专利名称：用于艾滋病基因治疗的携带多靶点RNAi的慢病毒制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及ー种携带与HIV病毒生活周期相关基因的多靶点RNAi的慢病毒及其制备方法和应用。
背景技术：
艾滋病(acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆传录病毒疗法(Highly activeantiretroviral therapy, HAART),由于它能有效减少病毒载量(virus load)和保护免疫功能，从而相应地延长了 HIV感染者的存活时间。然而，该疗法只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，而且抗HIV药物价格昂贵，具有较严重的副作用，药物使用不当，也会诱发耐 药株的产生。HIV疫苗被认为是控制HIV感染的最有潜力的手段，但疫苗开发尚待时日。因此，发展新的HIV治疗技术和方法是摆在人们面前亟待解决的问题。基因治疗是目前生物医学上新发展的一种高科技医疗技术，它能够通过载体将抗HIV基因导入体内并长期表达，获得长期抑制HIV病毒复制的能力，因而，基因治疗为抗HIV感染开辟了新的途径。到目前为止，国外相继已有近百个抗HIV/艾滋病的基因治疗方案进入临床试验(http://www. wiley. co. uk/genmed/ clinical/),获得了一定的疗效，给艾滋病病人带来了新的希望。但真正令人们兴奋的是最近德国研究人员将一名急性髓系白血病合井“艾滋病”患者在接受HIV-I辅助受体CCR5基因纯合突变个体的骨髓干细胞移植治疗之后，即使在高活性抗逆转录病毒治疗停药，三年多的时间里体内再没有发现艾滋病的病毒，这是世界上首例治愈艾滋病感染者的报道；该结果提示了细胞受体CCR5遗传性基因突变能够自然抵抗艾滋病感染，是ー种治疗艾滋病病毒感染者有希望的策略(Gero Hutter et al. Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-CellTransplantation, N Engl J Med 2009; 360:692-8.)。但这一骨髓干细胞移植治疗由于仅1%白人存在CCR5基因纯合突变在加上人类白细胞抗原相匹配的限制，因而，该疗法很难在临床上应用。然而，却给艾滋病基因治疗提供了新的思路。美国加州大学艾滋病研究所的科学家依据上述临床研究中发现，尝试将人类细胞上受体CCR5基因沉寂。他们选用人源化的小鼠为模型，给小鼠体内注入小RNA分子(短链发夹结构的RNA，shRNA)，通过RNAi干扰机制阻断小鼠体内的人体血液干细胞CCR5受体的表达。令人欣喜的是，CCR5受体表达受阻的小鼠对艾滋病表现出稳定的抵抗力。科学家们认为，这ー研究成果证实了使用RNAi技术阻断CCR5受体的治疗方式可能成为治疗HIV的好办法(Shimizu et al. A highlyefficient snort hairpin RNA potently down-regulates CCRd expression in systemiclymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood, 25 February 2010, Vol. 115,No. 8，pp. 1534-1544)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种古老而保守的生物现象,它由21 23个核苷酸的双链RNA通过碱基互补靶向识别并降解mRNA，导致序列特异的基因沉默。与反义RNA和核酶(Ribozymes)技术相比，RNAi设计上的特异性和简单性,干扰的高效性以及不引起免疫反应等特性使其更易应用到抗病毒感染临床治疗上。目前，国外学者已对宿主细胞CD4，CCR5, CXCR4及HIV-I的tat、rev、nef、env和gag等相关基因为靶标进行了抗HIV感染研究，这些研究都表明RNAi是ー种抑制HIV基因表达或降低HIV感染的有力工具。2005年，美国FDA批准了首个RNAi的I/II期临床试验，既是针对HIV tat和rev为靶基因，由慢病毒载体系统介导的抗HIV感染的临床试验(http://www. wiley. co. uk/genmed/clinical/)。目前，虽然以宿主细胞CCR5及HIV-I的tat、rev等相关基因为靶标进行RNAi已有报道，但利用新型慢病毒载体针对多个HIV-I靶标结合进行RNAi仍未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种可以针对多个HIV-I靶标结合进行RNAi的安全的重组慢病毒表达载体系统。为了解决上述问题，目前比较可行的方法是找到ー种新型的携帯了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒载体系统。这主要需要解决两方面的问题，ー是如何进行RNAi，有效的抑制目的基因的表达；另ー个是如何使重组慢病毒载体系统安全，降低插入突变的风险。