专利名称：猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
氟烷基因(Hal)又称兰尼定受体基因(RYRl)或钙离子释放通道基因，是导致猪应激综合征(Porcine stress syndrome，PSS)的主效基因。该基因定位在猪染色体6pll_q21上，它是由RYRl中C1843突变为T1843，使受体蛋白第615位精氨酸变成了半胱氨酸，引起结构与功能的改变。当应激因子作用时，Ca2+大量非正常释放，引起肌肉持续收缩，从而产生PSS，其表现为呼吸急促、心跳加快、肌肉僵直、后肢呈现痉挛性收缩，甚至死亡，屠宰后产^PSE(Pale, soft, exudative)肉或 DFD(Dark，firm, dry)肉，给养猪业造成巨大经济损失。据研究，氟烷基因阳性纯合子猪(rm)，即使采用最优处理条件，其产生PSE肉的比率也高达80%以上。杂合子猪(Nn)产生各种劣质肉的比率达到36.8%，显著高于阴性纯合子(NN) 22. 5%的水平。氟烷基因作为影响肉质的主效基因已经广泛用于猪的标记辅助选择(Marker-assisted selection)，据欧盟2008年统计数据显示，在欧盟25国，每年有120 480万只猪接受氟烷基因的筛选，在中国虽然没有详细的统计调查，但是氟烷基因标记辅助选择也广泛应用于各大商业猪场。随着氟烷基因标记辅助选择的普及，迫切需要一种高效率，高通量且高准确率的技术来解决如此庞大规模的基因分型。高分辨率熔解(High Resolution Melt,HRM)是一种最新的遗传学分析方法，主要是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。主要是依赖于精确的检测DNA双链熔解荧光曲线，如同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测，HRM源于熔解曲线，原理与普通熔解曲线分析是一致的，二者不同之处主要表现在升温速率和所用的染料。HRM用的是饱和染料(dye EvaGreen)，高浓度的染料饱和了 DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法(检测位点多，样本少)的高通量方法。HRM检测SNP是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。HRM的特点和优势是无需序列特异性探针；操作简便、快速，使用成本低；可对未知位点进行筛查；较高通量；高灵敏度；特异性、重复性好；适用范围广。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。对于猪氟烷基因C1843T突变进行基因分型的传统方法有聚合酶链式反应结合限制性内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP)，聚合酶链式反应结合单链构象多态性法(PCR-SSCP)，其中PCR-RFLP法最为常用，该方法通常按照以下步骤进行步骤一、对待检样本进行预处理，提取基因组DNA ；步骤二、特异性引物的制备设计和合成上、下游引物一对，用于PCR扩增特定片断(片段必须包括氟烷基因的1843位点)；步骤三、PCR扩增目的DNA片段；步骤四、根据扩增片段上的限制性酶切位点，用特异的限制性内切酶对扩增片段进行酶切；步骤五、对酶切产物进行凝胶电泳检测，分析待测样本的基因型。PCR-RFLP法由于步骤繁琐且酶切反应后需要进行凝胶电泳检测，使其耗时长、通量小且准确性受主观因素影响，一直很难适用于大规模的氟烷基因筛选。仅对单个样本进行检测，传统的PCR-RFLP法需要14 16小时，如果对于大批量的样本进行扫描分型，工作量和耗时都是无法想象的。
发明内容
本发明旨在克服上述传统方法的技术缺陷，基于HRM技术，提供一种猪氟烷基因快速分型试剂盒及其检测方法。该方法通量大，特异性强，重复性好，准确率高且鉴定简便快捷。本发明中的这种猪氟烷基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液禾口 Nuclease-free dH20o其中引物预混液混合液中两条引物浓度均为10 μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT下游引物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATGHRM PCR预混液成分及体积比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。本发明提供的一种猪氟烷基因快速分型检测方法，包括以下步骤步骤1 将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA样本从_20°C冰箱中取出并在冰上融化；步骤2 配制反应预混液；预混液体积根据待检样本的数量而定；步骤3 将反应预混液混合均勻，并根据所需的体积分装到PCR管中；步骤4 向分装好反应预混液的PCR中添加样本DNA模板，并轻轻混勻；步骤5 根据优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序；步骤6 将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；步骤7:数据分析本发明利用高分辨率溶解曲线技术，结合优化设计的引物和反应程序，能够准确地对待测样本进行氟烷基因分型，通过详细的测试，本方法的准确率为98. 67%，高于传统的 PCR-RFLP 法(97. 33% ).该发明高效迅速，操作步骤简单，只需要一个PCR反应和半个小时的溶解曲线分析即可完成，大大缩短了氟烷基因分型所需要的时间。对于单个样本，传统的PCR-RFLP法需要12-16小时，而本方法将所需时长缩短到2小时以内。本发明方法价格与传统PCR-RFLP法相当，所需费用不到2. 5元/样品，而传统的方法也需要约2.1元/样品。
本发明的方法完全闭管操作，可以避免繁琐的开管操作带来的外源污染，大大降低了假阳性结果的出现。本发明方法通量大，一次可以同时对96或者384个样本进行基因分型检测，适用于猪氟烷基因的大规模筛查，特别适用于大型商业猪场。
图1为标准化后的溶解曲线图；图2为用本发明中特异性引物对氟烷基因三种基因型进行扩增后的溶解峰3为20个样品的氟烷基因分型结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1猪氟烷基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和Nuclease-free dH20o其中引物预混液混合液中两条引物浓度均为10 μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT；下游引物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATG；HRM PCR预混液成分及体积比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。实施例2用上述试剂盒对猪氟烷基因快速分型步骤如下步骤1 将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA样本(需要自行抽提，本试剂盒不提供抽提试剂和方法)从-20°C冰箱中取出并在冰上融化；步骤2 按照表1配制反应预混液。预混液体积根据待检样本的数量而定，但是考虑配制分装过程中无法避免的损耗，建议在理论体积基础上多配置10%的反应预混液；表1反应体系
权利要求
1.一种猪氟烷基因快速分型试剂盒，其特征在于，包括引物预混液、HRM PCR预混液和Nuelease-free dH20 ；其中所述引物预混液混合液中两条引物浓度均为 ο μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT下游弓丨物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATG所述HRM PCR预混液成分及体积比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) IOXPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。
2.一种猪氟烷基因快速分型检测方法，包括以下步骤步骤1 将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA样本从-20°C冰箱中取出并在冰上融化；步骤2 配制反应预混液；预混液体积根据待检样本的数量而定；步骤3 将反应预混液混合均勻，并根据所需的体积分装到PCR管中；步骤4 向分装好反应预混液的PCR中添加样本DNA模板，并轻轻混勻；步骤5 根据优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序；步骤6 将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；步骤7:数据分析。
全文摘要
本发明公开了一种猪氟烷基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和Nuclease-free dH2O。本发明还提供一种猪氟烷基因快速分型检测方法；本发明方法通量大，一次可以同时对96或者384个样本进行基因分型检测，适用于猪氟烷基因的大规模筛查，特别适用于大型商业猪场。
文档编号C12Q1/68GK102559865SQ201110313908
公开日2012年7月11日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者李学伟, 李明洲, 马继登 申请人:四川农业大学