专利名称：一种利用ldr技术检测山羊多胎分子标记的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，属于分子遗传学领域。
背景技术：
多胎性能是畜牧生产的一个重要经济性状，大部分绵羊和山羊是单胎，但有些品种是双胎，甚至是一胎3羔或4羔，通过育种的方法可以提高一些品种的产仔数。繁殖率的遗传力较低，通过传统的育种方法，遗传进展较慢。随着分子遗传学的发展，利用分子标记辅助选择(molecular marker-as-sisted selection,MAS)育种技术可以快速提高一些单胎品种的双胎率，或者提高其胎产仔数，从而大幅度提高其繁殖力。MAS是通过分子生物学技术直接分析DNA分子的一些突变位点，可以准确判断基因型，而且不受时间的限制，可以做到早期选择。BMP 15是一种在卵巢表达的卵母细胞生长因子，在正常情况下主要和卵巢自身产生的GDF9协调作用于卵泡，以自分泌或旁分泌方式影响优势卵泡的发育和卵母细胞的生长。在某些物种的垂体和睾丸中也发现BMP15少量mRNA的表达，表明其在调节哺乳动物生殖方面可能起着多重的调节作用。将BMP15基因做为多胎性状主效候选基因研究其与山羊产仔数的关系对山羊的育种有重大的意义。目前检测DNA突变位点的方法一般常用限制性片段长度多态性(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)技术禾口单链构象多态性(Single-StrandCon-format ionalPolymorphism,SSCP)技术，这两种方法依靠肉眼进行结果的观察，有时会出现判断错误，从而影响检测结果的可靠性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，是利用LDR技术检测山羊BMP15基因GenBank :EU743938中的自5 ‘端第6353处(编码序列第901处)脱氧核糖核酸是A还是G，确定鲁北白山羊的基因型，根据基因型可以判断其产仔性能。本发明是通过以下技术方案实现的一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，步骤如下(1)扩增用于LDR反应包含A901G位点的片段以山羊基因组DNA为模板，在 TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNIPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为449bp，用于LDR反应；所述引物的序列如下(根据GenBank :EU743938序列设计的，包含A901G位点)上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；(2)进行LDR反应设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端带有FAM修饰(蓝色荧光)，5’端磷酸化，以便与其它两条特异性探针连接；探针A901G_A的3’末端碱基与A对应，探针A901G_G的3’末端碱基与G对应；(3)分析LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，结果如下基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的 LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合。所述步骤(1)中PCR扩增的条件和参数为PCR 反应采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因组 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去离子水。PCR 程序为95°C变性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 个循环，最后 72°C延伸 7min。反应结束后，取2μ 1反应产物在3.0%琼脂糖凝胶，0.5XTBE中电泳，得到一条清晰的449bp的DNA条带。所述步骤O)中LDR反应的具体步骤为在200μ 1 的 PCR 反应管中，分别加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1连接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去离子水，最后加入1 μ 1 PCR反应产物。连接反应程序为95°C变性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35个循环。LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度判断各基因型。上述分析后，可根据基因判断产仔性能BMP15基因A901G突变位点的基因型对对鲁北白山羊产羔数有显著影响(P <0.05)，各基因型效应值依次为GGQ. 5621) > AG(2. 5350) > AA(2. 2257), GG型的产羔数比AA型多0. 33只，AG型比AA型多0. 31只， BMP15基因A901G突变位点可以做为鲁北白山羊的多胎分子标记。本发明的利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。结果分析直接由软件分析，客观性强，避免用肉眼判断电泳图的主观误差及酶切不完全造成的判断错误。与其他SNP检测技术相比，LDR检测技术拥有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。
图1 :BMP15基因用于LDR分析的PCR扩增产物的电泳图。图 2 :BMP15 基因 A901G 位点 LDR 图谱。图3 山羊BMP 15突变位点。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1利用LDR技术检测山羊多胎分子标记对鲁北白山羊进行检测，步骤如下(1)扩增用于LDR反应包含A901G位点的片段以山羊基因组DNA为模板，在 TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNIPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为449bp，与目的片段完全一致，如图1所示，用于LDR反应；所述引物的序列如下(根据GenBank :EU743938序列设计的，包含A901G位点)上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；PCR扩增的条件和参数为PCR 反应采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因组 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去离子水。PCR 程序为95°C变性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 个循环，最后 72°C延伸 7min。反应结束后，取2μ 1反应产物在3.0%琼脂糖凝胶，0.5XTBE中电泳，得到一条清晰的449bp的DNA条带，凝胶电泳结果如图1。(2)进行LDR反应设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端带有FAM修饰(蓝色荧光)，5’端磷酸化，以便与其它两条特异性探针连接；探针A901G_A的3’末端碱基与A对应，探针A901G_G的3’末端碱基与G对应；LDR反应的具体步骤为在200μ 1 的 PCR 反应管中，分别加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1连接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去离子水，最后加入1 μ 1 PCR反应产物。连接反应程序为95°C变性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35个循环。(3)分析LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，关联如下基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的 LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合，如图2 所示。(4)测序结果测序结果显示BMP15基因GenBank :EU743938序列第6353bp (编码序列第901bp)发生了 A-G突变，如图3所示。
权利要求
1.一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，其特征在于，步骤如下(1)扩增用于LDR反应包含A901G位点的片段以山羊基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNIPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为 449bp，用于LDR反应；所述引物的序列如下 上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA ； 下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT ；(2)进行LDR反应设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下 A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ； A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ； A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ； 其中，A901G_M0DIFY的末端带有FAM修饰，5，端磷酸化；(3)分析LDR反应产物由ABIPRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，关联如下基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合。
2.根据权利要求1所述的一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，其特征在于所述步骤(1)中PCR扩增的条件和参数为PCR反应采用20 μ IQiagen体系，包括 2. 0 μ lPCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM), 2. 0 μ 1 dNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶 (5U/y 1)，4·0μ lQ-solution (4Χ) ,0. 4μ 1 primer (5ρΜ), 1. 0μ 1 基因组 DNA (50ng/L)，最后加入9. 8μ 1去离子水；PCR 程序为95°C 变性 15min，94°C 30s，59°C lm, 72 °C lm，；35 个循环，最后 72 °C 延伸 7min ；反应结束后，取2 μ 1反应产物在3. 0%琼脂糖凝胶，0. 5 X TBE中电泳，得到一条清晰的 449bp的DNA条带。
3.根据权利要求1所述的一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，其特征在于所述步骤⑵中LDR反应的具体步骤为在200 μ 1的PCR反应管中，分别加入 1 μ Ibuffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix (各 Probe 等比混合)，0· 05 μ 1 连接酶 0OU/μ 1)， 6. 95 μ 1去离子水，最后加入1μ 1 PCR反应产物。连接反应程序为95°C变性an，94°C30s， 60°C 2min,35 个循环；LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度判断各基因型。
全文摘要
本发明公开了一种利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，步骤如下(1)扩增用于LDR反应包含A901G位点的片段以山羊基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，用于LDR反应；(2)进行LDR反应设计三条探针，然后进行LDR反应；(3)分析LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析。本发明的利用LDR技术检测山羊多胎分子标记的方法，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性。与其他SNP检测技术相比，LDR检测技术拥有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。
文档编号C12Q1/68GK102174656SQ20111005536
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者刘学俊, 李淑青, 王会珍, 董传河 申请人:山东省农业管理干部学院