RNAi是较有前途的抑制目的基因表达的方法，但仍有许多问题需要解决①针对HIV-I变异，如何设计有效的siRNA 因为ー些病毒能产生突变的子代分子，可逃避免疫监视及药物，对抗siRNA的识别，因此必须使所设计的siRNA作用于病毒RNA保守、在不同病毒株间不存在突变的序列，并要设计作用于RNA保守序列的多个siRNA;同时siRNA很少引起免疫反应，siRNA容易与其他siRNA结合产生协同或相加效应，因而多个siRNA同时使用可有效对抗HIV的突变株。②如何将siRNA更有效地转人体内细胞？目前，慢病毒载体是在靶细胞进行siRNA有效转移并稳定表达的最好选择，但仍需解决载体安全性问题。③怎样增强siRNA在体内的稳定性。如在siRNA链中加人某些化学元素如氟等以对抗核酸酶的降解等。④如何将siRNA与抗HIV-I药物有效结合起来或将多个siRNA结合起来将是抗HIV感染的研究热点。因为HIV-I生活周期是ー个多个环节的过程，对其单一环节靶点干预难以获得持续有效的疗效，将多个siRNA结合有可能增加其协同或相加效应。关于载体系统的选择方面，本发明经过了一系列的研究后认为慢病毒是比较理想的工具。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(humanimmunodefficiency virus, HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂祀细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。然而，同其它病毒如反转录病毒一祥，慢病毒的整合是随机的，因而常导致插入突变之风险，该风险巨大阻碍着慢病毒载体系统在基因功能和基因治疗上的广泛地应用。前期我们曾发明了ー种新型慢病毒载体系统即位点特异整合性慢病毒载体系统(ー种位点特异整合性慢病毒载体及制备方法，授权专利号ZL200810037440.9)，大幅降低了一般慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险。该位点特异性整合慢病毒载体系统，由FattbC31UGW质粒、CMV A 8. 9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图5、2和3所示)；FattbC31UGW质粒是将attB位点序列和位点特异整合酶C31基因序列依次连接并且克隆到FUGW载体的PACI酶切点而得；CMV A 8. 9-D64N/D116N质粒是由CMV A 8. 9质粒中的pol基因D64N和D116N突变而得。FUGff, pCMV A 8. 9 (即 CMV A 8. 9 质粒)及 VSVG 来源于美国 Carlos Lois 博士惠赠。本发明的FUGW慢病毒载体来源于文章Lois C，et al. Germline transmissionand tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.Science, 2002,295:868-72。FUGW以除去有害基因后的HIV作为骨架，表达由泛素(Ubiquitin-C, UBC)调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP) ；pCMV A 8. 9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构及整合酶(IN) ； VSVG为包膜质粒。一方面，包装载体 CMV A 8. 9-D64N/D116N 是由 CMV A 8. 9 中 pol 基因(其 NCBI 登陆号AAC54634 )编码的HIV整合酶D64N和D116N双突变而成，使其仅有包装功能而未整合作用。另ー方面，FattbC31UGW质粒是由attB位点序列和位点特异整合酶基因C31 (即 phi C31,其NCBI登陆号AX816372)序列克隆到FUGW载体的pacl酶切点而得到，赋予了该载体位点特异整合的功能。本发明利用了上述位点特异整合性慢病毒载体，通过提供一系列产生诱导RNAi途径，使艾滋病相关基因得以高度、特异性抑制的新型重组慢病毒载体构建方法，生产出可供给艾滋病基因治疗研究和临床应用的重组慢病毒。
本发明提供了一种携带了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体，重组慢病毒载体FattbC3IUGWshRNA表达载体是在FattbC31UGW载体中加入对重组慢病毒外壳内包囊携帯的特定RNAi核苷酸片段进行转录表达调控元件构成。所述的重对重组慢病毒外壳内包囊携带的特定RNAi核苷酸片段进行转录表达调控元件结构是在U6 snRNA或HiRNA启动子控制下的可形成双个shRNA产物的重组慢病毒载体。本发明选用的是针对CCR5和Tat/Rev的RNAi核苷酸片段。分别设计了三组RNAi核苷酸片段，经过试验，表明第2组的消减效率比较明显。所述的针对CCR5 的 RNAi 核苷酸片段是 sense siRNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-1oop-UUGUCCGAC-antisense siRNA_GGUGUAAACUGAGCUUGCUC_UU3。所述的针对Tat/Rev 的 RNAi 核苷酸片段是 Tat/Rev: sense siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-antisense siRNA- GCGGAGACAGCGACGC -UU3。本发明提供了一种携带了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒载体系统，该重组慢病毒载体系统包括重组慢病毒载体FattbC3IUGWshRNA表达载体、重组慢病毒包装结构质粒 CMV8. 9-. D64N/D116N 和包膜质粒 VSVG。
