用乙酸乙酯甲醇=9:1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得对羟基苯乙醇基葡萄糖苷，然后称其干重为57mg， 相对蔗糖转化率为13. 78%。实施例4
分别称取蔗糖0. 342g，对羟基苯乙醇0. 48g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L, ρΗ5· 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197IU/mL)，在45°C，150r/min条件下反应25h。反应液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测。美国Waters高效液相色谱系统； Hyperil 0DS2 色谱柱(4. 6mm*200mm，5 μ m);Waters 1525 型紫外检测器；Waters 2487 型高压恒流泵；检测波长^Onm ；流动相乙腈水=1:9 ；进样量5 μ L ；流速lmL/min。经高效液相色谱检测，反应液中对羟基苯乙醇基葡萄糖苷为14.03 g/L。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱
5层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将对羟基苯乙醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去对羟基苯乙醇，再用乙酸乙酯甲醇=9:1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得对羟基苯乙醇基葡萄糖苷，然后称其干重为58 mg, 相对蔗糖转化率为14. 24%.实施例5
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 5g，对苯二酚0. 5g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197U/mL)，在35°C，150r/min条件下反应30h。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将对苯二酚基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去对苯二酚，再用乙酸乙酯甲醇=9 :1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得对苯二酚基葡萄糖苷，然后称其干重为60mg，相对蔗糖转化率为13. 68%。实施例6
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 5g，邻苯二酚0. 5g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197U/mL)，在40°C，150r/min条件下反应30h。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将邻苯二酚基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去邻苯二酚，再用乙酸乙酯甲醇=9 :1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得邻苯二酚基葡萄糖苷，然后称其干重为62. 1 mg，相对蔗糖转化率为14. 16%。实施例7
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 5g，邻苯三酚0. 5g溶解于3mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)，再加入2mL糖苷转移酶液(0. 1197U/mL)，在40°C，150r/min条件下反应30h。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将邻苯三酚基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去邻苯三酚，再用乙酸乙酯甲醇=9 :1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干得邻苯三酚基葡萄糖苷混合物，然后称其干重为57. ang，产率为13. 04%。实施例8
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 5g溶解于2. 73mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)，依次加入苯乙醇0. 45mL和1. 82mL糖苷转移酶液(0. 1197U/mL)，在40°C，150r/min条件下反应30h。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将苯乙醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去苯乙醇，再用乙酸乙酯甲醇=9 :1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、 抽滤至干得苯乙醇基葡萄糖苷，然后称其重量为36. 3 mg，相对蔗糖转化率为8. 28%。实施例9
采用实施例中得到的肠膜明串株菌葡萄糖基转移酶。分别称取蔗糖0. 5g溶解于2. 73mL醋酸缓冲液(20mmol/L，pH5. 2)，依次加入叶醇0. 45mL和1. 82mL糖苷转移酶液(0. 1197/mL)，在40°C，150r/min条件下反应30h。反应结束后，反应液旋转蒸发去除部分水，浓缩到一定体积，然后加入大孔树脂柱层析柱中，先用蒸馏水洗脱除去糖，酶蛋白等杂质，然后用25%乙醇溶液洗脱，将叶醇基葡萄糖苷洗脱下来。回收含糖苷的醇液再经旋转蒸发浓缩，浓缩液加入硅胶层析柱中，先用纯的乙酸乙酯洗脱除去叶醇，再用乙酸乙酯甲醇=9 :1洗下葡萄糖苷，回收含糖苷的洗脱液，经浓缩、抽滤至干，得到叶醇基葡萄糖苷，然后称其重量为24. 8mg，相对蔗糖转化率为5. 65%。
权利要求
1.一种葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，其特征在于将肠膜明串株菌葡萄糖糖基转移酶、蔗糖和醇在含有缓冲溶液的水中反应，分离、收集得到红景天苷或类似物产品。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，其特征在于所述的醇为对羟基苯乙醇、对苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、苯乙醇或叶醇中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，其特征在于所述的醇为对羟基苯乙醇。
4.根据权利要求1或2所述的葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，其特征在于所述蔗糖浓度为0. Γ0. 7mol/L ；醇浓度为0. 3^0. 9mol/L ；所述缓冲液为 PH5. 2醋酸缓冲液，缓冲液浓度为20mmoL/L ；反应温度为2(T70°C ；反应时间为2(T30h。
5.根据权利要求3所述的葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，其特征在于所述的蔗糖浓度为0. 2 0. 4moL/L ；醇浓度为0. 7 0. 8moL/L ；反应温度为35、5°C。
全文摘要
本发明公开一种葡萄糖糖基转移酶催化合成红景天苷或类似物的方法，将肠膜明串株菌葡萄糖糖基转移酶、蔗糖和醇在含有缓冲溶液的水中反应，分离、收集得到红景天苷或类似物产品。本发明所公开的酶催化反应工艺是在水相中完成的，操作方便简单，产量较高，产品易于分离纯化，环境污染小，生产成本较低，经纯化后得到的葡萄糖苷纯度较高，该工艺的工业应用潜力巨大，可以满足医药，香料等产业的需要。
文档编号C12P19/44GK102174619SQ201110005088
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者杨雪鹏, 樊攀, 毛多斌, 魏东芝 申请人:郑州轻工业学院