上述的重组慢病毒表达载体的制备方法是分别设计合成特定RNAi核苷酸片段对应的互补DNA寡核苷酸，退火形成双链DNA寡核苷酸，应用Gateway技术克隆入线性入门载体；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入门载体的U6 RNAi盒通过LR重组反应重组入FattbC3 IUGff目的载体，形成FattbC3 IUGWshRNA表达载体。
所述的特定RNAi核苷酸片段对应的互补DNA寡核苷酸是针对编码CCR5基因及TAT/REV shRNA的ー对特异互补DNA寡核苷酸。具体制备过程如下
FattbC3 IUGff shRNA质粒构建运用Dharmacon的SMART筛选计算法则分别设计了三组RNAi核苷酸片段，经过试验，表明第2组的消减效率比较明显。靶向作用于CCR5的siRNA, siRNA由20_mers组成，包括正义链和反义链，并且在两条链的3’ 末端有尿嘧啶。正义链 si RNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-1 oop-UUGUCCGAC-反义链siRNA-GGUGUAAACUGAGCUUGCUC-UU3。靶向作用于 TAT/REV 的 siRNA 由 21_mers 组成正义链siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-反义链 siRNA_GCGGAGACAGCGACGC_UU3.构建在U6 snRNA启动子或HiRNA启动子分别控制下针对CCR5及TAT/REV靶基因序列的可形成 shRNA 产物的 FattbC3 IUGWshRNA 质粒。pENTRTM/U6 来源于 Invitrogen 公司，慢病毒载体源于前期我们发明了ー种新型慢病毒载体系统即位点特异整合性慢
病毒载体系统FattbC31UGW (—种位点特异整合性慢病毒载体及制备方法，授权专利号ZL200810037440. 9).分别设计合成编码CCR5基因及TAT/REV shRNA的一对特异互补DNA寡核苷酸，退火形成双链DNA寡核苷酸，应用Gateway技术克隆入线性入门载体；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入门载体的U6 RNAi盒通过LR重组反应重组入FattbC3 IUGff目的载体，形成FattbC3 IUGWshRNA表达载体。FattbC3IUGffshRNA 病毒制备将 FattbC3IUGWshRNA 质粒、包膜质粒 VSVG 和包装结构质粒CMV A8. 9-. D64N/D116N.质粒混合，混合范围为I. 5-10 :1. 1-4. 8- 1 ;即形成携带了多个特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒系统。CCR5表达水平检测=HIV-I感染所必需的受体⑶4和辅助受体CCR5/CXCR4细胞株TZM-bl源于美国AIDS參考和试剂部门。细胞培养于添加了 10%的胎牛血清，0.2 mg/ml G418，0. I mg/ml的潮霉素B，I. 0 ug/ml的嘌呤霉素的 Dulbecco’ s modified Eagle’s medium (DMEM)。转染前 24h 细胞以 5105 cells/well的密度种于2. 5 cm的孔内。FattbC3IUGWshRNA病毒MOI=I感染细胞株TZM-bl。混合物加入细胞后调整体积到700微升，之后细胞与转染混合物在37° C孵育6h后加油预热的含有10%胎牛血清的DMEM。隔两天再转染一次。转染72h后，用流式细胞仪和QRT-PCR分别检测证实CCR5的下调表达和转录水平。结果显示，与对照相比，CCR5/TAT-REV RNAi具有强的CCR5敲除能力
细胞下调表达CCR5之后的抗病毒能力检测TZM-bl因为表达辅助受体CCR5而对R5-tropic HIV-I BaL-I具有易感性。为了验证细胞下调表达CCR5之后的抗病毒能力，细胞在转染或转导siRNA之后用病毒感染细胞。转染/转导72h之后，去除培养用MOI为0. 01的病毒感染细胞同时凝聚胺的浓度为4ug/ml。病毒和细胞37° C作用2h之后用PBS洗两次，然后加入2ml DMEM完全培养基。转基因的巨噬细胞也进行同样的操作。病毒感染两天后收集细胞上清，用ELISA检测p24抗原。结果显示，与对照相比，siRNA转染后细胞病毒抗原水平減少了 9倍.
本发明的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。本发明的制备方法中，采用混合质量比可以是5 :4 :3或者4 :3 :2。质粒FattbC3 IUGffshRNA, pCMV A 8. 9- D64N/D116N,及VSVG三部分共转染时，三者质量比可以为 2 :1. 5 :1 ;如三质粒共转染 IOOCM 培养皿，FattbC3IUGffshRNA, pCMV. A 8. 9-D64/Dl 16N及VSVG所需量可以是lOug，7. 5ug和5ug。共转染方法可以通过脂质体，磷酸钙，PEI
坐寸o本发明中，所适用宿主包括各种真核生物。本发明中，携帯了多个特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒系统应用的宿主细胞可以是静止细胞或者分裂细胞。其中，静止细胞可以是神经元细胞、胶质细胞或者成体干细胞和胚胎干细胞。本发明中，静止期细胞也可以是原代细胞。本发明的携帯了多个特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒，不仅在哺乳动物细胞中证实了该载体系统具有感染神经元细胞、胶质细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和各种干细胞等在内的多种非分裂或静止期细胞能力，而且，病毒载体携带的针对艾滋病特定 RNAi核苷酸片段在C31整合酶介导下可稳定整合在基因组假attP位点上，可有效稳定降解细胞CCR5受体表达，具有抑制HIV感染作用。本发明的重组慢病毒载体系统可以用于抑制细胞中CCR5的表达。
本发明提供了一种携带多靶点RNAi的慢病毒制备系统，由FattbC3IUGWshRNA质粒、CMV A 8. 9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、2和3所示)。一方面，包装载体CMV A 8. 9-D64N/D116N是由CMV A 8. 9中pol基因编码HIV整合酶D64N和D116N双突变而成，使其仅有包装功能而未整合作用。另ー方面，FattbC3IUGWshRNA质粒是由attB位点序列和位点特异整合酶基因phi C31 (其NCBI登陆号AX816372)序列克隆到FUGW载体的PACI酶切点而得到，赋予了该载体位点特异整合的功能。本发明的慢病毒制备系统针对多个HIV-I靶标结合进行RNAi，可以使特定的目标基因表达量降低甚至不表达。经测试，与对照相比，siRNA转染后细胞病毒抗原水平減少了 9倍。因此，本发明可以应用于艾滋病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。
图I. FattbC3IUGWshRNA 载体结构示意图。图2. VSVG载体结构示意图。图3. pCMV. A 8. 9-D64N/D116N 结构示意图。图4 FattbC3IUGffshRNA感染细胞CCR5表达水平检测结果示意图。图5. FattbC31UGW载体结构示意图。
具体实施例方式实施例I携帯了多个特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒制备方法 PENTRTM/U6来源于Invitrogen公司，慢病毒载体源于前期我们发明了ー种新型慢病
毒载体系统即位点特异整合性慢病毒载体系统FattbC31UGW (—种位点特异整合性慢病毒载体及制备方法，授权专利号ZL200810037440. 9).分别设计合成编码CCR5基因及TAT/REV shRNA的ー对特异互补DNA寡核苷酸，退火形成双链DNA寡核苷酸，应用Gateway技术克隆入线性入门载体；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入门载体的U6 RNAi盒通过LR重组反应重组入FattbC31UGW目的载体，形成FattbC3 IUGWshRNA表达载体。
实施例2被质粒CMV A8.9-D64N/D64N包装的位点特异整合性慢病毒制备将FattbC3IUGWshRNA载体，与包装结构质粒CMV A 8. 9-D64N/D64N和包膜质粒(VSVG)以2 I I质量比例混合。利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上进行转染，24^48 h后在荧光显微镜下观察，出现大量荧光后收集病毒上清，收集的病毒上清浓缩后分装备用或立即使用.重组慢病毒活性测定时，将浓缩后的病毒贮存液作不同比例稀释，感染细胞48 h后在荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。FUGW载体作为对照。结果显示，FattbC3IUGWshRNA 慢病毒滴度为 6. 8*10づ TU/ml。
实施例3 CCR5表达水平检测
HIV-I感染所必需的受体⑶4和辅助受体CCR5/CXCR4细胞株TZM-bl源于美国AIDS參考和试剂部门获得。细胞培养液添加了 10%的胎牛血清，0. 2 mg/ml G418，0. I mg/ml的潮霉素 B, I. 0 ug/ml 的嘌呤霉素的 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)。转染前24h 细胞以 5 105 cells/well 的密度种于 2. 5 cm 的孔内。FattbC3IUGWshRNA 病毒 MOI=I感染细胞株TZM-bl，之后细胞与转染混合物在37° C孵育6h后加油预热的含有10%胎牛血清的DMEM。隔两天再转染一次。转染72h后，用流式细胞仪和QRT-PCR分别检测证实CCR5的表达和转录水平。结果表明，CCR5的表达确实大幅下调，详见图4。
实施例4位点特异整合性慢病毒系统感染细胞分析
细胞下调表达CCR5之后的抗病毒能力检测TZM-bl因为表达辅助受体CCR5而对R5-tropic HIV-I BaL-I具有易感性。为了验证细胞下调表达CCR5之后的抗病毒能力，细胞在转染或转导siRNA之后用病毒感染细胞。转染/转导72h之后，去除培养用MOI为0. 01的病毒感染细胞同时凝聚胺的浓度为4ug/ml。病毒和细胞37° C作用2h之后用PBS洗两次，然后加入2ml DMEM完全培养基。转基因的巨噬细胞也进行同样的操作。病毒感染两天后收集细胞上清，用ELISA检测p24抗原。数据通过三次重复实验得到。结果显示，与对照相比，siRNA转染后细胞病毒抗原水平減少了 9倍。
权利要求
1.一种携带了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体，其特征在于，重组慢病毒载体FattbC3 IUGWshRNA表达载体是在FattbC31UGW载体中加入对重组慢病毒外壳内包囊携带的特定RNAi核苷酸片段进行转录表达调控元件构成。
2.如权利要求I所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，重对重组慢病毒外壳内包囊携带的特定RNAi核苷酸片段进行转录表达调控元件结构是在U6 snRNA或HiRNA启动子控制下的可形成双个shRNA产物的重组慢病毒载体。
3.如权利要求I所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，重组慢病毒载体所携带特定RNAi核苷酸片段是针对CCR5的RNAi核苷酸片段。
4.如权利要求3所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，针对CCR5的RNAi核苷酸片段是 sense siRNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-loop-UUGUCCGAC-antisenses i RNA-G ⑶⑶ AAACUGAGCUUGCUC-UU3。
5.如权利要求I所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，重组慢病毒载体所携带特定RNAi核苷酸片段是针对Tat/Rev的RNAi核苷酸片段。
6.如权利要求5所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，针对Tat/Rev的RNAi核苷酸片段是 Tat/Rev: sense siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-antisense siRNA- GCGGAGACAGCGACGC -UU3。
7.一种携带了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒载体系统，其特征在于，该重组慢病毒载体系统包括重组慢病毒载体FattbC3IUGWshRNA表达载体、重组慢病毒包装结构质粒CMV8. 9-. D64N/D116N 和包膜质粒 VSVG。
8.权利要求I所述的重组慢病毒表达载体的制备方法，其特征在于，分别设计合成特定RNAi核苷酸片段对应的互补DNA寡核苷酸，退火形成双链DNA寡核苷酸，应用Gateway技术克隆入线性入门载体；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入门载体的U6 RNAi盒通过LR重组反应重组入FattbC31UGW目的载体，形成FattbC3 IUGWshRNA表达载体。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的特定RNAi核苷酸片段对应的互补DNA寡核苷酸是针对编码CCR5基因及TAT/REV shRNA的一对特异互补DNA寡核苷酸。
10.权利要求I所述的重组慢病毒载体系统在抑制细胞中CCR5表达的应用。
全文摘要
本发明属于医药及基因工程领域，涉及一种携带与HIV病毒生活周期相关基因的多靶点RNAi的慢病毒及其制备方法和应用。本发明提供了一种携带了特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体FattbC31UGWshRNA表达载体，是在FattbC31UGW载体中加入对重组慢病毒外壳内包囊携带的特定RNAi核苷酸片段进行转录表达调控元件构成。本发明还提供了在此基础上构建的重组慢病毒载体系统及其制备方法和应用。本发明的慢病毒制备系统针对多个HIV-1靶标结合进行RNAi，可以使特定的目标基因表达量降低甚至不表达。因此，本发明可以应用于艾滋病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。
文档编号C12N15/113GK102851317SQ20111018278
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者朱焕章, 周鑫, 曲喜英, 王鹏飞 申请人:复旦大学